胰岛素、胰高血糖素对体外培养脂肪细胞胰高血糖素受体mRNA丰度的影响

为阐明胰岛素、胰高血糖素在奶牛脂肪代谢中的调控作用,应用RT-PCR法观察了胰岛素、胰高血糖素对体外培养脂肪细胞胰高血糖素受体(GLNR)mRNA丰度的影响。结果发现,随着培养液中胰岛素质量浓度的升高,GLNR mRNA表达逐渐增加(P<0.05);而随着培养液中胰高血糖素浓度的升高,GLNR mRNA表达逐渐降低(P<0.01)。本研究结果表明,胰岛素、胰高血糖素直接调控奶牛脂肪细胞胰高血糖素受体mRNA的表达。     

代谢产物对体外培养新生犊牛肝细胞胰高血糖素受体mRNA丰度的影响

为阐明代谢产物非酯化脂肪酸（NEFA）、β-羟丁酸（BHBA）和葡萄糖（GLU）在乳牛肝糖代谢、脂代谢中的调控作用，应用实时荧光定量PCR法观察了NEFA、BHBA和GLU对体外培养新生犊牛肝细胞胰高血糖素受体（GLNR）mRNA丰度的影响。结果，随着培养液中NEFA、BHBA和GLU浓度的升高，GLNRmRNA的表达量逐渐增加（P〈0．01）。表明，代谢产物NEFA、BHBA和GLU直接调控乳牛肝胰高血糖素受体mRNA的表达。     

神经内分泌因子对体外培养新生犊牛肝细胞胰高血糖素受体mRNA丰度的影响

为阐明神经内分泌因子胰岛素(In)、胰高血糖素(GLN)、瘦素(LEP)在奶牛肝糖代谢、脂代谢中的调控作用，应用实时荧光定量PCR ( real time fluorescent quantitative PCR)法观察了神经内分泌因子对体外培养新生犊牛肝细胞胰高血糖素受体（glucagon receptor，GLNR）mRNA丰度的影响。结果显示：随着培养液中In的升高，GLNR mRNA表达逐渐增加（P<0.01）；随着培养液中GLN浓度的升高，GLNR mRNA表达逐渐降低（P<0.01）；而随着培养液中LEP浓度的升高，GLNR mRNA的表达呈现先升高后降低的趋势（P<0.01）。表明：神经内分泌因子In、GLN、LEP直接调控奶牛肝脏GLNR mRNA的表达。     

瘦素对体外培养新生犊牛脂肪细胞胰高血糖素受体mRNA丰度的影响

为阐明瘦素在奶牛脂肪代谢中的调控作用,应用荧光定量RT-PCR法观察了瘦素对体外单层原代培养脂肪细胞胰高血糖素受体(glucagon receptor,GLNR)mRNA丰度的影响。结果表明:随着培养液中瘦素浓度的升高,GLNR mRNA的丰度呈现先升高后降低的趋势(P<0.01),瘦素对GLNR mRNA的表达具有双重作用;研究结果表明,瘦素直接调控新生犊牛脂肪细胞GLNR mRNA的表达。     

胰岛素、胰高血糖素对体外培养肝细胞DGAT2mRNA的影响

为阐明神经内分泌因子胰岛素、胰高血糖素在奶牛脂肪代谢过程中的调控作用,用荧光定量PCR方法检测胰岛素、胰高血糖素对肝细胞二酰基甘油酰基转移酶（DGAT2）mRNA丰度的影响。结果表明低浓度的胰岛素能促进脂肝细胞内DGAT2mRNA的表达;胰高血糖素抑制脂肝细胞内DGAT2mRNA表达。由此证明：胰岛素和胰高血糖素能直接调控肝细胞中的DGAT2基因mRNA的表达。     

胰岛素对体外培养牛肝细胞胰岛素受体mRNA水平的影响

在新生牛单层肝细胞培养液中添加胰岛素,其浓度分别为0μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、50μmol/L和100μmol/L,处理12h,应用半定量RT-PCR方法研究胰岛素对体外培养新生牛单层肝细胞胰岛素受体(IR)mRNA水平的影响.结果表明随胰岛素浓度的升高,肝细胞IRmRNA丰度呈下降趋势,指示肝细胞内IRrnRNA丰度下降以调节胰岛素浓度.     

