中国白梨S基因研究17个品种S基因型的确定和2个新S基因的鉴定

梨S基因型的确定对授粉品种的选择具有指导作用.采用PCR-RFLP检测、DNA序列分析和田间杂交试验,鉴定了两个新S-RNase基因,分别为S17-RNase和S21-RNase,同时确定了7个白梨品种的S基因型.S17-RNase和S21-RNase基因的内含子大小分别为142 bp和139 bp,HV区长度分别为16个和15个氨基酸,信号肽-P2的推导氨基酸长度分别为99个和98个氨基酸,信号肽大小均为27个氨基酸,C1大小均为11个氨基酸,C2大小均为12个氨基酸.白梨品种海棠酥、六瓣、恩梨、鸭梨、大核白、香椿、青梨等品种的S基因型分别为S1S12S19、S17S19、S1S19、S1S21、S16S19、S3S19、S19S19.该研究可为梨遗传改良和丰产栽培提供重要的理论依据.     

中国白梨S基因研究Ⅰ 7个品种S基因型的确定和2个新S基因的鉴定

梨S基因型的确定对授粉品种的选择具有指导作用.采用PCR-RFLP检测、DNA序列分析和田间杂交试验,鉴定了两个新S-RN ase基因,分别为S17-RN ase和S21-RN ase,同时确定了7个白梨品种的S基因型.S17-RN ase和S21-RN ase基因的内含子大小分别为142 bp和139 bp,HV区长度分别为16个和15个氨基酸,信号肽-P2的推导氨基酸长度分别为99个和98个氨基酸,信号肽大小均为27个氨基酸,C1大小均为11个氨基酸,C2大小均为12个氨基酸.白梨品种海棠酥、六瓣、恩梨、鸭梨、大核白、香椿、青梨等品种的S基因型分别为S1S12S19、S17S19、S1S19、S1S21、S16S19、S3S19、S19S19.该研究可为梨遗传改良和丰产栽培提供重要的理论依据.     

梨自交不亲和新基因S12-RNase的分离鉴定及序列分析

植物自交不亲和性(self-incompatbility,简称SI)是植物生殖过程中的一种普遍现象(Hiscock et al.,1996;Andrew et al.,1996).     

11个中国梨品种S基因型的鉴定

采用梨自交不亲和基因的特异引物"FTQQYQ"和"anti-IIWPNV",对11个梨品种的基因组DNA进行了特异PCR扩增,对扩增片段进行回收、克隆和测序。利用生物信息学软件对各序列进行比对分析,最后确定了各品种的S基因型,即早熟句句、新疆黄梨、绿句句、魁克句句等4个新疆梨品种的S基因型均为S22S28;圆香为S16S15,福安尖把为S16S22,晋蜜梨为S21S28,兰州软儿为SdS12,迟咸丰为S5aS18,红秀2号为S1S12,鸭广梨为S19S30。     

7个砂梨品种S基因型的确定及1个新S-RNase基因的分离鉴定

砂梨是重要的经济树种,表现出典型的配子体自交不亲和性,在生产和育种上需鉴定品种的S基因犁以确定品种间的亲和性.选取7个砂梨品种为试验材料,使用梨S-RNase(S基因)通用引物进行基因组PCR扩增,产物通过1.8%的琼脂糖凝胶电泳分析.结果表明:‘楚比香'等4个品种中产生了预期的2条电泳条带,而其他3个品种都只产生1条带产物,通过6%的聚丙烯酰胺电泳对该3个品种的PCR产物进一步分析,结果产物被成功分离.将7个品种中分离到的14个条带分别回收、克隆、测序及序列分析,从中鉴别出10个具有梨S-RNase基因序列特征的S基因,其中‘政和大雪梨'中494 bp的基因片段被鉴定为新的S基因,暂命名为S43-RNase(GenBank接受号EF566873).RT-PCR试验证明S43-RNase仅在化柱中特异表达,符合S-RNase的表达特征.通过比对S43-RNase的基因组序列和cDNA序列,确定其内含子大小为294 bp.在推导氨基酸水平上,S43-RNase与苹果亚科其他S-RNase表现出65%～92%的相似性.     

中国梨品种自交不亲和新基因的分离鉴定

采用分子生物学技术、田间杂交试验和生物信息学方法研究了中国梨自交不亲和基因和品种的S基因型.从中国白梨和沙梨品种中分离鉴定了15个梨自交不亲和新基因;分析了新S基因的序列特征;确定了中国白梨中至少存在17个S等位基因,中国沙梨中至少存在10个S等位基因;鉴别了34个梨品种的S基因型.这些新S基因的发现和品种S基因型的确定为中国梨品种的优化配置、丰产栽培和遗传改良提供了科学依据.     

