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PRRSV NVDC-JXA1株在Marc-145细胞上增殖条件的优化 总被引:1,自引:0,他引:1
为了在Marc-145细胞上获得更高滴度的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)NVDC-JXA1株,优化了细胞培养条件、病毒接种剂量、病毒吸附时间、收毒时间和病毒冻融次数等条件。结果表明Marc-145细胞在MEM培养基、新生牛血清含量80 mL/L,细胞接种密度150 000个/mL,pH7.0条件下生长状态最好;PRRSV NVDC-JXA1株的最佳接种剂量为400 TCID50/mL,病毒吸附时间为30 min,收毒时间为接种后72 h,在-20℃冻融3次,PRRSV NVDC-JXA1株增殖效果最好。该结果为NVDC-JXA1株PRRSV疫苗的生产提供了依据。 相似文献
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为了在Marc-145细胞上获得更高滴度的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)TJM株,对细胞培养条件、细胞接种量、微载体的用量以及病毒培养时间等条件进行了优化。结果表明,利用生物反应器悬浮培养Marc-145细胞在血清为金源康且含量为10%、培养基为DMEM、细胞接种密度为20~30细胞/球、微载体为5 g等条件下生长状态最好;病毒最佳培养时间为27~36 h,病毒增殖效果好且能够达到最高的病毒滴度。本试验为微载体培养条件下大规模生产PRRSV-TJM株疫苗奠定了一定理论基础。 相似文献
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类NADC30猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)已成为我国PRRSV的主要流行株,为了评价当前商品化疫苗对类NADC30 PRRSV的免疫保护效果,本研究将12头6周龄仔猪随机分为3组,免疫组和攻毒对照组各5头、空白对照组2头,免疫组肌注高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(HuN4-F112株)105.0 TCID50... 相似文献
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为了追踪高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syn-drome virus,HP-PRRSV)毒力逐渐减弱的分子轨迹,我们以HP-PRRSV亲本毒HuN4株及其系列传代致弱毒株为研究对象,对HuN4株及其不同代次毒株其全基因序列进行了序列比较分析。结果显示由高致病性的亲本毒HuN4株到无致病性的F112代的疫苗毒,共有65个核苷酸发生突变,其中导致41个氨基酸发生突变,这些突变的氨基酸分散性的存在于不同基因区域。与已经报道的高致病性JXA1株及其致弱毒株JXA80株相比较,可以看到两个强毒株毒力致弱的演变轨迹并不完全相同,二者之间不仅氨基酸突变数量不一致,而且突变氨基酸的位置也不完全相同,但其共同特点是由强毒株到弱毒株的变化过程中,突变率较高的结构蛋白相一致,突变率较高的非结构蛋白基本一致。分析结果提示我们决定高HP-PRRSV毒力强弱的因素可能不是由单个氨基酸的突变来决定的,推测是由一个基因或多个基因或多种因素共同造成的,同时也使我们认识到PRRSV的非结构蛋白区在病毒毒力变化中可能发挥重要作用。 相似文献
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猪繁殖与呼吸综合征病毒在Marc-145细胞微载体上培养条件的研究 总被引:4,自引:0,他引:4
通过研究搅拌程序,细胞接种密度,微载体浓度与细胞生长的关系,探索Marc-145细胞在微载体上的生长条件,并测定猪繁殖与呼吸综合征病毒在微载体培养的细胞上的TCID50。结果表明:细胞接种密度为4.28×105 cells/mL时,病毒滴度可达到107.5TCID50,这说明利用微载体繁殖PRRSV是可行的,为猪繁殖与呼吸综合征疫苗的大规模生产奠定实验基础。 相似文献
