光皮桦EST-SSR PCR反应体系的优化

为获得稳定的聚合酶链式反应（PCR）产物,采用正交设计L25（56）对光皮桦Betula luminifera表达序列标签-简单重复序列聚合酶链式反应（EST-SSR PCR）反应体系中的5个因素:DNA模板浓度,引物浓度,镁离子（Mg2+）浓度,三磷酸碱基脱氧核苷酸（dNTPs）浓度和DNA聚合酶量进行优化,每个因素设计5个水平。优化试验结果表明:光皮桦EST-SSR最佳PCR反应体系:4.0 mgL－1DNA模板,0.500 molL－1引物,1.250 mmolL－1 Mg2+,0.250 mmolL－1 dNTPs,0.072 5 16.67 mkatL－1 rTaq酶。通过梯度PCR试验筛选得到相应引物的最佳退火温度。对优化出的EST-SSR PCR反应体系进行稳定性检测,结果均能获得稳定、清晰可辨的DNA谱带。图6表3参15     

石蒜属植物种质资源ISSR-PCR反应体系的建立

为进一步开展石蒜属Lycoris植物种质资源遗传多样性研究,利用正交试验设计的方法,从Taq酶、Mg2 、模板DNA、dNTP和引物等5因素4水平,对石蒜属植物ISSR(intersimple sequence repeats)反应体系进行优化,确立了石蒜属植物ISSR的最佳反应体系:在20μL反应体系中,含1×Buffer,模板DNA 50 ng,2.5 mmol.L-1氯化镁(MgCl2),0.15 mmol.L-1dNTP,25.05 nkatTaq聚合酶,0.5μmol.L-1引物。进一步进行梯度退火试验,确定最适宜退火温度为57℃。图7表2参23     

木薯SCoT-PCR反应体系优化及引物筛选

【目的】优化木薯SCoT-PCR反应体系并进行SCoT引物筛选,为木薯辅助育种提供技术支持。【方法】以木薯品种新选048为材料,利用正交试验设计对DNA模板量、Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度、Taq DNA聚合酶量等因素进行优化,确定木薯最佳SCoT-PCR反应体系,并用其进行SCoT引物筛选。【结果】木薯最佳SCoT-PCR反应体系(20.0μL):模板DNA 60 ng,引物浓度0.30μmol/L,TaqDNA聚合酶1.5 U,Mg2+1.50 mmol/L,dNTPs 0.25 mmol/L。利用该体系筛选出19条SCoT引物,能稳定扩增出数量多、清晰可辨且多态性丰富的条带。【结论】优化的木薯SCoT-PCR反应体系检测结果稳定,重复性好,且筛选出的19条引物均适用于木薯遗传多样性分析。     

制干辣椒SCoT-PCR体系优化及引物筛选

[目的]优化制干辣椒SCoT-PCR反应体系,为新疆制干辣椒种质资源、分子遗传学研究奠定基础.[方法]以制干辣椒为材料,采用L25(55)正交设计方法对影响制干辣椒SCoT-PCR反应体系的Mg2+、模板DNA、引物、DNA聚合酶、dNTPs等因素进行优化筛选.[结果]从25个正交设计组合中筛选获得5个组合的扩增效果较好,扩增条带丰富且清晰度适中、分散性好;经引物SC-12、SC-13、SC-19筛选,获得适用于制干辣椒材料的SCoT-PCR最佳反应体系20.0 μL,包含10×Buffer 2.0 μL、30 ng模板DNA 0.8 μL、2.0 mmol/L Mg2+ 1.8μL、1.0 μmol/L引物1.0 μL、1 U Taq DNA聚合酶0.4μL、0.25 mmol/L dNTPs 0.5 μL、ddH2O 13.5 μL.运用优化体系从80条引物中筛选出扩增条带清晰、多态性丰富的SCoT引物24条.[结论]优化的SCoT-PCR反应体系及筛选的引物可用于新疆制干辣椒种质鉴定、遗传图谱构建、遗传多样性的分析等.     

葛根SCoT-PCR反应体系优化及引物筛选

[目的]优化葛根SCoT-PCR反应体系,筛选适用于葛根的SCoT引物,为利用SCoT分子标记进行葛根种质资源鉴定、遗传多样性分析及分子标记辅助育种提供技术支持.[方法]采用正交设计对SCoT-PCR反应体系中的DNA模板量、dNTPs浓度、Mg2+浓度、TaqDNA聚合酶量和引物浓度5个因素进行优化,利用最佳SCoT-PCR反应体系筛选出适用于葛根的SCoT引物,并对该体系进行验证.[结果]最佳葛根SCoT-PCR反应体系20.00μL:DNA模板50.00ng,dNTPs 0.25mmol/L,Mg2+1.50mmol/L,引物0.80μmol/L,TaqDNA聚合酶0.50U.利用该体系从36条SCoT引物中筛选出35条可从葛根中扩增出清晰条带的引物.使用3条引物对18个葛根材料进行PCR扩增,PCR产物表现出良好的重复性、稳定性和丰富的多态性.[结论]建立的最佳葛根SCoT-PCR反应体系和筛选获得的35条SCoT引物可适用于葛根种质资种鉴定、遗传多样性分析、相关分子标记开发等研究.     