7个杏李品种S基因型的鉴定

为给杏李的品种配置和遗传育种提供了理论基础,利用特异性PCR扩增、DNA测序和生物信息学方法鉴定了恐龙蛋等7个杏李品种的S基因型.S基因的PCR扩增结果表明,Ph引物对风味皇后、味帝、味王、风味玫瑰、味厚、恐龙蛋6个品种扩增出1条850bp左右片段;Pe引物对风味皇后、味王、风味玫瑰、味厚、味馨5个品种扩增出1条1100bp左右片段;Pb引物对味帝和恐龙蛋扩增出900bp左右片段;P2引物对味馨扩增出850bp左右的片段.对PCR产物克隆后测序,并通过BLAST比对和生物信息学分析表明,风味皇后、味王、风味玫瑰和味厚4个品种的2个PCR产物分别与Se-RNase和Sh-RNase基因的相似性达100%,味帝和恐龙蛋的2个产物分别与Sb-RNase和Sh-RNase基因的相似性达100%,味馨的2个PCR产物与Se-RNase和S2-RNase基因的相似性达100%;结合PCR分析和序列生物信息学分析确定了味王等7个杏李品种的S基因型：风味皇后、味王、风味玫瑰和味厚等4个品种的S基因型相同,为SeSh;味帝和恐龙蛋的S基因型相同,为SbSh;味馨的S基因型为SeS2.     

13个‘新世纪’梨后代品种S基因型的鉴定

'新世纪'(Shinseiki)梨是日本培育的沙梨(Pyrus pyrifolia)的优良品种(梁林平等,2001; 杨健等,2001).近年来中国、日本、韩国利用'新世纪'梨进行杂交选育了许多优良品种,并广泛地栽培利用,这些品种都属于沙梨系统.沙梨是配子体自交不亲和品种,生产上常采用配置授粉品种或人工授粉等方法来克服自交不亲和性(佐藤昭宏, 2001).     

中国白梨PbSFBB13-gamma基因的分子克隆与序列特征

以5个已知S基因型的中国白梨品种为试材,设计分别对应于梨SFBB-alpha,SFBB-beta和SFBB-gamma 基因的3对引物对这5个品种进行基因组PCR扩增.结果仅引物组合PSFBG-F/PSFBG-R从‘金花'(S_(13)S_(18)),‘金花四号'((S_(13)S_(18))和‘鹅梨'((S_(13)S_(34))中扩增出一约1 300 bp的条带,经回收、克隆、测序后,鉴定其为SFBB-gamma基因,命名为PbSFBB13-gamma(Pyrus bretschneideri SFBB13-gamma),GenBank登录号为EU081892.逆转录PCR结果表明PbSFBB13-gamma仅在花粉中特异表达;序列分析表明该基因不含内含子,编码区含1 191个核苷酸,编码396个氨基酸,预测分子质量与等电点分别为45.4 ku、4.63.PbSFBB13-gamma表现出典型的花粉SFB/SLF基因的基本结构特征,即1个F-box结构域及4个可变区;在推导氨基酸水平上,其与蔷薇科SFB/SLF基因的相似性为17.8%-97.7%.试验结果充分表明PbSFBB13-gamma应为花粉S基因的候选基因.选取蔷薇科34个SFB/SLF基因的全长氨基酸序列,构建进化树研究基因间的进化关系.结果表明,34个SFB/SLF基因形成2个亚科特异的类群,但不形成种特异的类群,其进化规律与蔷薇科S-RNase基因一致,即花粉SFB/SLF基因的形成也是在亚科形成之后、种形成之前.研究结果有助于从分子水平上揭示中国白梨的自交不亲和性机制.     

基于基因芯片的梨品种S基因型鉴定的技术方法

梨是典型的配子体自交不亲和植物,梨品种自交不亲和基因型(S基因型)确定的研究对于梨的栽培和遗传改良具有重要的意义.综合分析了运用杂交授粉试验、PCR-RFLP技术、DNA序列分析、cDNA克隆等技术在确定梨品种S基因型方面的优点和不足之处,提出了运用基因芯片技术确定梨品种S基因型的新方法,并分析了该技术的优势以及在梨品种S基因型确定方面的应用前景.     