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为研究CD151与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染的关系,根据GenBank中已发表的CD151蛋白的基因序列设计并合成一对特异性引物,从Marc-145细胞中扩增出294 bp的CD151基因片段并克隆入pGEX4T-3载体,转化人大肠杆菌用IPTG进行诱导表达,经SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行鉴定.表达蛋白纯化后用于免疫小鼠制备抗CD151蛋白血清,用ELISA和IFA检测抗血清的效价及特异性.将抗CD151蛋白血清与Marc-145细胞孵育后再感染PRRSV,观察细胞CPE验证该血清对PRRSV的阻断效果.结果表明成功构建了pGEX4T-3-CD151,获得了相对分子质量为37 ku的重组CD151蛋白.制备的抗血清特异性结合Marc-145细胞并有效阻断PRRSV感染Marc-145细胞.这些研究结果为进一步阐明CD151与PRRSV感染的关系提供一定的理论基础. 相似文献
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试验旨在验证Nsp9基因是否影响猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的复制。构建含有Nsp9全长基因的质粒pIRES2-EGFP-Nsp9,并转染到Marc-145细胞中,接毒之后分别通过实时荧光定量PCR和Western blotting方法测定PRRSV N蛋白在mRNA和蛋白水平的表达。结果显示,转染Nsp9基因的Marc-145细胞上PRRSV的N蛋白在mRNA水平上显著高于未转染Nsp9基因的对照组(P<0.05),是对照组的1.5倍,同时转染Nsp9基因后的Marc-145上PRRSV N蛋白水平也明显高于对照组。随着剂量的增加,N蛋白的表达量在mRNA和蛋白水平都有所增加。由以上结果初步可知,Nsp9基因可以在Marc-145细胞上促进PRRSV的复制,Nsp9基因与其复制密切相关。 相似文献
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通过对高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(Highly Pathogenic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virtls,Hp-PRRSV)HuN4株亲本毒及其不同代次传代毒株Nsp2(Nonstnduralprotein2)蛋白氨基酸序列比较分析,发现不同代次的Nsp2蛋白存在4处氨基酸点突变,针对每个突变点分别人工合成编码短肽的核苷酸序列,经原核表达后进行Western blot分析。结果表明表达的融合蛋白F65-11(^749KGEPvsdqpak^759)能够特异性的与HuN4-F40、HuN4-F65和HuN4-F112感染猪的血清发生反应,而与HuN4 F5感染猪的阳性血清和CH-1a株阳性血清不发生反应,证实第4个氨基酸点突变(S754)处存在一个免疫优势抗原表位。将该表位肽段由N端和C端逐步缩短继续鉴定,当N端缩短到第5个氨基酸(^754SDQPAK^759)C端缩短到第3个氨基酸(^749KGEPVSDQ^757)时,表达的融合蛋白不能与PRRSV阳性血清反应,最终推测该抗原表位必需氨基酸为^753VSDQ^756。选取GenBank中提交的部分高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的Nsp2氨基酸序列,对该表位氨基酸所在位置进行序列比较,分析结果显示位于Nsp2蛋白749→759位氨基酸序列高度保守,F65—11变异位点C^754→7^754为HuN4株系列传代毒株所特有。本研究结果证实抗原表位F65—11可以作为鉴别HuN4-F112弱毒疫苗所诱导产生的特异性抗体的候选抗原。 相似文献
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高致病性PRRS活疫苗(HuN4-F112株)抗体对Ⅱ型不同亚群PRRSV的中和效果 总被引:2,自引:0,他引:2
为研究高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)活疫苗(HuN4-F112株)诱导的抗体对II型不同亚群PRRSV的中和作用,本研究将10头PRRSV抗原、抗体阴性的6周龄仔猪,每头仔猪肌肉注射1头份疫苗(106.0TCID50/mL),每周采血并分离血清,检测该血清对II型PRRSV第1、2、4亚群的代表病毒株勃林格PRRSV活疫苗(VR-2332株)、PRRSV活疫苗(CH-1R株)和HP-PRRSV活疫苗(HuN4-F112株)的中和效价。实验结果显示,仔猪免疫3周后开始产生针对HuN4-F112的中和抗体,11周至22周抗体水平达到高峰,抗体持续至少25周,但只有少数免疫猪在几个时间点的血清对VR-2332和CH-1R疫苗株具有血清交叉中和作用,而且中和效价较低。 相似文献
