拮抗青枯劳尔氏菌的荧光假单胞菌SN15-2分离鉴定及其生防能力分析

为了筛选出对番茄青枯病具有较好防效的生防菌,采用皿内测定法从上海地区的番茄青枯病自然衰退土壤中,分离到一株对番茄青枯病有很强抑制作用的菌株SN15-2,并进行了分子鉴定和对荧光假单胞菌SN15-2产抗生素能力和定殖能力测定。结果表明,菌株SN15-2为荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)。其菌株能产生2,4-二乙酰基间苯三酚(2,4-DAPG)、硝吡咯菌素(PRN)、藤黄绿脓菌素(PLT)。同时,可以产生HCN、噬铁素,能够形成生物膜。SN15-2在施入番茄根际后的前20 d定殖数量减少,20 d后基本稳定,60 d时,在干土中的定殖数量可达3.67×105cfu/g。盆栽防效分析表明,荧光假单胞菌SN15-2对番茄青枯病防效达到46.58%。     

荧光假单胞菌CZ菌株定殖及抗病毒活性研究

荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens CZ能分泌包括碱性磷酸酶在内的抗病毒蛋白抑制烟草花叶病毒Tobacco mosaic virus(TMV)侵染?本文利用抗生素利福平逐级诱导获得抗药性标记菌株CZ-rif, 生测试验显示:野生型和抗药型菌株的发酵上清和粗蛋白液对TMV的体外钝化效果均大于90%, 无显著差异?灭菌和非灭菌的根际土拌CZ-rif菌液后盆栽烟苗, 取根际土在含抗生素的平板上检测定殖菌量, 结果显示, CZ-rif能够在烟株根际土壤中有效定殖, 第31天在灭菌土中的定殖菌量为4.3×104 cfu/g, 显著大于在非灭菌土中的定殖菌量6×103 cfu/g, 在叶面上的定殖菌量显著低于根际土壤?叶面喷施CZ-rif菌液后24 h接种病毒, 对TMV-GFP的预防效果为45.85%?田间试验中喷淋菌株发酵稀释液, 对烟草花叶病毒病的防效为42.02%?此外, 水培试验显示生防菌发酵液对烟草幼苗具有促生作用?总之, 荧光假单胞菌CZ能在烟草根际定殖和促进植株生长, 叶面喷施能钝化TMV并抑制其初侵染, 可以研发防治病毒病害的生物制剂?     

荧光假单胞菌PEF-5#18防控番茄枯萎病的定殖机理

通过电转法成功将EGFP表达质粒p EGFP20转入对番茄枯萎病具有优良防病效果的荧光假单胞菌PEF-5#18体内,并研究了该生防菌在番茄根际土壤与植株根、茎内部组织的定殖情况。结果表明,处理25 d后,标记型与野生型生防菌处理均能有效控制番茄枯萎病害并增加植株鲜、干重量。与病原菌阳性对照相比,野生型菌株的防治效果为76.92%,鲜重增加194.10%,干重增加564.71%;接种后的PEF-5#18能良好定殖于番茄根际土壤并扩展进入植物根茎内部生长,其分布数量呈现出根际土壤(1.05×106 CFU/g)根(6.75×104 CFU/g)茎(1.25×102 CFU/g);与病原菌阳性对照相比,接种PEF-5#18对番茄根际土壤的可培养细菌总数影响差异不显著,但可显著提高根(增幅为8.42%)、茎(增幅为14.78%)内的可培养细菌总数以及根际土壤pH(增幅为1.61%);接种PEF-5#18能显著降低根际土壤与根、茎内病原菌侵染数量;激光共聚焦镜检发现,接种25 d后,PEF-5#18能大量分布于番茄根系表面、根内木质部、根内皮层细胞、根内细胞间隙、茎内维管及其周围细胞。     

