‘镇稻88’和‘徐稻3号’苗期蛋白质表达谱的比较研究

为了阐明高抗条纹叶枯病水稻品种抗病性的分子机理,以江苏省高抗条纹叶枯病粳稻品种‘镇稻88’和‘徐稻3号’为研究材料,应用双向电泳联用质谱技术对2种水稻苗期蛋白质表达谱的特点及差异进行比较,并对差异蛋白进行了鉴定以及分析归类。结果表明：2个水稻品种的蛋白图谱上均检测到大约1000个蛋白点,这些蛋白点主要分布在等电点为4~7,分子量为10~100 kDa的范围内。用ImageMaster 2D Platinum软件分析后发现,2个水稻品种间共存在7个差异蛋白点,在‘徐稻3号’中表现为下调表达。质谱分析共鉴定出6种蛋白,这些蛋白包括能量相关蛋白、代谢相关蛋白、防御相关蛋白和未知功能蛋白。     

盐溶蛋白鉴定玉米纯度的图谱分析

玉米种子纯度盐溶蛋白电泳是根据品种间蛋白质组成的差异来鉴定种子纯度。品种间差异在电泳结果上就是蛋白质图谱的差异。熟练、准确掌握图谱分析技术,对于快速、准确鉴定种子纯度有重要意义。我们经过几年的大量实验总结,积累了一些经验,供同行借鉴。1玉米盐溶蛋白电泳谱带区域的划分玉米盐溶蛋白电泳谱带可根据分子量大小划分为三个区域:α区、β区、γ区。α区为小分子量蛋白质所组成;β区为中分子量蛋白质所组成;γ区为高分子量蛋白质所组成,β区为主要谱带区域,在该区域中蛋白质谱带数量多,染色深,品种间差异大,为纯度鉴定中主要应用区…     

不同浓度铅胁迫对向日葵幼苗蛋白质结构和表达的影响

为揭示向日葵抗铅胁迫的分子机理,采用傅立叶红外光谱分析法和双向电泳法探讨向日葵试材HA89的幼苗在不同浓度(0,400,800 mg/L)铅胁迫条件下蛋白质水平发生的变化。结果表明:向日葵幼苗根、茎、叶的蛋白质二级结构中的β-折叠结构和无规则卷曲结构对铅胁迫最为敏感,同时,根据1 655 cm~(-1)/1 637 cm~(-1)比值可看出向日葵幼苗蛋白在铅胁迫浓度为400 mg/L时蛋白质二级结构较为稳定,超过这一浓度到800 mg/L时,蛋白二级结构则趋于松散;试验采用Tris酚提取法提取试验材料全蛋白,经双向电泳分析后发现差异蛋白点9个。经双向电泳分析后匹配完全相同蛋白点数65对,差异倍数为2倍以上的9个,根据蛋白点的等电点和分子量对照蛋白库对比后,推测变化较为显著的蛋白是与感应有关的激酶。     

荞麦籽粒蛋白质组分特性研究

采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)方法研究了荞麦的2个栽培种苦荞与甜荞的总蛋白、清蛋白、球蛋白及谷蛋白特性。试验结果表明,甜荞籽粒总蛋白及蛋白质各组分的谱带具有丰富的多态性,而苦荞籽粒总蛋白及蛋白质各组分谱带的多态性有限;荞麦清蛋白主要由低分子量的亚基构成;甜荞球蛋白组分包含由中等到低分子量范围的5~12种亚基,苦荞球蛋白主要由8种亚基组成;甜荞谷蛋白主要由分子量在43~66.2 kDa之间的3~5种亚基组成,苦荞谷蛋白主要由分子量在31~43 kDa间的2种亚基组成。     

玉米叶片2种总蛋白质提取方法的比较

为比较不同方法提取的玉米叶片蛋白质对双向电泳效果的影响。采用TCA-丙酮沉淀和TRIzol试剂盒2种方法,提取国审玉米品种郑单958叶片全基因组蛋白质,并对提取的蛋白质样品进行双向电泳。结果表明:TCA-丙酮方法提取的蛋白质一向水平聚焦电压上升缓慢且达不到程序设置的电压,而TRIzol试剂盒方法实时监测图与程序设置图相吻合;对电泳胶图分析后可知,TRIzol试剂盒法分离出的蛋白点多于900个,低丰度蛋白质得到充分显现,大多数蛋白点分子量为20~80 k Da,p H值为4~7,蛋白点的形状较规则;TCA-丙酮沉淀法分离出的蛋白点仅有350个,表明样品中蛋白质分离种类较少,高丰度蛋白质过度显现,低丰度蛋白质检出率大大降低。     

