抗源蛋白质在植物基因工程中的应用

近十年来,随着植物分子生物学技术的快速发展,植物抗病基因工程已成为热门课题,例如抗真菌病害基因工程、抗细菌病害基因工程和抗病毒病害基因工程等。在抗真菌病害基因工程中,研究最多的是两种抗真菌病原蛋白质———几丁质酶和β-１,３-葡聚糖酶以及将两种蛋白基因导入作物,通过基因表达产生几丁质酶或葡聚糖酶,达到防治真菌病害的目的。一、几丁质酶和β-１,３-葡聚糖酶的生化特性几丁质酶和β-１,３-葡聚糖酶通常都是纯蛋白,几丁质酶的分子量在２５～４０ＫＤａ之间,β-１,３-葡聚糖酶的分子量为３２～３７ＫＤａ。它们和其他蛋白质一样…     

枯草杆菌B18菌株酶类抑菌物质分析研究初报

报道了枯草杆菌B18菌株在人工培养条件下可分泌产生几丁质酶和β—1，3葡聚糖酶。植物真菌病害防治研究中，几丁质酶、β—1，3葡聚糖酶已被证明为具有抗病能力的防御酶，可以分解病原真菌细胞壁，杀死病原菌从而达到防病目的。通过对枯草杆菌B18菌株代谢产物中儿丁质酶β—1，3葡聚糖两生化测定，证实了该菌株在人工培养条件下能够产生具有活性的几丁质酶和β—1，3葡聚糖酶这两种两类，为该菌株抗菌机理提供了理论依据。     

重组毕赤酵母表达棘孢木霉几丁质酶gene02524的酶学性质及抑菌活性

几丁质酶是催化降解几丁质的水解酶,在防治植物真菌病害与虫害方面的应用越来越广泛,是一种重要的生防蛋白。棘孢木霉TD3104是一株优良的植物病害生防菌,几丁质酶在抑菌防病过程中发挥重要作用。为克隆表达棘孢木霉TD3104几丁质酶基因gene02514,明确酶学性质和抑菌活性,利用毕赤酵母表达系统对目的蛋白进行表达,并通过SephadexG-100凝胶进行纯化,对序列进行分析并研究其酶学性质及进行体外抑菌试验。本研究成功地构建了pPIC9K/gene02524重组载体,并且经过比对发现其包含GH18家族的特征氨基酸序列,获得了毕赤酵母转几丁质酶基因工程菌,表达的重组几丁质酶表观分子量44.4 ku,K_m=2.048 2 g/L,V_max=0.635 5×10³μmol/（L·min）,最适反应温度为50℃,最适pH值为5.0,在pH值为3.5时稳定性最高;金属离子Cu²⁺、Hg²⁺可强烈抑制酶活性;可抑制金黄壳囊孢菌等病原真菌的生长。研究结果为解析棘孢木霉几丁质酶在生防中的作用及功...     

西洋参和人参病原真菌菌体对放线菌2种水解酶的诱导

【目的】研究特定拮抗放线菌对西洋参人参土传病害病原真菌的接触抗菌机理。【方法】以5株西洋参、人参土传病害病原真菌菌体为惟一碳源,用液体培养及3,5二硝基水杨酸（DNS）法研究5株供试病原真菌对9株拮抗放线菌几丁质酶和纤维素酶合成的诱导作用;采用搭片法,观察9株拮抗放线菌与5株供试病原真菌菌丝间的相互作用。【结果】①以5株病原真菌菌体为惟一碳源时,可诱导9株拮抗放线菌合成几丁质酶和纤维素酶;9株放线菌的几丁质酶和纤维素酶活性分别为7.17～11.58和6.14～21.20 U,其中西洋参恶疫霉菌体对9株放线菌几丁质酶、纤维素酶合成的诱导作用强于其他病原真菌;②拮抗放线菌Act11、Act13、Act24及D141的菌丝与供试病原真菌菌丝接触时,对西洋参锈腐病菌、人参锈腐病菌菌丝有明显的溶解作用。【结论】以5株供试病原真菌菌体为惟一碳源时,可诱导9株拮抗放线菌合成几丁质酶和纤维素酶;供试拮抗放线菌与西洋参病原菌接触时的抗菌作用,是通过放线菌产生几丁质酶和纤维素酶,破坏细胞壁,使病原真菌菌丝溶解的方式完成的。     