调控基因gacA在荧光假单胞菌2P24防治土传病害中的作用

 Pseudomonas fluorescens 2P24分离自山东小麦全蚀病自然衰退土壤,该菌株能产生抗生素2,4-二乙酰基藤黄酚(2,4-diacetylphloroglucinol,2,4-DAPG)、氢氰酸,嗜铁素和蛋白酶,且抑菌谱广,可防治多种作物土传病害。本研究应用Tn5转座突变技术,获得1株产嗜铁素过量,同时不产生2,4-DAPG、HCN、蛋白酶、不能形成生物膜(biofilm)的突变菌株PM3390,其表现型与调控基因gacA的突变体表型相似。通过PCR介导的文库筛选方法,从2P24基因组文库中获得2个含有gacA基因的阳性克隆,进一步亚克隆,得到只含有完整gacA开放阅读框的1.2 kb片段,互补实验表明其能恢复突变菌株的多种缺失表型。生测结果表明,gacA-突变菌株与野生型2P24相比,对不同土传病害的生防效果均显著降低。以上结果证实gacA在2P24中具有整体水平的调控功能,并在2P24防治土传病害中起到重要的作用。     

铜绿假单胞菌ZJ1999对水稻纹枯病的防治及其在水稻上的定殖

利用拮抗菌铜绿假单胞菌ZJ1999产生的粗提液进行防治水稻纹枯病研究的结果表明，抑制病菌侵染的活力随着粗提液浓度提高和处理时间的延长而增强。该菌株的定殖时间与最初引进时的浓度密切相关，其最低应用浓度为10^8cfu／ml，在接种纹枯病病菌后第一天的喷施防效最佳。拮抗菌ZJ1999在发病的秧苗、成株期植株茎杆和叶片上，14d后的菌量分别维持在10^2-10^3和10^3～10^4cfu／g。     

绿色荧光蛋白标记荧光假单胞菌P303及其生存能力检测

构建了含有荧光假单胞菌自身启动子PP303的中间质粒载体pGFP.然后利用mini-Tn5转座子,通过接合转移,将两个带有不同启动子的绿色荧光蛋白基因分别整合到荧光假单胞菌P303染色体上,获得了在488nm波长下发光稳定的P303m1和P303m3菌株.PCR鉴定和Southern印迹结果均证明绿色荧光蛋白已随机插入P303染色体.SDS-PAGE结果表明,含有PA1/04/03启动子的P303m3菌株GFP表达量低于含有PP303启动子的P303m1菌株,染色体标记的GFP表达量低于质粒标记.室内平板抑菌试验结果表明,P303m1与出发菌株P303抑菌活性相当,对九种植物病原真菌有较强的拮抗作用.定殖、生存竞争能力研究表明,荧光假单胞菌在自然土壤中和大白菜根际都具有较强的定殖能力.P303和P303m1在自然土壤中第60天的菌量分别为1.63×104和3.3×102cfu/g土(湿重),大白菜根际第50天的菌量分别为3.29×106和4.1×104cfu/g根(湿重).     

利用编码harpin蛋白的基因遗传改良生防荧光假单胞菌2P24

荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens 2P24是根围促生细菌（PGPR）,具有Ⅲ型分泌系统（T3SS）。为了在2P24中表达植物过敏反应激发子harpin,赋予生防菌诱导抗病性能力,本文选择可在2P24中表达的来自Pseudomonas syringae pv.tomato DC3000的avrPto1基因启动子与水稻细菌性条斑病菌Xanthomonasoryzae pv.oryzicola harpin蛋白编码基因hpa1进行融合,实现了harpin蛋白在2P24的表达。重组菌株通过T3SS分泌harpin蛋白,可激发烟草产生过敏反应（HR）,激活HR途径的HIN1基因和HRS203J基因以及病程相关蛋白PR1a基因的转录表达。harpin重组菌株与2P24一样,对小麦赤霉病菌Fusarium graminearum和棉花枯萎病菌F.oxysporum f.sp.vasinfectum具有抑制作用。这为利用植物-病原物互作中激发植物产生抗病性的激发子来遗传改良生防微生物奠定了理论和实践基础。     

