不同种猪品种对克隆胚胎体内外发育的影响

[目的]促进体细胞克隆技术的大规模产业化应用。[方法]以长白猪、杜洛克猪2个品种种猪不同个体的耳部成纤维细胞为供体细胞,体外构建克隆胚胎,并对其克隆胚胎体内外发育以及产仔情况进行研究。[结果]长白猪、杜洛克2个品种种猪克隆胚胎分裂率、囊胚率分别为100%和83.7%、31.3%和19.1%。将来源于2个品种不同个体供体细胞的共3 419枚体外构建克隆胚胎移植给19头代孕母猪,结果发现16头代孕母猪共产下64头克隆仔猪;长白猪和杜洛克猪受孕率分别为83.3%和84.6%,平均窝产仔数分别为(1.7±2.87)和(2.0±2.3)头,平均初生重分别为(0.92±0.35)和(1.18±0.39)kg,以上指标2个品种间均差异不显著。长白猪克隆效率为0.84%,显著低于杜洛克猪(2.42%)。[结论]该研究比较了不同种猪品种克隆胚胎体内外发育以及出生情况,证明来源于成年种猪的耳部组织成纤维细胞可以有效用于克隆种猪,但克隆效率存在品种差异。     

利用体细胞核移植技术生产表达红色荧光蛋白的猪转基因克隆胚胎研究

[目的]为生产转基因克隆猪奠定基础。[方法]以反转录病毒转染的带有红色荧光蛋白（RFP）基因的猪胎儿成纤维细胞作为核移植的核供体,利用体细胞克隆技术研究红色荧光蛋白克隆胚胎体外发育情况。[结果]RFP转基因细胞的融合率为83.87%,与未转基因细胞（80.56%）相比无显著差异（P〉0.05）;RFP转基因体细胞重构胚体外囊胚率为8.67%,与未转基因细胞组（6.56%）相比无显差异著（P〉0.05）;RFP转基因体细胞重构胚移植于15头受体后,尚无受孕个体。[结论]利用转红色荧光蛋白基因的细胞为供体细胞,能够成功克隆出转基因胚胎,并获得转基因囊胚。     

利用体细胞核移植技术生产表达红色荧光蛋白的猪转基因克隆胚胎（摘要）

[目的]为生产转基因克隆猪奠定基础。[方法]以反转录病毒转染的带有红色荧光蛋白（RFP）基因的猪胎儿成纤维细胞作为核移植的核供体,利用体细胞克隆技术研究红色荧光蛋白克隆胚胎体外发育情况。[结果]RFP转基因细胞的融合率为83.87%,与未转基因细胸（80.56%）相比无显差异著（P〉0.05）;RFP转基因体细胞重构胚体外囊胚率为8.67%,与未转基因细胞组（6.56%）相比无显差异著（P〉0.05）;RFP转基因体细胞重构胚移植于15头受体后,尚无受孕个体。[结论]利用转红色荧光蛋白基因的细胞为供体细胞,并成功地克隆出转基因胚胎。     

华南农业大学成功培育成粤首例体细胞克隆猪

2008年5月15日,广东省第1头体细胞克隆猪在广东温氏食品集团有限公司水台原种猪场出生,这是我省首例体细胞克隆猪。华南农业大学、广东省农业厅和广东省农业科学院的专家见证了该头克隆猪的到来。该项研究是华南农业大学派驻温氏集团研究院的吴珍芳教授的课题组在中国农业大学李宁院士的支持下完成的。该课题组此次成功移植了4头受体母猪,经过115 d的怀孕期,首胎受孕母猪即生产了5头克隆小猪,均健康活泼。另1头克隆受体母猪将在1周后分娩。     

科技前沿

南京农业大学首例徒手克隆猪诞生9月15日晚上10时45分,一胎8头体细胞克隆小猪诞生,这是南京农业大学首例利用徒手克隆核移植技术生产的克隆猪。这也标志着南农利用徒手克隆技术生产克隆猪技术取得重大突破。此次徒手克隆猪制备试验,由南京农业大学动科院遗传育种研究室联合安徽农业大学动科院张运海副教授课题组及大鹏养猪合作社共同合作开展。安徽农大提供核移植用供体细胞,     