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将板蓝根、甘草和鱼腥草3种单味中药各含量为100mg/mL的中药粗提物作连续倍比稀释后,采用CPE和MTT法将其在Marc-145细胞上进行最大安全质量浓度和对细胞增殖的影响试验,同时采用体外细胞培养的方法在Marc-145细胞上进行抗猪繁殖与呼吸综合征病毒突变株(PRRSV PX株)作用试验。结果显示,3种中药粗提物最大安全作用质量浓度板蓝根和甘草均为3.125g/L、鱼腥草为1.563g/L;板蓝根、甘草、鱼腥草分别在3.125~0.049、3.125~0.195、1.563~0.391g/L时测得细胞D值大于细胞对照组,对细胞分裂增殖均有促进效果,最佳作用质量浓度均为1.563g/L;3种中药粗提物有不同程度的抗PRRSV PX株作用,板蓝根和甘草粗提物阻断、抑制PRRSV PX株感染及直接灭活PRRSV PX株效果最好的质量浓度;阻断为3.125、3.125g/L、抑制为1.563、0.391g/L:阻断、直接灭活为0.782、0.782g/L,鱼腥草粗提物在0.782g/L时阻断和抑制PRRSV PX株效果为好,但其对PRRSV PX株基本没有直接灭活作用。 相似文献
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致弱过程中高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HuN4株部分生物学特性的研究 总被引:1,自引:0,他引:1
为了研制高致病性猪繁殖与呼吸综合征(HP-PRRS)弱毒疫苗,将高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)HuN4株进行了致弱驯化,在Marc-145细胞上对其进行了3次蚀斑克隆和连续传代.该毒株的病变速度随着代次增高逐渐加快,传至80代以后其病毒滴度达到最高并保持稳定;电镜观察发现低代次病毒粒子形态以棒状为主,高代次病毒粒子形态以球形为主;蚀斑形态比较发现低代次病毒形成的蚀斑大小不一,而高代次病毒形成的蚀斑大小均一;序列分析和病毒抗原性分析表明HuN4株传代过程中GP5蛋白羧基端1个主要抗原表位(196QWGRL200)发生突变即196Q突变为196R,针对该表位的单克隆抗体只与HuN4株低代次病毒反应而不与高代次病毒反应.以上结果表明:在Marc-145细胞上经蚀斑克隆和连续传代致使HP-PRRSV HuN4株部分生物学特性发生改变,这些特性的改变在病毒弱化过程中的作用还有待进一步的研究. 相似文献
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为构建高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染性克隆,本实验根据PRRSV HuN4株基因组序列设计并合成PRRSV特异性引物,应用RT-PCR技术分6段扩增了PRRSV HuN4株全基因组cDNA.将扩增的各个cDNA部分重叠片段分别克隆于pBlueScript Ⅱ SK(+)载体中构建了感染性重组质粒pHuN4.并在病毒cDNA 5′末端引入sp6启动子序列便于后期的体外转录获得病毒的转录本,在3'末段Poly (A)尾引入Not Ⅰ酶切位点用于线性化pHuN4;此外,将HuN4基因组第14680位的A沉默突变为G产生一个Mlu Ⅰ酶切位点作为鉴定拯救病毒的分子标记.pHuN4通过酶切线性化后经体外转录及转染BHK细胞,并在Marc-145细胞中救获病毒.结果显示:救获的病毒能够在Marc145细胞引起明显的细胞病变;间接免疫荧光检测以及分子标记验证结果表明病毒拯救成功,而且拯救的病毒与亲本强毒生长曲线没有显著差异.利用拯救的第5代克隆病毒株对本动物进行致病性试验,结果显示实验猪在感染后第3d开始出现体温升高、厌食、消瘦等临床表现,发病率达100%,在感染后20 d内陆续死亡,表明拯救的病毒保持了与亲本病毒株相一致的致病特征,以上研究证实我们成功的构建并获得PRRSV强毒HuN4株感染性克隆,为从基因水平上研究PRRSV的致病机制提供了技术平台. 相似文献
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研究猪繁殖与呼吸障碍综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)在Marc-145细胞蛋白激酶R(interferon-induced, double-stranded RNA-activated kinase, PKR)下调表达状态下的感染特性。以Macr-145细胞PKR基因序列设计3个shRNA,并设阳性对照,合成后插入pSilencerTM 2.1-U6载体构建重组质粒,与Macr-145细胞PKR+EGFP标签融合表达的重组质粒共转染HEK293细胞,以筛选能下调表达PKR的shRNA,并将该shRNA重组质粒转染Marc-145细胞,潮霉素B抗性筛选并克隆纯化获得PKR下调表达的细胞系,感染重组病毒PRRSV XZ06a-EGFP,通过检测病毒结构蛋白M与EGFP表达、观察细胞病变等,研究此状态下感染特性。结果显示筛选获得致使PKR下调表达的shRNA,以及稳定表达shRNA、PKR表达降低90%以上的Marc-145细胞系,重组病毒感染后48 h, M蛋白与EGFP表达均受到抑制,且... 相似文献