沉香属植物基因组DNA提取及SSR反应体系的优化

以白木香为材料,研究沉香属植物基因组DNA提取方法 ,并优化SSR-PCR反应体系。通过改良CTAB法提取白木香叶片基因组DNA,经电泳和吸光度检测。优化影响白木香SSR-PCR主要参数,确立适合沉香属植物的SSR-PCR反应体系和扩增条件:在20μL反应体系中,模板DNA、引物、Mg2+、dNTP和Taq DNA聚合酶等5种主要成分的最适浓度分别为2.5 ng/μL、1μmol/L、2 mmol/L、0.2 mmol/L、1.2 U;并用9份沉香属植物DNA样品对SSR-PCR反应体系验证,能扩增清晰条带。SSR优化系统的建立为进一步利用SSR分子标记技术进行白木香种群及不同地区沉香属种群遗传多样性研究提供基础。     

鸡血藤ISSR反应体系的建立与优化

为建立鸡血藤ISSR-PCR的优化反应体系,通过选用DNA模板量、Mg2+、Taq DNA聚合酶、d NTP、引物浓度等5个因素中各单因素的适宜浓度,利用正交试验方法,在5个因素4个水平条件下进行优化。结果发现,鸡血藤ISSR-PCR的最佳25μL PCR反应体系中含10×PCR buffer 2.50μL、DNA模板量70.00 ng、Mg2+1.50 mol/L、Taq DNA聚合酶1.50 U、d NTP 0.30 mmol/L,引物浓度0.35μmol/L。为鸡血藤种质资源遗传多样性的进一步研究奠定分子基础,也为同科属植物的种质资源遗传多样性研究提供参考。     

麻楝ISSR-PCR反应体系的建立及优化

模板DNA、引物、三磷酸碱基脱氧核苷酸（dNTPs）,镁离子（Mg2+）浓度、Taq DNA聚合酶的用量以及退火温度是影响简单序列重复区间扩增?鄄聚合酶链式反应（ISSR-PCR）的主要因素。以麻楝Chukrasia tabularis叶片基因组DNA为试验材料,系统地测试这6个因素对麻楝ISSR-PCR反应结果的影响。结果表明:最优的反应体系为20 L反应体系中含30 ng模板DNA,1.00 molL－1随机引物,0.15 mmolL-1dNTPs,2.50 mmolL－1 Mg2+,2.50 16.67 nkat Taq DNA聚合酶。最佳退火温度为56 ℃,ISSR-PCR反应程序为94 ℃预变性5.0 min,94 ℃变性45 s,56 ℃退火45 s,72 ℃延伸1.5 min,40个循环;72 ℃再延伸7.0 min,4 ℃保存。应用优化的ISSR-PCR反应体系对24份麻楝个体材料进行扩增,均能扩增出丰富稳定的条带。图8表1参27     

基于SCoT标记的胡椒属药用植物多样性分析

采用正交设计优化胡椒属药用植物SCoT-PCR反应体系,并运用SCoT分子标记对7种胡椒属药用植物31份样品进行遗传多样性研究。结果表明,胡椒属药用植物SCoT-PCR最佳反应体系：总体积20μL,其中10×Buffer 2.0μL,dNTPs 0.20 mmol/L,Mg²⁺ 1.5 mmol/L,引物0.4μmol/L,模板DNA 100 ng,Taq聚合酶2.5 U。扩增总条带数为68条,其中多态性条带为64条,多态性比率为94.12%。31份胡椒属药用植物个体间聚类分析结果显示,31份胡椒属样品划分为2个类群,6个亚群。SCoT可适用于胡椒属药用植物遗传多样性研究。     

甘蔗黑穗病菌SCoT-PCR反应体系优化与引物筛选

以甘蔗黑穗病菌(Sporisorium scitamineum)交配型菌株基因组DNA为模板,在单因素优化试验的基础上,采用L16(45)正交试验设计,对影响甘蔗黑穗病菌SCoT-PCR反应体系的Mg2+、dNTPs、引物、r Taq DNA聚合酶和模板用量5个因素进行优化,建立优化的甘蔗黑穗病菌SCoT-PCR反应体系:DNA模板12.50ng、dNTPs 0.17mmol/L、引物0.46μmol/L、Mg2+1.7 mmol/L、r Taq DNA聚合酶0.85U、1×Buffer(Mg2+free),总体积25μL。应用优化体系从30条SCoT引物中筛选扩增条带清晰且多态性丰富的10条引物,并利用这10条引物对10份地理来源和寄主来源不同的甘蔗黑穗病菌交配型菌株基因组DNA进行SCoT标记,结果共扩增出86条带,多态性比率为58.67%,平均每条引物扩增8.60条。UPGMA聚类分析结果表明:在遗传相似系数为0.75的水平上,可将10个菌株分为3类,聚类结果与菌株的地理来源有一定的相关性。     