中国梨新SFBB-gamma基因的鉴定及序列分析

通过分子生物学方法分离鉴定了4个新的梨SFBB-gamma基因,并对其序列进行了生物信息学分析。SFBB-gamma基因的特异性引物对4个梨品种进行PCR扩增结果表明,4个品种均扩增出一条1 250 bp左右的条带;通过DNA测序和生物信息学分析方法从‘鸭梨’、‘红皮酥’、‘中梨二号’和‘兰州软儿’等梨品种中分离鉴定了SFBB21(EU422961)、SFBB26(EU422961)、SFBB31(EU422959)、SFBBd-gamma(EU422962)基因。聚类分析中发现,仁果类SFBB基因和核果类和SFB基因明显的分成两类,仁果类中梨SFBB基因和苹果SFBB基因又各分成一类,这与物种的亲缘关系相符合。新鉴定的梨SFBB基因中从白梨中分离鉴定的SFBB21-gamma基因与梨其他SFBB-gamma基因的亲缘关系最远。该研究为梨自交不亲和机理研究和遗传改良提供理论基础。     

中国砂梨7个自交不亲和新基因的分离与测序

S-RNase是配子体自交不亲和植物雌蕊的基因产物,它降解具有相同基因型的花粉mRNA或rRNA,导致植物的自交不亲和.借鉴日本梨S-RNase基因的分析方法,对中国砂梨5个品种的基因组DNA进行PCR-RFLP系统检测和DNA序列分析,从中发现了7个新的S-RNase等位基因,分别命名为S11-RNase、S12-RNase、S13-RNase、S14-RNase、S15-RNase、S16-RNase和S25-RNase基因,其部分序列已登录到GenBank.     

梨S基因检测芯片的oligo探针设计

为给梨品种S基因芯片的制备及梨品种自交不亲和性S-RNase基因和S基因型的检测奠定基础,结合已有的对梨自交不亲和S-RNase基因的研究成果及Genbank中梨S-RNase基因信息,利用生物学比对软件Genedoce对梨S-RNase等位基因序列进行比对,得到等位基因HV区的特异序列;用oligo6.71、Premier Premier 5.0和Clustal.W等生物学软件设计特异性高、解链温度Tm值接近、长度均一的oligo探针,获得了24条32 mer的oligo探针。     

梨4个SFBB~(-γ)基因的分离及遗传多态性分析

By using PCR-based molecular method,four new pear SFBB-γ genes were isolated from 8 pear cultivars known as S-genotypes.Length of PCR products from eight pear cultivars was around 1 200 bp.Sequencing the specific PCR fragments revealed four new SFBB-γ genes that were respectively named as SFBB 16-γ (EU422956),SFBB 17-γ (EU422957),SFBB 28-γ (EU422960)and SFBB 35-γ (EU422958).As for different SFBB-γ genes,variation in amino acid was higher in F-box region and variable region 1,and lower in variable region 2 t...     

梨S_(12)-RNase基因启动子植物表达载体的构建及转基因研究

为了检测S12-RNase启动子的表达特性,以pBI101.2为基础,构建了砂梨S12-RNase基因启动子5’端系列缺失植物表达载体PS12-(0～5)-GUS-pBll01.2,并通过农杆菌介导的Floral Dip法转化哥伦比亚野生型拟南芥。卡那霉素和PCR鉴定表明:GUS基因已整合到转基因植株的基因组中,为下一步进行启动子功能的鉴定奠定了基础。     

2个野扁桃自交不亲和SFB基因全长的克隆与序列分析

为给野扁桃的遗传改良和自交不亲和机制的进一步研究提供理论依据,以新疆野扁桃花药为试材,利用RT-PCR和RACE技术克隆野扁桃自交不亲和性花粉特异性决定因子编码基因SFB全长序列。采用BLAST进行序列比对,ORF Finder寻找开放阅读框,CDD分析蛋白保守结构域,Prot Param分析蛋白理化性质,TMHMM预测蛋白跨膜区,Signal P预测蛋白信号肽,Sub Loc预测蛋白亚细胞定位,SOPMA分析蛋白二级结构,DANMAN进行氨基酸多序列比对,MEGA6进行系统进化分析,Prot Fun预测蛋白功能。结果表明:克隆到的Pt SFB16基因和Pt SFB17基因属于F-box基因家族,与其它多种植物的SLF/SFB基因的序列相似度为88%,推导的氨基酸序列均具有F-box蛋白典型结构;Pt SFB16基因ORF长1 146 bp,编码381个氨基酸,Pt SFB17基因ORF长1 131 bp,编码376个氨基酸;预测2个SFB蛋白均为略显亲水性、不稳定的细胞质蛋白,二级结构均以α-螺旋,延伸链和无规则卷曲为主,SFB/SLF蛋白在蔷薇科李属植物中具有较高的系统进化一致性,种间同源性可能大于种内同源性,SFB蛋白可能的功能主要有辅助因子生物合成、能量代谢和裂合酶。