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利用细胞病变(CPE)抑制试验和MTT法,通过抗病毒试验来评价甘草酸二钾对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染Marc-145细胞的保护效果,并通过复制抑制、吸附抑制和直接杀灭3个试验探讨了甘草酸二钾体外抑制PRRSV的作用方式.结果表明,在安全浓度范围内,甘草酸二钾能够显著抑制CPE的产生(抑制率≥100%).在直接杀灭和复制抑制试验中均表现出较高的抑制率,但在吸附试验中却没有阻断病毒对细胞的吸附,初步推测甘草酸二钾可干扰PRRSV的复制或可直接将其灭活,或两种作用同时存在.说明在体外试验中甘草酸二钾具有良好抗PRRSV活性,可以作为潜在的抗病毒试剂供进一步研究使用. 相似文献
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猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(CH-1R株)工厂化生产培养条件的研究 总被引:1,自引:0,他引:1
为提高猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)活疫苗CH-1R株的产量和疫苗的质量,本实验探索了PRRSV活疫苗CH-1R株在MARC-145细胞中大规模生产培养的最佳条件。将CH-1R株分别在3L和10L转瓶培养的MARC-145细胞中进行增殖试验,分析CH-1R株在不同接种病毒量和不同接种病毒时间的TCID50变化规律。结果表明,在3L和10L转瓶中,病毒的TCID50最高可达到107.0TCID50/mL以上。CH-1R株通过转瓶在MARC-145细胞中大规模增殖,为PRRSVCH-1R株的工厂化生产奠定了基础。 相似文献
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《中国兽医学报》2017,(4)
猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是严重危害养猪业的传染病之一,也是重点防控的疾病之一。人参多糖(ginseng polysaccharides complex,GPS)具有抗病毒及增强免疫的作用。为了寻找有效预防和治疗PPRS的药物,本试验以Marc-145细胞为模型,采用细胞病变抑制试验和MTT法测定细胞活力,观察GPS在体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的作用,并通过改变药物作用方式初步探讨GPS的抗病毒机制。试验分为6组,分别为50,100,200和400 mg/L GPS组、病毒对照组及正常细胞对照组。在GPS对PRRSV感染Marc-145细胞的阻断和抑制作用中,各质量浓度GPS均显著提高感染PRRSV后Marc-145细胞的存活率(P<0.05),GPS处理组Marc-145细胞中的PRRSV量均显著低于病毒对照组(P<0.05)。而且,GPS可以促进Marc-145细胞中IL-6和IFN-γ的mRNA表达,也能增强细胞上清中IL-6和IFN-γ的活性。本试验研究表明GPS在体外可有效阻断或抑制PRRSV对Marc-145细胞的感染,提示GPS可作为预防和治疗PRRS的候选药物。 相似文献
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猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因疫苗的构建及其在Marc-145细胞中的表达 总被引:1,自引:0,他引:1
根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)LV和VR-2332株的核苷酸序列,设计合成了1对特异性引物,对PRRSV四川分离株SC1和SC2进行RT-PCR,扩增出病毒ORF5基因。利用真核表达质粒pcDNA3.1(+)成功构建了PRRSV四川分离株ORF5基因疫苗pcDNA-PRRSV-SC1-ORF5和pcDNA-PRRSV-SC2-ORF5。通过脂质体转染法和电穿孔转染法将pcDNA-PRRSV-SC2-ORF5转染Marc-145细胞,间接免疫荧光技术跟踪监测ORF5基因的表达情况,结果表明,脂质体转染法和电穿孔转染法分别在转染26h和23h后检测到ORF5基因特异性表达产物,且随着培养时间的延长,特异性表达产物增多,两者均在56h达到高峰;这证明pcDNA-PRRSV-SC2-ORF5在Mare-145细胞中已高效表达,为PRRSV基因疫苗在临床上应用提供了实验依据。 相似文献