黄曲霉毒素B_1胁迫相关小鼠肝脏线粒体蛋白的初步研究

为了加强经黄曲霉毒素B1感染后肝脏线粒体差异表达蛋白的检测,以助于预防中毒的爆发和扩散,以黄曲霉毒素感染小白鼠,10周后提取小白鼠的线粒体蛋白,通过蛋白质双向电泳技术研究黄曲霉毒素对小鼠线粒体蛋白组差异表达的影响。双向电泳结果发现有31个蛋白质点发生显著变化,其中有新出现或明显上调的7个蛋白质点以及缺失的或明显下调的6个蛋白质点。这些点大多处于5.2~9.0pI值范围内,分子量处于8~165ku之间。据此推测,毒素可能通过改变这些蛋白表达量,从而影响线粒体的功能,进而对小鼠产生毒性作用。     

草原龙胆雄蕊发育特定阶段差异蛋白质组学的初步研究

在高等植物发育过程中,会发生许多形态学和生理学特征上的改变。为了更好地研究草原龙胆特定发育阶段雄蕊内蛋白质组的差异,以草原龙胆栽培品系49号为试材,利用荧光差异双向电泳技术(2D-DIGE)研究了草原龙胆孢原细胞与小孢子母细胞的差异表达蛋白质组,分析了差异表达蛋白质在草原龙胆雄蕊发育过程中的可能作用。结果表明:利用De Cyder软件分析获得了72个主要差异蛋白质点,其中表达上调点为35个,表达下调点为37个。使用MALDI-TOF-TOF质谱仪对胶上消化后的差异蛋白点进行质谱分析,可信度达到90%以上的蛋白质点为15个,分别为5-甲基四氢蝶酰三谷氨酸高半胱氨酸甲基转移酶、S-腺苷甲硫氨酸合成酶、33 kDa光系统Ⅱ放氧复合体、核酮-1,5-二磷酸羧化酶、质体分裂环状蛋白、34 kDa的线粒体外膜膜孔蛋白、70 kDa热激蛋白、磷酸甘油酸激酶、蛋白水解酶复合体β6型亚单位、天冬氨酸蛋白酶、对ATP和Zn~(2+)依赖型金属蛋白酶和未知功能蛋白等。因此,在草原龙胆雄蕊发育的特定阶段由于蛋白质组的差异表达,导致雄蕊在形态学和生理学特征上发生改变。     

小麦生理型和遗传型雄性不育系及其保持系小花完整叶绿体蛋白质组分比较研究

采用固相pH梯度SDS聚丙烯酰胺双向凝胶电泳技术,以小麦遗传型雄性不育系ms(S)-1376、杀雄剂SQ-1诱导的生理型雄性不育系ms(A)-1376,以及对应的保持系(A)-1376 (杀雄剂诱导前的正常可育系)所构建的等基因和等生理差异系为试材,比较分析了2种分离纯化完整叶绿体的方法。在确立了一套适用的技术方法的基础上,研究了三者在花粉小孢子萌发单核早期小花完整叶绿体蛋白之间的差异。采用30%、45%和60%的不连续蔗糖密度梯度离心的方法能够获得完整且纯度较高的叶绿体,经TCA-丙酮提取蛋白质后,PDQuest软件分析,在分子量14.4~66.2 kD,等电点4~7的线性范围内可分辨出2-DE图谱上239个较为清晰的蛋白质点,对其中的6个差异表达蛋白质点进行MALDI-TOF肽质量指纹图谱分析,从生物信息学数据库检索鉴定出6个差异蛋白质点分别是酰基辅酶A脱氢酶结构域蛋白、钙调结合蛋白磷酸酶、多催化功能肽酶、热休克蛋白60、光受体蛋白2及1个未知功能的表达蛋白质。这些蛋白质在供试小麦叶绿体物质能量代谢、叶绿体防卫抵御机制、叶绿体细胞内信号转导及植物极性生长等生理应答反应中起调控作用,它们能在本研究供试两不育系和对应可育系中差异表达,可能与雄性不育相关。     