江苏：首例徒手克隆猪诞生

一胎8头体细胞克隆小猪近日在南京农业大学诞生,这是江苏省首例利用徒手克隆核移植技术生产的克隆猪。     

梅山猪耳组织成纤维细胞及其处理对核移植重组胚发育的影响

为研究供体细胞不同处理方法对核移植重构胚发育能力的影响,分别用血清饥饿不同时间和传代次数的供体细胞进行核移植,比较重组胚的卵裂率和囊胚率。结果发现,饥饿0、2、4、8d的核供体细胞,重组胚在卵裂率上没有表现显著的差异,而饥饿2d和4d试验组的囊胚率却显著高于其他组;以传代0、2、4、8代的细胞作为供体细胞进行核移植,未经传代的细胞直接作为核供体卵裂率为57.69%,明显低于经过传代的细胞;细胞的传代次数在重组胚卵裂率上并未表现出明显的不同,但传至第4代细胞构成重组胚的卵裂率和囊胚率最高(86.29%和23.36%)。试验选取饥饿处理2d、传4代的成纤维细胞作为核移植的供体,挑选发育良好的重组胚移植到6头代孕母猪体内,3头代孕母猪在第1到第3个情期相继返情,1头在胚胎移植45d流产;2头没有返情,B超检查受孕,其中1头代孕母猪到预产期顺利产下6头健康胎儿。     

利用体细胞核移植技术生产优秀种公猪

为探讨体细胞核移植技术用于种公猪的实际生产,复制优秀种公猪的可行性,精选优秀种公猪作为供体,取其耳组织成纤维细胞作核供体,体外成熟的猪卵母细胞为核受体构建克隆胚胎,胚胎体外培养后进行移植。试验先后移植了3 437枚1～4细胞期克隆胚胎到18头受体母猪的输卵管内,28d经B超检测,有16头受体母猪妊娠(88.89%),11头妊娠足月(68.75%)分娩产下53头仔猪,体细胞克隆猪的生产效率为2.80%(出生仔猪/移植胚胎)。早期生长性状测定结果显示,0和7d时克隆猪的体质量和体尺与普通公猪无显著差异(P>0.05)。利用体细胞核移植技术生产克隆种公猪,可以延伸种公猪的利用时间和空间,放大优秀种猪的利用价值。     

Vc对猪体细胞克隆胚胎体外及体内发育的影响

[目的]提高克隆猪的大批量生产效率,优化体外与体内培养体系。[方法]将所获得的猪体细胞克隆胚胎用含不同Vc浓度的培养液培养,比较体外囊胚发育力和囊胚细胞数,筛选出合适的培养浓度,然后用此浓度培养后的胚胎进行体内手术移植,统计克隆猪的分娩率和产仔情况。[结果]克隆胚胎在激活后用40μg/m L Vc处理22 h,体外培养未显著增加囊胚率,但显著提高了囊胚细胞数。体内移植结果显示,添加Vc未提高妊娠率,但增加了窝均总仔数,克隆效率差异显著。[结论]Vc处理有利于增强体细胞克隆胚的体内和体外发育能力。     