荧光定量PCR检测新生犊牛胰高血糖素受体mRNA的组织分布

采用荧光定量PCR的方法,检测新生犊牛中枢和外周组织中胰高血糖受体(glucagon receptor,LNR)mRNA的基因表达.研究结果表明,NR基因在大脑皮质、小脑皮质、下丘脑、垂体、主动脉、颈静脉、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾皮质、胰脏、半腱肌、皮下脂肪、瘤胃、瓣胃、网胃、皱胃、十二指肠、结肠、回肠、盲肠、直肠都有表达.垂体、下丘脑、肝脏、主动脉、皮下脂肪、小脑皮质、大脑皮质、肾皮质、肺脏中GLNR表达量高于其他组织.GLNR基因在组织中广泛分布说明了其功能的重要性.     

胰岛素胰高血糖素对体外培养牛脂肪细胞HSL mRNA和ADPN mRNA丰度的影响

动物体内脂肪的沉积过程是脂肪细胞不断分化和细胞内脂肪不断合成、蓄积的过程.脂肪细胞在分化过程中除形态学发乍变化外,细胞内也发生一系列复杂的生物化学变化,因此,脂肪细胞的分化在动物体脂肪沉积的调控过程中起着重要作用[1].     

胰岛素、胰高血糖素对体外单层培养的肝细胞胰岛素样生长因子-Ⅰ mRNA丰度的影响

以持家基因β肌动蛋白(β-actin)作为内参照,通过竞争PCR法检测不同浓度的胰岛素和胰高血糖素对犊牛肝细胞中胰岛素样生长因子-Ⅰ mRNA丰度的影响.结果表明,胰岛素和胰高血糖素都能直接调控胰岛素样生长因子-Ⅰ mRNA的表达,胰岛素促进胰岛素样生长因子-Ⅰ mRNA的表达,而胰高血糖素抑制胰岛素样生长因子-ⅠmRNA的表达,存在量变关系.     

神经内分泌因子、代谢产物对体外培养新生犊牛肝细胞胰高血糖素受体mRNA丰度的影响

为阐明神经内分泌因子胰岛素（In）、胰高血糖素（GLN）、瘦素（LEP）和代谢产物非酯化脂肪酸（NEFA）、β-羟丁酸（BHBA）、葡萄糖（GLU）在奶牛肝糖代谢、脂代谢中的调控作用，应用荧光定量PCR（fluorescent quantitative PCR）法观察了神经内分泌因子、代谢产物对体外培养新生犊牛肝细胞胰高血糖素受体（glucagon receptor，GLNR）mRNA丰度的影响。结果显示：随着培养液中In、NEFA、BHBA和GLU的升高，GI。NRmRNA表达逐渐增加（P〈0．01）；随着培养液中GLN浓度的升高，GLNRmRNA表达逐渐降低（P〈0．01）；而随着培养液中瘦素浓度的升高，GLNRmRNA的表达呈先升高后降低的趋势（P〈0．01）。表明：神经内分泌因子In、GLN、LEP和代谢产物NEFA、BHBA、GLU直接调控新生犊牛肝细胞GLNRIT／RNA的表达。     

瘦蛋白(Leptin)对体外培养新生牛脂肪细胞Leptin、HSL基因表达的影响

取单层生长良好的脂肪细胞,采用单因素重复试验,分别添加0、2.5、5、10、50、100μg/L的外源牛重组瘦蛋白(Leptin),培养12h后提取总RNA,每个处理3个重复(孔),应用半定量PCR方法检测外源Leptin对脂肪细胞Leptin mRNA和HSL mRNA水平的影响.结果表明,Leptin对脂肪细胞内Leptin mRNA表达具有抑制作用,但一定浓度的Leptin能提高脂肪细胞内HSL mRNA水平,其中以5μg/L Leptin的作用最为明显;当Leptin的质量浓度超过5μg/L,HSL mRNA表达水平呈下降趋势.     