甘蓝型油菜蛋白质双向电泳体系的建立

选用油菜品种08127,采用TCA-丙酮提取方法,pH 4~7胶条和改进的IEF聚焦程序,得到较好的蛋白质双向电泳结果,建立了一种适合甘蓝型油菜的双向电泳体系;利用其他甘蓝型油菜品种的幼苗、叶片和茎中的蛋白检验了建立的实验体系,都能得到较好的蛋白质双向电泳结果;利用该实验体系比较甘蓝型油菜幼苗不同发育时期蛋白质双向电泳图,找到二者之间的差异点,选取部分点成功进行了质谱分析。     

不同抗冷级别的棉苗低温诱导蛋白比较

通过蛋白质双向电泳和质谱技术,对低温前后不同抗冷级别的棉花品种锦3047和410的蛋白质组进行了比较分析。结果表明:⑴不同品种的棉苗蛋白质组有明显差异,锦3047在pH4~7条件下的棉苗子叶蛋白表达图谱中发现50个蛋白点在低温胁迫前后的表达量有明显差异。⑵其中30个点在低温前后均有表达,低温处理后,有19个蛋白点的丰度值变大,且抗冷性较强的锦3047绝对丰度明显高于抗冷性较弱的410;11个蛋白点的丰度值变小,锦3047的绝对丰度低于410。⑶锦3047特有8个蛋白点表达量上升,而在410中几乎不表达。⑷对入选的锦3047的差异蛋白点进行质谱分析,并通过数据库检索进行蛋白质鉴定,得到了其中30个蛋白的完整肽指纹图谱。其中逆境蛋白占20%,这些蛋白的表达可能对锦3047的抗冷性具有重要作用。     

大麦籽粒总蛋白含量及醇溶蛋白含量的差异性研究

为研究大麦籽粒总蛋白含量及醇溶蛋白的差异性。以来源不同的38份大麦品种为材料,采用FOSS凯氏定氮仪测定其籽粒总蛋白和醇溶蛋白含量,利用SDS-PAGE凝胶电泳技术分析参试材料醇溶蛋白带型。对参试材料的籽粒总蛋白含量、醇溶蛋白含量及醇溶蛋白带型的差异性和遗传多样性分析表明:38份大麦品种的总蛋白含量和醇溶蛋白含量的遗传差异显著,醇溶蛋白含量与总蛋白含量呈极显著正相关。根据醇溶蛋白含量将参试材料聚为3类;38个大麦品种SDS-PAGE凝胶电泳共分离出12条迁移率不同的条带,根据电泳谱带将共参试材料聚为构成18种类型,不同类型大麦品种数量差异较大。本研究为适宜蛋白质含量与醇溶蛋白含量大麦品种的选育提供了依据。     

烟草细胞质雄性不育系及其保持系的花蕾差异蛋白质分析

为探讨烟草雄性不育的分子遗传机理,对烟草细胞质雄性不育系和保持系进行差异蛋白质组学研究。采用固相pH梯度SDS-PAGE双向电泳,对烟草细胞质雄性不育系MSK326及其保持系K326雄蕊原基分化期、四分体时期及单核时期花蕾蛋白质进行分离,经考马斯亮蓝染色,获得了分辨率和重复性较好的双向电泳图谱。使用PDQuest软件分析蛋白质图谱,利用基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱分析,然后用Mascot软件对NCBInr数据库搜索。在分子量14.4~97.6 kD、等电点4~7线性范围内,检测到约365个蛋白点,其中7个蛋白质点在保持系中出现, 在不育系中缺失,分别被鉴定为核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶、多酚氧化酶、Patatin homolog蛋白、PSI 9 kD蛋白4类蛋白,推测不育系MSK326雄性不育性可能与营养代谢紊乱、间接抑制雄性器官发育、养分供给不足、免疫能力低和能量转移受到抑制等有关。     

水稻种子蛋白双向电泳方法的建立和质谱初步分析

为了建立适用于水稻(Oryza sativa L.)种子蛋白质组分析的双向电泳方法,本研究比较了三氯乙酸/丙酮法和改良的酚提取法对水稻种子蛋白的提取效果,不同蛋白提取液上样量、不同p H梯度(p H 3~10和p H 4~7)IPG胶条对水稻种子蛋白的分离效果。结果表明:在目前的双向电泳体系下,采用改良的酚提取法,24 cm p H 4~7线性IPG胶条,上样量1 200~1 500μg的条件可以获得分辨率高、重复性好、胶内蛋白点适用于后续质谱分析的双向电泳图谱。最后本实验通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF-MS)对10个随机挑选的胶内蛋白质点进行了初步蛋白质鉴定分析,进一步确定了改良的酚提取法可以适用于水稻种子蛋白质双向电泳分析。     