Pi-ta+和Bchi基因双价表达载体构建及水稻的遗传转化

稻瘟病是水稻上最重要的病害之一.本研究所用Pi-ta+基因是一个来自景洪直立型紫秆普通野生稻的基因,该基因属于稀有的抗稻瘟病Pi-ta+等位基因,具有抗稻瘟病的能力;几丁质酶是一种以几丁质为底物的水解酶,它可以降解病原真菌细胞壁中的几丁质,破坏细胞新物质的沉积使病原体死亡.为获得抗稻瘟病的水稻新材料和进一步培育聚合多个抗稻瘟病基因的转基因水稻新品种,本研究采用一种新的方法构建了Pi-ta+和Bchi的双价表达载体pCAMBIA1300-Pi-ta+-Bchi,通过农杆菌介导法转入栽培稻品种云资粳41中,经过一定浓度的甘露糖筛选培养,分化得到的再生苗经氯酚红显色法和PCR检测,获得11棵转基因阳性植株,离体检测证明外源基因的导入增强了转基因水稻的稻瘟病抗性.     

几丁质酶基因和β-1,3-葡聚糖酶基因克隆微生物表达和抑菌效果研究

采用PCR扩增的方法,扩增获得几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶的基因,分别将其基因克隆到原核表达载体pET28a(+)上,构建了原核表达载体pETChi和pETGlu。经IPTG诱导后几丁质酶基因和β-1,3-葡聚糖酶基因在大肠杆菌BL21中得到高效表达。通过对连孢(Alternaria alternate)的抑菌实验表明,这两基因的表达产物对此真菌有较强的抵抗能力。     

西洋参和人参病原真菌菌体对放线菌2种水解酶的诱导

【目的】研究特定拮抗放线菌对西洋参人参土传病害病原真菌的接触抗菌机理。【方法】以5株西洋参、人参土传病害病原真菌菌体为惟一碳源,用液体培养及3,5二硝基水杨酸(DNS)法研究5株供试病原真菌对9株拮抗放线菌几丁质酶和纤维素酶合成的诱导作用;采用搭片法,观察9株拮抗放线菌与5株供试病原真菌菌丝间的相互作用。【结果】①以5株病原真菌菌体为惟一碳源时,可诱导9株拮抗放线菌合成几丁质酶和纤维素酶;9株放线菌的几丁质酶和纤维素酶活性分别为7.17~11.58和6.14~21.20 U,其中西洋参恶疫霉菌体对9株放线菌几丁质酶、纤维素酶合成的诱导作用强于其他病原真菌;②拮抗放线菌Act11、Act13、Act24及D141的菌丝与供试病原真菌菌丝接触时,对西洋参锈腐病菌、人参锈腐病菌菌丝有明显的溶解作用。【结论】以5株供试病原真菌菌体为惟一碳源时,可诱导9株拮抗放线菌合成几丁质酶和纤维素酶;供试拮抗放线菌与西洋参病原菌接触时的抗菌作用,是通过放线菌产生几丁质酶和纤维素酶,破坏细胞壁,使病原真菌菌丝溶解的方式完成的。     

几丁质触发植物免疫的研究现状与展望

真菌病害是植物病害中最为严重的一种,世界上70%—80%的植物病害都是由真菌引起。几丁质是病原真菌细胞壁的重要组成成分,是一种典型的病原相关分子模式（pathogen-associated molecular pattern,PAMP）。当植物受到病原真菌入侵,位于细胞膜上的模式识别受体（pattern recognition receptor,PRR）能够直接与几丁质及其寡糖相互作用并触发植物的免疫反应。近几年,随着植物几丁质受体的成功鉴定,其与几丁质的相互作用机制以及几丁质触发植物免疫的分子机理被广泛研究,并取得了许多重要进展。为了较全面、系统地反应几丁质触发免疫研究的历史沿革、研究现状和发展趋势,笔者就植物对几丁质的识别机制、信号转导以及病原真菌对几丁质触发的免疫反应的抑制机制这3方面进行了综述,并对未来研究的发展方向进行了探讨。     