荧光假单胞菌SS101对苹果再植病害的生防效果

为明确荧光假单胞菌SS101对苹果再植病害的生防效果,采用平板对峙法和孢子萌发法研究了SS101菌株对9株来自不同苹果产区病原菌的抑制作用以及对盆栽海棠实生苗、海棠大苗和苹果树生长的影响,并测定了连续处理4年苹果树的产量。结果显示,SS101菌株对9株病原菌的菌丝生长抑制率为39.39%~72.00%,对孢子萌发抑制率为19.86%~51.77%;经SS101菌株处理后,海棠实生苗叶绿素含量、株高和鲜重均显著高于再植土处理,分别提高13.38%、19.39%和48.26%;经SS101菌株处理后,海棠大苗定植9个月后,茎粗净增长量为2.97 mm,增长率为214.05%,而再植土处理仅为114.02%;连续处理4年的苹果树平均单株产量比再植土处理提高139.46%,且消除了再植病害症状。研究表明,SS101菌株对苹果再植病害病原菌具有显著抑制作用,在田间对再植病害具有良好的防控效果。     

铜绿假单胞菌ZB27的定殖能力及对杂交竹梢枯病的防控作用

通过抗生素标记法获得铜绿假单胞菌ZB27的抗氯霉素突变菌株,并运用喷雾和稀释平板法检测该菌的定殖能力及对杂交竹梢枯病的防控作用。结果表明,ZB27标记菌株抗氯霉素的浓度为750 μg/mL,且性状稳定、回收率高。ZB27可以快速定殖到杂交竹枝叶,并长期维持稳定的定殖量;高浓度(10⁹、10⁷ CFU/mL)的菌液定殖量大于低浓度的菌液;在叶上的定殖量大于枝干,8天时达到顶峰,到40天时仍能保持较高的水平;病原菌的接入对生防菌在叶部的定殖影响较大,对在枝干定殖影响较小。预先接种ZB27菌悬液和其次生代谢产物对杂交竹梢枯病的防效分别为70.07%和68.05%,显著高于其它处理,说明利用菌悬液或其次生代谢物防治杂交竹梢枯病均有较好的防治效果。     

生防菌株2P24与CPF-10的鉴定及其生防相关性状的初步分析

 从山东省小麦根围土壤中分离到具有生防活性的细菌菌株2P24、CPF-10。通过对其16S rDNA序列同源性分析及生理生化测定鉴定为荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens),其中菌株2P24为生物型I,CPF-10为生物型V。对这2株细菌的生防相关性状分析表明,二者均可产生多种抗菌物质,如2,4-二乙酰基间苯三酚(2,4-DAPG)、氢氰酸(HCN)、嗜铁素、蛋白酶等。平板对峙测定表明2株细菌对番茄青枯菌(Rastonia solanacearum)、棉花立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、棉花枯萎菌(Fusarium oxysporum)具有明显的拮抗作用。温室生测表明2P24对番茄青枯病的防效达63.0%。CPF-10达62.4%,且持续稳定。     

Involvement of gacA Gene in the Suppression of Tomato Bacterial Wilt by Pseudomonas fluorescens FPT9601

Pseudomonas fluorescens FPT9601, a plant growth-promoting rhizobacterium (PGPR) isolated from tomato rhizosphere, can protect tomato (Lycopersicon esculentum Mill) from bacterial wilt disease caused by Ralstonia solanacearum. This strain produces antibiotics 2,4-diacetylphloroglucinol (2,4-DAPG) and hydrogen cyanide (HCN). It also produces proteases and uncharacterized siderophores (Sid). A mutant strain SM2214, obtained by Tn5 insertion, did not produce 2,4-DAPG, HCN or proteases, but overproduced Sid. Marker-exchange mutagenesis confirmed that a single transposon insertion caused the multiple phenotypic changes of this mutant. Complementation of the mutant with a 1.3-kb DNA fragment that was amplified from genomic DNA of the wild-type P. fluorescens strain by PCR could restore the lost functions of the mutant strain. Nucleotide sequencing revealed that the fragment contained a 642-bp open reading frame (ORF) highly homologous to the regulator responser gene gacA. The in vitro anti-bacterium test and plant protection experiment under greenhouse conditions indicated that the gacA gene played an important role in the suppression of tomato bacterial wilt disease. Received 20 November 2000/ Accepted in revised form 19 January 2001     