籽粒苋根系蛋白的提取与双向电泳体系的建立

本研究以籽粒苋根为试验材料,比较3种不同蛋白提取方法对蛋白质双向电泳的影响,并对其中的蛋白上样量和等电点聚焦时间进行了优化。结果表明:与酚抽提法和TCA-丙酮法相比,Tris-Hcl法提取籽粒苋根系蛋白效果较好;上样量800μg和聚焦时间70 000 Vh的条件下会得到理想的双向电泳图谱。采用优化后的条件,可以得到蛋白点数量多、背景清晰的双向电泳图谱,将为下一步镉胁迫下籽粒苋根系蛋白质组学研究及利用分子育种技术培育耐镉的籽粒苋新品种提供技术资料。     

盐胁迫下棉花叶片差异蛋白表达的分析

以耐盐的陆地棉品种中07为研究材料,在其生长的三叶期,用未处理和0.4%NaCl胁迫处理24h的幼苗,分别提取其叶片全蛋白。通过等电聚焦和第二向SDS-PAGE技术获得完整的棉花叶片总蛋白图,利用ImageMaste-2DElite5.0软件分析各个差异蛋白在对照和0.4%NaCl胁迫24h后棉花叶片中的相对表达量,并选取质量好、实验重复性高的10个特异的差异表达蛋白质点进行基质辅助激光解吸电离串联飞行时间质谱(MALDI-TOF-TOF/MS)鉴定。结果表明,从对照和盐胁迫处理的双向电泳图谱中共检测到24个差异蛋白质点,这些差异蛋白质点的等电点分布集中在5.0～6.5之间,分子量分布集中在40.0～110.0kD之间;进一步质谱(MALDI-TOF-TOF/MS)分析鉴定的10个差异蛋白质点,其中4个蛋白质点获得了鉴定结果,这4个差异表达蛋白质点分别为1,5-二磷酸核酮糖羧化/氧化激酶α2(编号4)、1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/氧化酶大亚基(编号5)、未知蛋白产物(编号19)和OEE2(编号32)。我们初步推测OEE2和1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/氧化酶可能与棉花耐盐胁迫特性有关。     

双向电泳联用质谱技术研究棉苗对细极链格孢菌蛋白激发子诱导的应答

 采用双向电泳和质谱技术分析了细极链格孢菌蛋白激发子对棉苗诱导的全蛋白质组,建立二者间的差异表达图谱,并对差异蛋白进行了鉴定及分析归类。结果表明,蛋白质分子质量在10～100 kD之间、等电点3～10范围内,每块胶分离到约600个蛋白质点。得到了大约53个差异蛋白点,其中有31个为上调蛋白,22个为下调蛋白。对PEAT诱导后表达量明显增加的 7个上调蛋白点用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)进行肽质量指纹谱的分析,并通过检索不同的数据库进行蛋白质鉴定与功能预测,获得了4个蛋白的肽质量指纹图谱,经数据库检索鉴定分析,GH-1、GH-3、GH-6推测为核酮糖1,5-二磷酸羧化酶基因家簇,GH-7推测为-S-腺苷一蛋氨酸合成酶。     