植物几丁质酶及其基因工程研究进展

几丁质酶是广泛存在于微生物和植物体内的一类蛋白质,它能催化真菌细胞壁的重要成分———几丁质的水解,从而抑制真菌的生长增殖,提高植物的抗真菌能力。近年来,随着对其作用机理、生化性质、表达调控的深入研究,用几丁质酶基因转化植株正日益成为植物防御真菌病害的...     

华山松疱锈病的重寄生真菌(深绿木霉)中几丁质酶基因cDNA片段的克隆

[目的]分离深绿木霉S5003中的几丁质酶基因,为获得高抗病的转基因植株奠定基础。[方法]采用华山松疱锈病的锈孢子壁作为诱导物,诱导深绿木霉SS003中几丁质酶基因的表达,并通过lit—PER方法扩增得到几丁质酶基因片段。[结果]锈孢子壁可诱导出高活性（40．17μg／10min）的几丁质酶,PCR扩增得到了长度为834bp的特异片段,经序列测定及分析显示该片段为几丁质酶基因片段。[结论]深绿木霉SS003的几丁质酶基因片段的获得,为分离全长基因以及进一步利用该基因生产几丁质酶以及进行基因转化提供了可能。     

转水稻几丁质酶基因烟草植株及其对烟草赤星病(Alternaria alternata)的抗性

通过根癌农杆菌 (Agrobacteriumtumefaciens)介导 ,将水稻几丁质酶基因导入烟草 (Nicotianatabacum)栽培品种中 ,并得到转基因植株。导入的 3个基因即nptⅡ、bar和几丁质酶基因在子一代以近 3∶1的比例分离。表达水稻几丁质酶的子一代转基因烟草表现出对烟草赤星病病原真菌 (A .alternata)的抗性。     

酵母SOD1基因缺失突变体应答真菌细胞壁抑制剂CFW的转录组学分析

以酿酒酵母为研究材料,采用酵母全基因组表达谱芯片,分析超氧化物歧化酶SOD1基因缺失(sod1Δ)对酵母细胞应答真菌细胞壁抑制剂钙荧光白(CFW)全基因组转录表达谱的影响,为揭示植物病原真菌细胞壁调控机制以及植物抗真菌基因工程改造提供新的理论基础。结果表明:CFW(10μg/m L)处理1 h后,与野生型酵母细胞相比,sod1Δ酵母细胞中211个基因发生了显著差异表达(97个基因表达上调、114个基因表达下调)。随机选取5个差异表达基因采用定量PCR验证,结果与芯片分析结果一致。差异表达基因功能主要涉及细胞壁、细胞代谢、蛋白质合成、细胞防御以及大量功能未知蛋白。以上结果表明,SOD1基因缺失可显著改变酵母细胞应答真菌细胞壁抑制剂CFW胁迫的全基因组转录表达谱。     

植酸酶基因工程研究进展

植酸酶在动物、植物和微生物的磷代谢中起着重要作用,近年来随着真菌基因工程和植物基因工程研究的发展,已克隆出10多个真菌的植酸酶基因,并利用构建基因工程菌的方法,大大提高了微生物生产植酸酶的效率。通过转基因方法,目前已经成功地将几种真菌植酸酶基因转到水稻、玉米等作物中,通过特异表达提高了转基因作物自身植酸酶含量。本文从真菌基因工程和植物基因工程2个方面综述了植酸酶研究取得的进展,并比较和分析了植酸酶植物基因工程和真菌基因工程各自的优缺点。     