荧光假单胞菌2P24中phlF基因对抗生素2,4-二乙酰基间苯三酚产生的影响

Pseudomonas fluorescens2P24是分离自山东小麦全蚀病自然衰退土的1株生物防治菌株,产生抗生素2,4-二乙酰基间苯三酚(2,4-diacetylphloroglucinol;2,4-DAPG)是其主要防病机制。2,4-DAPG是由phlACBD基因簇合成,受多种调控因子调控。本研究用Tn5转座子插入技术,获得1株phlA基因转录增强的突变体,其突变基因为抗生素合成的负调控基因phlF。与野生菌相比,phlF基因的缺失突变体中phlA的转录增强约100倍,抗生素产量提高492倍。同时,菌株2P24的phlF缺失突变体对病原真菌的拮抗作用明显增强。但2,4-DAPG过量表达菌株对多种作物种子根生长有抑制作用。     

硅藻土和滑石粉作为荧光假单胞菌P13菌剂的载体研究

从菌体的吸附和释放两方面,研究了硅藻土和滑石粉在不同条件下作为生防菌荧光假单胞菌P13菌剂载体的可能性。结果表明,在温度为25℃,pH7时,两种材料对P13菌剂有良好的吸附效果,且吸附速率较快。扫描电镜分析表明,吸附过程可能与硅藻土表面和微孔结构,滑石粉片层结构以及菌体形态有关。在制备干粉状菌剂时,硅藻土和滑石粉与溶剂比例分别为100：50（m/v）和100：24（m/v）时,菌体释放率较高。表明硅藻土和滑石粉是良好的载体材料且具有应用前景。     

荧光假单胞杆菌P2-5菌株对小麦全蚀病的抑制作用

室内测定了荧光假单胞杆菌P_2-5菌株对小麦全蚀病菌9826菌株的拮抗作用。结果表明,P_2-5菌株对小麦全蚀病菌具有较强抑制作用,抑制效果和防治效果分别为67％和59％,高于化学杀菌剂烯唑醇(特普唑)处理的效果。研究表明P_2-5菌株可以致使病菌菌丝畸变。应用双抗标记法测定了P_2-5菌株在小麦根系中的定殖情况,结果表明,该菌可以在小麦根系定殖。     

产抗菌素2,4-二乙酰基藤黄酚假单胞杆菌的分离及其防治沙打旺根腐病的室内测定

从山东、内蒙古、北京等地土壤中分离筛选出荧光菌 50 0 0余株 ,其中 1 2 0 0余株为抑制性荧光菌。经PCR检测 ,获得 73株 2 ,4 二乙酰基藤黄酚 (2 ,4 DAPG)产生菌。平板筛选结果表明 ,2 ,4 DAPG产生菌CPF 1 0和 2P8对沙打旺根腐病菌Sad1和Sad2均有较好的抑制效果 ,其中CPF 1 0的抑菌带宽分别为 5.0和 1 2 .0mm ;2P8抑菌带宽分别为 3 .5和 7.0mm。温室试验两次调查表明 ,CPF 1 0对沙打旺根腐病防治效果最好 ,达 63 .5%和 67.8% ;2P8防效也在 40 %左右 ,且均达到极显著水平。 2 ,4 DAPG产生菌可以显著促进沙打旺植株根系发育 ,CPF 1 0处理后地上部株高差异不显著 ,但鲜重和干重与对照相比有极显著的增加 ,说明两菌株菌剂处理可以促进植株生长。根部定殖结果表明 ,两菌株在沙打旺根部都有一定的定殖能力 ,在根表种群数量比较稳定 ,根内细菌数量在调查时间内呈逐渐上升的趋势