胰岛素、胰高血糖素对体外培养犊牛肝细胞CPT-Ⅰ和CPT-ⅡmRNA表达的影响

体外原代培养犊牛肝细胞,添加不同浓度的胰岛素（insulin,INS）（0、1、10、100、1 000nmol/L）和胰高血糖素（glucagon,GLN）（0、1、10、100、1 000nmol/L）,每个处理做3个重复,分别培养1h后,提取总RNA。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）的方法,检测肉碱棕榈酰转移酶Ⅰ（carnitine palmitoyl transferase,CPT-Ⅰ）和肉碱棕榈酸转移酶Ⅱ（carnitine palmitoyl transferase,CPT-Ⅱ）mRNA表达的变化。结果显示,随着培养液中INS含量的升高,肝细胞中CPT-ⅠmRNA和CPT-ⅡmRNA的表达量逐渐降低,呈现一定的剂量依赖性。随着培养液中GLN含量的升高,肝细胞中CPT-ⅠmRNA和CPT-ⅡmRNA的表达量均升高,呈现一定的剂量依赖性,且当GLN的添加浓度高于100nmol/L时,CPT-ⅠmRNA和CPT-ⅡmRNA的表达量显著升高（P〈0.01）。结果表明,INS可在一定程度上抑制脂氧化关键酶的表达,GLN可显著促进脂氧化关键酶的表达。     

胰岛素、胰高血糖素和神经肽Y对体外培养犊牛肝细胞硬脂酰CoA去饱和酶mRNA表达的影响

在应用实时荧光定量PCR法观察胰岛素(In)、胰高血糖素(GLN)、神经肽(NPY)对体外培养新生犊牛肝细胞硬脂酰CoA去饱和酶(Stearoyl CoA desaturase,SCD) mRNA丰度的影响.结果显示,随着培养液中In含量的升高,肝细胞中的SCD mRNA表达逐渐升高(P＜0.05),呈现明显的剂量依赖促进效应;随着培养液中GLN含量的升高,肝细胞SCD mRNA丰度表达逐渐减弱,高血糖素处理组SCD mRNA表达均极显著低于对照组(P＜0.01);而随着NPY质量浓度在0～1 000 ng/L之间逐渐上升,肝细胞SCDmRNA的表达水平不断升高,各处理组显著高于对照组,除50 ng/L处理组和500 ng/L处理组之间差异不显著外,其他处理组之间差异显著(P＜0.05).结果表明,胰岛素和神经肽Y促进SCD mRNA表达,胰高血糖素抑制SCD mRNA表达.     

非酯化脂肪酸对体外培养犊牛原代肝细胞中炎性因子表达及其活性的影响

在建立犊牛原代肝细胞体外培养模型的基础上，通过培养液中添加不同浓度的非酯化脂肪酸（Nonesterifiedfatty acids，NEFAs），运用实时荧光定量PCR和ELISA方法，测定NEFAs对肝细胞中炎性因子TNFα、IL-6和IL-1β的mRNA表达及其活性的影响。结果显示，NEFAs作用肝细胞9h后，与对照组相比，高浓度NEFAs（1．8mmol／L）组肝细胞中TNFα、IL-1β的mRNA表达水平显著增加（P〈0．05），IL-6的mRNA表达水平在2．4retool／L时极显著增加（P〈0．01），低浓度NEFAs（0．6、1．2mmol／L）组肝细胞中TNFα、IL-1β和IL-6的mRNA表达水平无显著差异（P〉0．05）；并且TNFα、IL-1G的活性在NEFAs浓度达到1．8、2．4mmol／L显著高于对照组（P〈0．01），且呈剂量依赖性作用，IL-6的活性在在NEFAs浓度达到1．8mmol／L显著高于对照组（P〈0．01），在2．4mmol／L也高于对照组，但差异不显著。结果表明，高浓度NEFAs在-定程度上能引起或加剧奶牛肝细胞炎性反应，可能是导致产后奶牛肝功能炎性损伤主要因素。     