昆虫几丁质合成关键酶功能及其RNAi技术在害虫防治中的研究进展

几丁质对昆虫的生长发育至关重要,且不存在于植物和哺乳动物中,因此其合成途径的关键酶是较为理想的杀虫剂靶标。近年来,多种害虫的几丁质合成关键酶基因被克隆和鉴定,通过RNAi技术应用于一些重要害虫的防治研究工作中。本文较为系统的总结了近些年害虫几丁质合成关键酶的基因克隆及功能研究进展,重点阐述了几丁质合成酶、海藻糖酶基因基于RNAi技术应用于害虫防治取得的研究进展,分析了RNAi技术通过转基因植物表达dsRNA（RNAi抗虫作物）以及作为核酸农药（dsRNA）直接进行作物喷施的两种应用途径,文章最后还探讨了RNAi在害虫防治中面临的主要瓶颈问题以及主要应对策略。上述较为系统的归纳和总结,目的是为今后基于几丁质合成关键酶的RNAi技术应用于害虫绿色防控研究提供有价值的理论指导。     

转几丁质酶基因毛壳菌的抗病原真菌作用

含有来自绿色木霉Trichoderma viride 的内切几丁质酶基因chbi的真菌表达载体pECHBI,通过原生质体转化将该基因导入球毛壳菌Chaetomium globosum CG12菌株,内切几丁质酶活性的测定结果表明,1/5的CG12转化子的内切几丁质酶活性得到了明显提高,PDA平板测定证实毛壳菌转化子对9种病原真菌具有拮抗能力,其中4株转化子的拮抗能力被显著提高.     

山腊梅几丁质酶基因的克隆及其植物表达载体的构建

本研究利用RT-PCR技术扩增山腊梅几丁质酶基因,对几丁质酶基因的序列进行生物信息学分析,同时成功构建植物表达载体,为植物几丁质酶基因功能的研究提供理论基础。     

几丁质酶基因在植物抗真菌病基因工程中的应用

真菌病害是影响农作物生长的主要病害。随着生物技术的发展,利用转几丁质酶基因等方法防治真菌病害已被广泛使用。本文从几丁质酶功能、生化特性、防治真菌病害的基础、植物几丁质酶的研究历史和进展以及今后关于几丁质酶的研究动向进行了简要的综述。     

抗辣椒白绢病致病菌的钩状木霉中几丁质酶诱导表达分析

木霉是通过重寄生作用对白绢病源进行抑制的,其中产生作用的就包括重要的几丁质酶基因[1],在全基因组测序和数据分析之后,几种木霉的预测片段中都发现有类似内切几丁质酶基因片段存在。利用白绢病原菌的细胞壁诱导培养,一方面检测其酶活性,另一方面根据经过确认的钩状内切木霉几丁质酶基因保守片段设计引物,用Trizol法提取钩状木霉中的RNA并进行半定量RT-PCR检测,发现几丁质酶的表达量在抑制效果强的13号菌中有显著体现。说明内切几丁质酶是主要的抗性来源之一,预测为其上游序列中调控序列影响其表达活性有待进一步研究证明。     

真菌多聚半乳糖醛酸酶的研究进展

真菌多聚半乳糖醛酸酶是植物细胞壁果胶的主要降解酶之一,是植物病原真菌的重要致病因子.综述了多聚半乳糖醛酸酶的特性、多聚半乳糖醛酸酶基因及其特征、多聚半乳糖醛酸酶的分子进化、多聚半乳糖醛酸酶的表达调控及其在真菌致病过程中的作用.     

产几丁质酶木霉生防菌株的生化测定

以烟草赤星病的CA原真菌链格孢（Alternaria alternata）为实验菌株，通过对峙平板拮抗实验和胶体几丁质平板透明圈实验测定木霉菌株（Trichoderma harziaum）THS-1对病原真菌的拮抗作用，结合DNS法进行定量检测木霉菌株发酵产生几丁质酶的活性。上述方法的结合可以筛选出产几丁质酶高效木霉生防菌株。