胚胎移植方法和受体母猪因素对克隆猪生产效率的影响

【目的】建立高效的胚胎移植技术体系,以提高克隆猪的生产效率。【方法】比较不同移植方法和不同受体母猪状况的胚胎移植分娩率和克隆猪的出生效率,利用体外发育能力相似的不同品种和发育阶段的克隆胚胎混合移植确定最佳的受体母猪发情同期时间。【结果】克隆胚胎经由输卵管伞移植比输卵管打孔移植具有更高的移植分娩率和克隆猪效率（2.2% 和0.4%,P＜0.01）,而胚胎移植后辅助人工授精会降低克隆效率（0.6% 和 2.2%,P＜0.01）。利用经产母猪作为移植受体比青年猪受体具有更高的克隆效率（3.0%和0.8%,P＜0.01）和平均窝产仔数（（5.5±0.7）头和（2.7±0.3）头,P＜0.05）。受体母猪发情时间比胚胎激活时间晚12-36 h组的克隆效率分别为显著（P＜0.05）和极显著（P＜0.01）,高于晚0 h和早12-24 h 组的克隆效率（2.0%、0.5%和0%）。最佳的受体母猪发情时间为晚于克隆胚胎激活后24 h,克隆效率达3.0%。【结论】选择自然发情时间晚于克隆胚激活后24 h的经产母猪为受体,通过输卵管伞端移植胚胎,能够获得较高的克隆效率,是猪克隆胚胎移植的较理想方法。     

海南五指山猪SLA-DQA基因cDNA全长的克隆分析

[目的]为猪异种器官移植的免疫识别机理的研究奠定基础。[方法]采用RT-PCR方法扩增五指山猪DQA基因cDNA,然后进行测序和序列分析。[结果]海南五指山猪SLA-DQA基因序列长度为768个核苷酸,其中1～765为完全阅读框编码255个氨基酸残基。五指山猪SLA-DQA基因cDNA序列及其推导的氨基酸序列与我国小型猪同源性最高,与人相应基因的同源性明显高于与小鼠的同源性。[结论]将五指山猪作为适合于进行异种器官移植的中国猪种,对免疫遗传学特性系列研究具有重要意义。     

猪体细胞克隆研究进展

综述了用核移植方法生产体细胞克隆猪的技术关键和难点及应用情况,并对提高猪体细胞核移植效率的策略进行了分析。     

生产转基因五指山小型猪重构胚条件优化

利用体细胞核移植技术是得到具有优良特征及抗病性五指山小型猪快速有效方法,因此将外源基因安全高效导入到供核细胞至关重要。利用不同转染试剂、转染方法对转染效率进行研究,确定G418筛选浓度。同时利用体细胞核移植技术生产转单体红色荧光蛋白重构胚。结果表明,使用U-023细胞核电转程序能有效介导质粒pCX-mRFP1转染猪耳成纤维细胞,转染率可达到83.33%。确定G418最佳筛选浓度为200μg.mL-1。利用转基因细胞作为核供体生产重构胚卵裂率是83.08%(221/266),囊胚率是11.65%(31/266)。研究结果为生产表达单体红色荧光蛋白五指山小型猪提供参考,从而为人类疾病发病机理研究以及生产人类疾病模型动物奠定了基础。     

转β-甘露聚糖酶基因克隆猪的制备与分析

【目的】将前期构建的含有黑曲霉β-甘露聚糖酶基因manA的质粒p PSPBGP-manA转染杜洛克猪胎儿成纤维细胞,利用G418筛选出转基因细胞系,通过体细胞核移植方法生产出转manA基因猪,利用分子生物学方法对转基因猪进行阳性鉴定、基因及蛋白表达水平的检测,同时测定转基因猪唾液β-甘露聚糖酶酶活、粪便营养物质含量,旨在为生产及进一步研究转manA基因猪提供一些科学依据。【方法】用限制性内切酶Not I将质粒p PSPBGP-manA线性化并通过脂质体法将其转入杜洛克猪胎儿成纤维细胞,然后用不同浓度的G418进行筛选、维持培养,将筛选后的细胞进行体细胞核移植生产克隆猪;克隆猪出生后采取尾组织样用酚-氯仿法提取基因组DNA进行PCR及Southern blotting鉴定阳性转基因猪;收集转基因猪唾液并利用DNS法进行β-甘露聚糖酶活性测定,同时收集转基因猪粪便测定粪便中营养物质含量;取转基因猪的腮腺、颌下腺、舌下腺、心脏、肝脏等组织并用Triol法提取RNA,然后进行RT-PCR鉴定manA基因的表达,再进行相对定量PCR检测manA基因在不同个体及组织间的表达差异;通过Western blotting技术分析转基因猪外源性manA基因的蛋白表达水平。【结果】经G418筛选后进行PCR鉴定得到阳性转基因细胞系;通过体细胞核移植方法生产出21头克隆猪,经PCR及Southern blotting鉴定出16头转基因猪,阳性率为76%;转基因猪唾液中β-甘露聚糖酶的活性为(0.092±0.003)U·m L-1,粪便中粗蛋白含量明显降低;经RT-PCR、相对定量PCR鉴定,manA基因在转基因猪腮腺和舌下腺组织中特异表达,其它组织不表达,腮腺组织表达量高于舌下腺组织;Western blotting检测发现在腮腺和舌下腺组织中有manA的表达。【结论】通过G418筛选得到转manA基因细胞系并成功得到转manA基因猪,外源manA基因能够在转基因猪中腮腺和舌下腺组织特异性表达,为转manA基因猪的生产及进一步研究奠定了基础。     