无患子SRAP-PCR反应体系的优化

建立适合无患子Sapindus mukurossi的相关序列扩增多态性-聚合酶链式反应(SRAP-PCR)最佳反应体系,为研究无患子种质资源的遗传多样性、亲缘关系及遗传改良等奠定基础。以南平产的无患子叶片为材料,采用单因素法对体系中的DNA模板、镁离子、三磷酸碱基脱氧核苷酸(dNTPs),引物和TaqDNA聚合酶等5因素进行优化。确立了适合无患子SRAP的最佳反应体系(20μL):1×PCR缓冲液,50 ng模板DNA,2.0 mmol·L-1镁离子,0.2 mmol·L-1dNTPs,0.5×16.67 nkat(0.5 U)TaqDNA聚合酶,0.4μmol·L-1引物。利用该体系对12份无患子种源材料进行PCR扩增,获得了清晰、稳定的DNA谱带,说明优化后的体系适宜无患子地理种源的遗传多样性分析。     

割手密AFLP分子标记技术体系建立与优化

【目的】建立和优化割手密AFLP分子标记技术体系,为割手密遗传多样性分析、遗传图谱构建提供技术支持。【方法】以广西割手密GXS87—16、GXS85．30、GXS79—9、GXS96、GXS112、GXS212为材料,利用改良SDS法提取DNA,并用EcoR I和Mse I酶切,连接接头后,采用正交试验设计对影响预扩增反应和选择性扩增反应的主要成分如Mg^2＋、模板DNA、引物、dNTP、Taq聚合酶浓度进行优化。【结果】样品DNA用限制性内切酶＆0RI和MseI各3u于PCR仪过夜可完全酶切。经正交设计优化,较佳的预扩增体系包含0．4μL dNTPs（20mmol／mL）,1．6μLMg^2＋（25mmol／mL）,2．0μL EcoRI—P（5pmol／mL）,2．0IxLMseI-P（5pmol／mL）,1UTaq酶（1U／μL）,DNA模板稀释10倍;选择性扩增体系包含0．4μL dNTPS（20mmol／mL）,0．8μLMg^2＋（25mmol／mL）,1．0μL EcoR I—AAG（6pmol／mL）,1．0μL Mse I-CAG（6pmol／mL）,3U Taq酶（1U／μL）,DNA模板稀释20倍。以对优化反应体系扩增获得的PcR产物用5％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染后,可获得清晰的多态性指纹图谱。【结论】建立的割手密AFLP分子标记技术体系具有扩增条带清晰、多态性丰富的特点,可为构建割手密高密度遗传图谱提供技术支持。     

棉花DNA提取及优化SSR反应体系的建立和应用

对棉花DNA提取程序和SSR反应体系进行了研究。利用正交设计对模板DNA、引物、Taq酶和Mg^2＋浓度4种成分以3个梯度进行优化和选择,结果表明,最优反应体系为15μL,其中含有：10×Taq buffer 1．5μL、Mg^2＋（25mmol／μL）1．5肛L、dNTPs（25mmol／μL）2．0μL、引物（20pmol／μL）各2．0μL、Taq酶（2．0U／μL）0．15μL、DNA模板（25ng）3．0μL、ddH2O补至15μL。采用建立的反应体系,利用8对引物对3个品种进行扩增,6％的变性聚丙烯酰氨凝胶电泳检测结果显示该体系扩增结果清晰稳定。     

利用单因子和正交设计双重实验法优化鹧鸪茶RAPD-PCR反应体系

为了建立鹧鸪茶RAPD-PCR的优化反应体系,首先通过单因素试验选定其各影响因子比较适宜的浓度范围,再利用正交试验设计方法,对影响鹧鸪茶RAPD-PCR反应的5种因素进行四水平优化试验。并运用SAS软件对试验结果进行了分析,最后确定优化的RAPD-PCR反应体系为：10×Buffer缓冲液2.5 μL+Mg2+ 2.5 mmol/L + dNTPs 0.2 mmol/L + TaqDNA聚合酶1.5 U + S28引物0.48 mmol/L + 80 ng模板,定容至25 μL。PCR扩增程序为：94℃预变性4 min,然后按94℃变性30 s,38℃退火45 s,72℃延伸120 s,进行45个循环,最后72℃延伸10 min;16℃保存。该优化的RAPD-PCR反应体系具有良好的稳定性和重现性,可应用于鹧鸪茶不同居群间亲缘关系和遗传多样性分析。     