丙酸钠和丙酮酸钠对体外培养牛肝细胞内丙酮酸羟化酶基因mRNA水平的影响

在成功构建牛肝细胞培养模型和PC基因DNA竞争模板的基础上，采用竞争RT—PCR方法检测了丙酸钠和丙酮酸钠对体外培养新生牛单层肝细胞PC基因mRNA丰度的影响。结果，随着丙酸钠浓度的升高，PC基因mRNA水平呈上升趋势，PC基因mRNA对丙酸钠的耐受范围较广；随着丙酮酸钠浓度的升高PC基因mRNA水平呈先上升后下降的趋势。结果表明，肝细胞内PC基因mRNA的表达水平受丙酮酸钠浓度的调控，在一定范围内丙酮酸钠对PC基因mRNA的转录具有促进作用，而浓度过高时则起抑制作用。     

生糖底物和神经内分泌因子对新生犊牛肝细胞PEPCK-C mRNA表达水平的影响

在原代单层培养的新生犊牛肝细胞培养液中分别加入不同浓度丙酸钠、丙酮酸钠、胰岛素、胰高血糖素和瘦蛋白，培养12h后，应用半定量RT-PCR方法检测体外培养的肝细胞PEPCK—C mRNA的丰度。结果显示，随着丙酸钠、丙酮酸钠浓度的升高，肝细胞PEPCK-C mRNA的丰度均先升高后下降（P〈0．01）；随胰岛素、胰高血糖素和瘦蛋白浓度的升高，肝细胞PEPCK-C mRNA的丰度分别剂量依赖性地降低、升高（P〈0．01）和无显著变化。表明，丙酸钠、丙酮酸钠能通过上调体外培养的新生犊牛肝细胞PEPCK—C mRNA的表达而促进肝糖异生代谢，但上调作用是有限的；胰岛素能通过下调体外培养的新生犊牛肝细胞PEPCK—C mRNA的表达而抑制肝糖异生代谢，且下调作用呈剂量依赖性；胰高血糖素与胰岛素作用刚好相反；瘦蛋白未起直接的调节作用。     

镉对体外培养大鼠肝细胞自噬的影响

选用体外培养原代大鼠肝细胞为模型,醋酸镉处理之后,用Westernblot和免疫荧光法检测了自噬标记分子LC3的表达水平,在此基础上,利用自噬激活剂（雷帕霉素）诱导自噬水平的升高,用MTT法分析了镉对细胞存活率的影响。结果显示,原代大鼠肝细胞在体外培养过程中自噬水平具有缓慢上升的趋势,而镉处理延缓了这种趋势,降低了自噬的水平和细胞存活率;利用激活剂增强自噬后不能减弱镉的损伤,表明镉有可能通过抑制自噬的保护作用,造成对肝细胞的损伤。     

镉对体外培养大鼠肝细胞DNA甲基化的影响

选用体外培养原代大鼠肝细胞为模型,用醋酸镉进行处理,用免疫荧光法检测了基因组DNA甲基化水平,用偏重亚硫酸氢盐测序法检测了MT、p53和Line1基因的DNA甲基化水平,用qRT-PCR检测了DNMTs基因的mRNA水平。结果显示,原代大鼠肝细胞在体外培养过程中基因组DNA甲基化水平具有缓慢下降的趋势,镉处理加速了这种下降的趋势;但p53、MT和Line1基因的DNA甲基化均未受镉的影响;维持DNA甲基化稳定的DNMTs表达水平受镉的影响呈现下降的趋势。表明镉对肝细胞的损害作用可能是通过降低DNMTs的表达水平,进而破坏基因组DNA甲基化的稳定来完成的;而镉对MT表达水平的影响似乎并非通过DNA甲基化途径来完成,因为在镉处理之前MT的DNA甲基化就已经处在较低的水平。