玉米籽粒蛋白质双向电泳技术体系的优化

为了获得玉米籽粒双向电泳中蛋白质提取的最佳方法,建立最佳的玉米籽粒蛋白双向电泳技术体系,对酚抽提法、三氯乙酸/丙酮沉淀法(TCA/丙酮沉淀法)和可溶性蛋白提取法3种不同提取方法得到的蛋白质进行了分析,并在相同条件下进行双向电泳比对分析,结果表明:可溶性蛋白提取法获得的蛋白纯度高、浓度适中、双向电泳蛋白质点最丰富,最适合双向电泳研究;利用可溶性蛋白提取法获得的蛋白,对第一向等电聚焦参数等条件,以及不同p H值范围的IPG预制凝胶条进行了比较分析,结果表明:采用p H值3~10的IPG预制凝胶条时,采取电压梯度上升的方式,总聚焦70 000 Vhs、上样量800μg效果最佳,采用p H值4~7的IPG预制凝胶条时,总聚焦80 000 Vhs、上样量900μg效果最佳,并且采用p H值4~7的IPG预制凝胶条相比p H值3~10的凝胶条能分离到更多的点,最后结合蛋白质点MALDI-TOF-TOF质谱鉴定分析,建立了一套适用于玉米籽粒的蛋白质双向电泳技术方法,即采用可溶性蛋白提取法提取蛋白,采用24 cm、p H值4~7的IPG干胶条,上样900μg电泳效果最佳,等点聚焦程序:500 V、1 h,1 000V、1 h,2 000 V、1 h,4 000 V、2 h,8000 V、4 h,8 000 V、80 000 Vhs,500 V保持。试验研究为后续玉米籽粒发育差异蛋白研究奠定了技术基础。     

水稻不同品种蛋白质亚基百分含量的差异性研究

摘 要：主要通过SDS-PAGE电泳检测方法,探讨水稻谷蛋白PB-II亚基和醇溶蛋白PB-I亚基含量的差异。试验结果表明,不同水稻品种的蛋白质亚基含量不同。龙粳8号的醇溶蛋白亚基含量为11.53%;富士光和松99-135的醇溶蛋白亚基含量为13.39%和13.61%,居同一水平,其谷蛋白亚基含量较高为72.87%和69.52%,是富含谷蛋白的PB-II蛋白质体;绥粳3号的醇溶蛋白亚基含量相对较高为15.25%。对水稻品种谱带进行13kDa单一亚基分析,绥粳3号和籼粳交的特优21在单一亚基分析中,其13kDa醇溶蛋白亚基含量明显高于其它几个品种。不同品种的13kDa醇溶蛋白亚基含量存在差异。     

甜菜双向电泳体系条件的优化

为了获得甜菜叶片双向电泳中蛋白质最佳提取方法,建立甜菜叶片蛋白质双向电泳最佳的双向电泳体系。以甜菜叶片为材料,通过比较分析,研究甜菜叶片总蛋白提取方法、IPG胶条pH值及其对应上样量等因素对甜菜叶片蛋白质双向电泳结果的影响。结果表明:酚提取法、TCA/丙酮提取法和可溶性蛋白提取法3种蛋白提取方法中TCA/丙酮法提取效果较好,pH值4~7与pH值5~8的双向蛋白电泳比较发现:pH值4~7胶条蛋白点清晰且在图谱上的蛋白点分布均匀,无蛋白点集中现象,更适合甜菜叶片的蛋白质组分析。采用7 cm线性固相IPG胶条进行双向电泳,150μg上样量蛋白点明显增多,双向电泳效果更好,pH值4~7的17 cm胶条300μg上样量胶点更多更清晰,试验结果为甜菜蛋白质组学的研究提供了最佳的试验方法。     

利用SDS-PAGE鉴定不同地区谷子籽粒醇溶蛋白差异

醇溶蛋白是谷子籽粒主要的贮藏蛋白,研究谷子醇溶蛋白的差异对于谷子品种选育及种质鉴定评价有重要的意义。本研究利用SDS-PAGE方法对来自不同省份的46份谷子材料进行醇溶蛋白谱带分析,结果表明,单个品种可分离出14~24条醇溶蛋白谱带,平均每个品种18.74条带,46份品种共分离出32条醇溶蛋白谱带,其中7条为共有带,25条为多态性带,多态性带数占分离出总带数的78.1%。根据迁移率大小将醇溶蛋白谱带分为A、B、C、D四个区段,四个区段内分别有6、16、15、4种带型。在B、C区段醇溶蛋白有较丰富的多态性,A、B区段弱带较多,C、D区段强带较多。醇溶蛋白分子量在13.0~55.0 kDa之间,在29,25 kDa(第23条带)、22.5 kDa(第26条带)、17.5 kDa(第28条带)位点附近醇溶蛋白表达丰富且品种之间存在较大差异。品种之间醇溶蛋白谱带存在较大的差异,可作为品种鉴定与评价的重要依据。聚类分析表明,在GD值为0.45时,46个品种可以分为5类,其中34个品种聚为一类,其他四类所包含的材料较少,这表明大部分材料醇溶蛋白相似度较高。