五指山小型猪APEX1基因cDNA的克隆及生物信息学分析

[目的]对五指山小型猪脱嘌呤嘧啶核酸内切酶cDNA进行克隆和生物信息学分析。[方法]以构建的五指山小型猪外周血白细胞cDNA文库为材料,采用菌落PCR方法,克隆得到APEX1基因全长cDNA,并运用生物信息学软件对该基因核苷酸序列及其编码蛋白的理化性质及二级结构等进行分析和预测。[结果]生物信息学分析表明,该cDNA全长1392bp,5′非翻译区长132bp,3′非翻译区长303bp,含有一个957bp的完整开放阅读框,编码318个氨基酸。该蛋白的分子量为35kD,等电点为8.05。比对分析表明,五指山小型猪APEX1基因的核酸序列及其氨基酸序列与人、小鼠、黑猩猩等哺乳动物具有较高的相似性。[结论]成功克隆了五指山小型猪A-PEX1基因cDNA,为进一步研究APEX1在动物体内的作用机制奠定了基础。     

食蟹猴-猪异种体细胞核移植胚胎的构建

[目的]探索食蟹猴—猪异种核移植胚胎的发育能力,为食蟹猴异种核移植胚胎干细胞的构建奠定基础.[方法]以食蟹猴和猪胎儿的耳部成纤维细胞为供体,猪MⅡ期去核卵母细胞为受体,构建异种核移植重构胚,并从核移植融合/激活方式、培养液两个方面进行优化.[结果]70枚食蟹猴—猪异种核移植胚胎中,有49枚分裂（70.0％）,与猪同种核移植胚胎的分裂率（76.6％）无显著差异;使用微卫星引物D15S823对食蟹猴—猪异种核移植胚胎进行遗传学鉴定,均能扩增获得D15S823条带（350 bp）;食蟹猴—猪异种核移植胚胎融合后1h的染色体早熟凝集率（24.2％）显著低于猪同种核移植胚胎（44.7％）和猪孤雌激活胚胎（100.0％）,通过使用无Ca2＋融合液能够显著提高染色体早熟凝集率（48.2％）;在PZM-3、HECM-10和HECM-10＋10％ FBS 3种培养液中,食蟹猴—猪异种核移植胚胎的分裂率无显著差异.[结论]食蟹猴体细胞核能够在猪MⅡ期去核卵母细胞胞质中发生核重塑,并发育到8-细胞阶段.     