假臭草EST-SSRs标记的开发

从NCBI的dbEST数据库中下载假臭草同族植物的EST序列,经EST序列处理及SSR位点查询,首次设计了27对假臭草EST-SSRs引物,以海南省文昌市假臭草DNA为模板,采用单因素和L16(45)正交试验对其EST-SSRs PCR反应体系进行优化。建立了假臭草EST-SSRs最佳20μLPCR反应体系:Mg2+浓度为2.75 mmol/L,模板DNA用量为35 ng,Tag DNA聚合酶为2.25 U,dNTPs浓度为0.3 mmol/L,引物浓度为0.6μmmol/L。并用14个不同来源的假臭草样本对其体系进行验证实验,结果均能获得稳定的、清晰明亮的扩增谱带。假臭草EST-SSRs标记的开发为深入研究其遗传多样性提供了基础。     

朝鲜白头翁RAPD反应体系的优化

采用改进的CTAB法提取朝鲜白头翁的基因组总DNA,建立朝鲜白头翁RAPD分析的PCR反应体系,成功进行RAPD扩增.筛选出的最佳PCR反应体系为:25μL反应体系中包括模板DNA 20ng,dNTP 200μmol/L,引物0.4μmol/L,Mg2+1.5 mmol/L,Taq酶1 U,10×Buffer 2.5μL,其余部分为无菌重蒸馏水.     

中国鲎微卫星引物扩增圆尾鲎DNA的PCR反应体系优化

采用正交设计法,从dNTPs浓度、引物浓度、Mg2＋浓度、Taq DNA聚合酶用量4个因素3个水平出发,优化设计圆尾鲎DNA的PCR反应体系（引物为中国鲎微卫星引物）.并采用直观分析方法分析正交试验结果,最终建立了圆尾鲎SSR-PCR最佳反应体系：总体积20μL,Taq DNA聚合酶1.5 U、dNTPs 0.16 mmol/L、引物0.2μmol/L、Mg2＋2.0 mmol/L;并通过PCR梯度实验进一步优化模板DNA质量浓度、退火温度及退火时间,获得最佳反应条件：模板DNA质量浓度为30 ng/μL,退火温度为48℃,退火时间为20～25 s.对最佳反应体系和反应条件进行了检验,结果显示该反应体系稳定性高、重复性好.     

SRAP分子标记用于苦荞分析中的条件优化

[目的]研究SRAP分子标记用于苦荞分析中的条件优化。[方法]采用交互正交设计L27（313）对苦荞SRAP-PCR反应体系进行了5因素（Mg2＋、dNTP、Taq酶、模板DNA和引物）3水平优化筛选,比较了非变性和变性PAGE检测方法,并进行了DYCZ-24F与DYCZ-20C2种电泳操作系统的对比试验。[结果]4个单因素（Mg2＋、dNTP、Taq酶和引物）和2个交互作用（Mg2＋×dNTP、Mg2＋×Taq酶）对苦荞SRAP-PCR有极显著影响;最佳反应体系为：20μl总体积,Mg2＋1.5mmol/L,dNTP0.2mmol/L,Taq酶1.5U,模板DNA40ng,引物0.25μmol/L,10×缓冲液2μl。运用该体系对7份苦荞材料进行扩增,电泳结果显示扩增条带清晰、多态性高、重复性好。将扩增产物进行非变性与变性PAGE和2种电泳操作系统检测,结果显示,非变性PAGE、DYCZ-24F操作系统更适合于SRAP的分析。[结论]该研究为今后构建苦荞SRAP遗传图谱奠定了基础。     

甜菜RAPD反应体系优化及亲缘关系研究

利用正交试验设计,从Mg~(2+)、dNTP、引物、Taq酶和模板5种因素5个水平上对甜菜RAPD反应体系进行优化,确立了适合甜菜RAPD反应体系:25μL反应体系中含1×Buffer、1.0 mmol/LMg~(2+)、1U Taq DNA聚合酶、0.25 mmol/LdNTP、0.4μmol/L随机引物和25 ngDNA模板。利用优化的RAPD反应体系对38个甜菜品种进行亲缘关系分析。结果表明,38个品种之间的多态性比较高,变异大。聚类图结果表明,38个甜菜品种遗传距离的变异范围在0.14～0.72。当以遗传距离0.50来划分时,可将38个品种分为两大类,以遗传距离0.40来划分时,又可以把第2大类分为6个亚类。结果显示,RAPD优化体系适合甜菜亲缘关系鉴定。