通过微量细胞鉴定快速生产基因编辑猪

目的建立快速筛选猪的基因编辑阳性成纤维细胞系的方法以提高利用体细胞核移植产生基因编辑克隆猪的效率。方法通过PCR、T7EN1酶切和Sanger测序分析不同数量的已知猪基因编辑阳性细胞(20、50、100、150和200个细胞)的基因型,确定最小细胞数用于鉴定未知的基因编辑阳性细胞系以证明该方法的可行性。结果除20细胞组外,其他所有细胞组中均扩增出2条明显的T7EN1酶切条带(175和555 bp)。定量数据显示：20细胞组和50细胞组之间的条带灰度值存在极显著差异(P<0.01),因此50细胞可用于基因编辑阳性细胞系鉴定。利用CRISPR/Cas9系统构建IPO13打靶载体,转染猪胎儿成纤维细胞形成细胞克隆点后计数50个细胞来筛选阳性细胞系,再通过体细胞核移植快速生产了IPO13敲除猪,从而证实通过微量细胞鉴定快速生产基因编辑猪的可行性。筛选基因编辑阳性细胞系的一般方法大约需要33.7 d,新建立的方法细胞筛选周期仅为18.9 d (减少15 d),获得阳性细胞系的成功率也提高了约4倍。结论本研究建立了一种通过微量细胞鉴定快速生产基因编辑克隆猪的方法,该方法可行可靠。     

PCSK9基因D374Y突变体转基因猪的制备与分析

【目的】前蛋白转化酶枯草溶菌素9(proprotein convertase subtilisin/Kexin type 9,PCSK9)基因是人类高胆固醇血症(autosomal dominant hypercholesterolemia,ADH)的主效基因之一,其获得型突变与人类家族性高胆固醇血症有直接的关系。PCSK9-D374Y突变体对低密度脂蛋白受体(low density lipoprotein receptor,LDLR)的降解能力比野生型蛋白强十倍,增加了患高胆固醇血症的风险,从而加速动脉粥样硬化的进程。猪心血管系统和血脂代谢方面与人类非常相近,成为研究动脉粥样硬化疾病的理想模型之一。然而自然发病的猪缺乏,且诱导病征发生缓慢。因此拟利用体细胞克隆技术制备PCSK9获得型突变体转基因猪,以模拟动脉血管的病理学变化,加速发病进程,为动脉粥样硬化的研究提供理想的动物模型。【方法】研究使用人PCSK9基因D374Y突变体载体,用电转染的方法将其整合到五指山小型猪近交系胎儿成纤维细胞中,并通过体细胞核移植技术获得了人PCSK9基因D374Y突变体转基因猪个体。通过Southern-blot、实时荧光定量PCR、Western-blot等方法,分别从DNA、RNA、蛋白的水平检测了人PCSK9基因在转基因猪肝脏中的整合表达情况。同时,通过组织化学染色与H.E.染色的方法对转基因猪进行了组织学检测。【结果】转基因阳性细胞集落在药筛的第3天开始出现,至第7天形成较大的单克隆点,且PCR检测结果显示扩增产物可以拼接为完整片段,说明外源片段在基因组中具有完整性;将筛选得到的阳性细胞作为体细胞克隆的供体细胞,通过体细胞核移植技术获得了转基因猪个体。PCR及Southern-blot检测结果显示,D374Y-PCSK9基因可以完整的插入猪的基因组中,且有串联重复现象;RT-PCR和QPCR检测结果表明,人PCSK9基因能在猪肝脏内正常转录且不影响猪内源性PCSK9基因的转录,且在其它内脏器官,如心、脾、肺、肾也能检测人PCSK9基因的表达,而猪内源性PCSK9基因在这些组织中表达量很低;Western-blot检测结果与RNA水平的检测类似。这些结果说明人D374Y-PCSK9基因成功整合到猪基因猪中,且能够正常转录与翻译。通过组织化学染色发现,与野生型猪肝脏相比,克隆猪肝脏中LDLR蛋白水平极显著低于野生型。另外,对克隆猪进行H.E.染色后发现其肝脏组织有明显的病理学变化,该结果说明,LDLR水平的急剧下降有可能是导致肝脏病变的原因。【结论】成功获得了人PCSK9基因D374Y突变体的克隆猪;与野生型猪肝脏相比,克隆猪肝脏中LDLR水平显著降低,并且克隆猪肝脏发生了明显病变。     

PiggyBac Transposon Mediated Efficient eGFP Expression in Porcine Somatic Cells and Cloned Embryos

PiggyBac transposon has demonstrated its long-term and stable transposition on genomes of various species but lacking of the evidence on farm animal genomes. In this study, we constructed a piggyBac tr...