猪星状病毒ORF2基因的克隆及序列分析

参考GenBank上发表的猪星状病毒亚基因组序列,设计1对引物,对猪星状病毒广西流行株衣壳蛋白ORF2基因进行扩增,最终克隆得到PAstV/NNJG7株的衣壳蛋白完整序列.序列分析发现,其ORF2全长2 358 bp,编码786个氨基酸;与猪星状病毒Ⅰ型参考株核苷酸同源性最高,为77.3％～79.4％;在ORF1b和ORF2连接处有一段高度保守的序列,在ORF2 3'端有一段长83 bp非翻译序列及一个含43 bp高度保守的茎环样基序.本试验不仅丰富了猪星状病毒衣壳蛋白基因序列,也为基因疫苗和诊断试剂盒的研制提供材料及理论依据.     

猪圆环病毒ORF2基因和细小病毒VP2基因真核表达载体的构建及鉴定

猪圆环病毒2型的ORF2基因编码主要的结构蛋白(cap蛋白).有研究证明ORF2基因与病毒的毒力密切相关.猪细小病毒的VP2基因编码主要衣壳蛋白,VP2蛋白在细小病毒感染过程起着极为重要的作用.     

猪2型圆环病毒ORF2基因的克隆及原核表达

采用PCR方法从已构建好的猪圆环病毒2型(PCV2)全基因重组质粒(pMD18-T-PCV2)中扩增出大小为579bp的ORF2基因,克隆到表达载体pET-32a,经IPTG诱导,成功表达了ORF2基因编码的结构蛋白。表达的重组蛋白为融合蛋白,分子量40Ku,表达量20%左右。经Western-blot检测,重组蛋白可被PCV2阳性血清识别。     

猪MBL2基因序列特征分析

研究采用生物信息学方法分析了猪MBL2基因,进一步获得猪MBL2基因序列特征及编码蛋白的结构和功能,并且对CDS区里的编码蛋白的理化性质进行了预测。除此之外还对这些编码蛋白是亲水还是疏水、它们的糖基化位点、信号肽、二级结构以及三级结构进行了预测。实验结果表明,猪的MBL2基因的大小是723 bp,编码的氨基酸共有240个,蛋白质的相对分子质量为25 522.83 KDa,理论等电点PI为4.97。MBL2基因的二级结构是无规则的卷曲型,蛋白结构预测结果是一种可溶性蛋白,具有4个外显子;在第20-21位氨基酸之间存在信号肽,表现为亲水性。研究结果为进一步研究猪MBL2基因的功能提供了理论基础。     

猪圆环病毒2型GZ-RH1株基因组遗传特征分析

为对猪圆环病毒iDNA新型疫苗、基因组遗传变异以及基因组结构与功能等研究提供科学依据,运用相关生物信息学软件对猪圆环病毒2型(PCV2)贵州仁怀分离株(GZ-RH1)的基因组遗传特征进行了分析。结果表明,PCV2GZ-RH1株基因组结构与pmws(AF027217)株相比存在较大差异,其ORF2基因的第696位因碱基T的缺失而导致移码突变,致使其缺失了ORF8和ORF11,ORF5和ORF10终止密码子提前,其他ORF相对较为保守。PCV2GZRH1株各编码蛋白中除了ORF4和ORF9外,其余都属于亲水性蛋白,且ORF9含有1段信号肽序列。在ORF1和ORF2编码蛋白的磷酸化位点中,ORF1相对较为保守,而ORF2变异较大。ORF1~3所编码的蛋白除均具有各自的蛋白质家族域外,还预测到一些可能具有特殊功能的结构域,如ORF1编码蛋白的NACHT结构域和ORF2编码蛋白的精氨酸富集区。ORF2编码氨基酸位点熵值分析表明,ORF2蛋白氨基酸序列中包含2个高变区,即第53~91位和185~215位。通过构建进化树显示,GZ-RH1分离株系PCV2b亚型。对GZ-RH1株的密码子偏爱性分析表明,相对于大肠杆菌和酵母而言,昆虫细胞更适合于PCV2ORF2基因的体外表达。     

荣昌猪白细胞介素-2受体γ链基因克隆、表达与鉴定

运用RT-PCR技术从由刀豆蛋白(ConA)诱导培养的荣昌猪外周血单核淋巴细胞(PBMC)扩增出猪白细胞介素-2受体γ链基因的完整开放阅读框(ORF),长约1 107 bp,编码由368个氨基酸残基组成的相对分子质量为41 780的蛋白多肽.荣昌猪IL-2Rγ与人、猕猴、牛、犬、鼠在氨基酸水平上的同源性分别为81.6%,80.8%,85.1%,83.2%和68.8%.运用PCR技术从含荣昌猪IL-2Rγ,开放阅读框序列质粒中扩增其成熟蛋白编码基因,共1 020 bp.将其定向克隆于原核表达载体pET-32a(+)后在E.coli BL21中诱导表达,SDS-PAGE结果显示表达的融合蛋白约为52 000,重组蛋白以包涵体的形式表达,表达产物约占茵体总蛋白的37.6%;Western-blotting分析表明,在相对分子质量52 000处有一奈特异性的带;对γ诱导重组茵进行转录检测得到约1 020 bp的特异性片段.     

猪圆环病毒2型ORF2基因及其编码蛋白的研究概况

结合国内外对猪圆环病毒2型(porcine circovirus2,PCV2)的研究,重点对猪圆环病毒2型ORF2基因及其编码蛋白的抗原表位和功能应用研究进行简要综述,为猪圆环病毒2型新型疫苗研究和建立诊断检测方法研究方面提供参考。     

表达猪圆环病毒2型Rep蛋白的重组杆状病毒的构建与鉴定

猪圆环病毒2型(PCV2)是近年来新发现的引起断奶仔猪多系统衰弱综合征的主要病原,含有两个主要的阅读框ORF1和ORF2,分别编码复制相关蛋白(Rep)和核衣壳蛋白(Cap)。为了探究ORF1基因结构及其与功能的关系,本研究利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统将PCV2的ORF1基因克隆到杆状病毒转移载体pFastBacTMDual中,获得重组转移载体pFBD-ORF1,再将其转化进含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中,经蓝白菌落筛选获得含有ORF1基因的重组穿梭载体rBacmid-ORF1,经脂质体介导转染昆虫细胞sf9,获得重组杆状病毒rAc-Rep,SDS-PAGE和Western-blotting分析可见大小约为36ku的特异性条带,表明rAc-Rep在sf9中成功表达了PCV2Rep蛋白。     

共表达猪IFN-γ基因对PPV VP 2-PCV ORF2真核质粒的分子免疫佐剂效应研究

将干扰素-γ、猪圆环病毒Ⅱ型ORF2主要抗原表位(47-85位AA)和猪细小病毒VP2基因克隆至pCI-neo真核载体中,构建重组质粒pCI-IFN-γ.ORF2.VP2.用脂质体介导法将其转染到MDBK细胞中,利用RT-PCR和间接免疫荧光法检测产物的表达情况.将重组质粒pCI-IFN-γ.ORF2.VP2、pCI-ORF2.VP2、对照质粒pCI-neo、PBS、猪细小病毒火活苗和猪圆环病毒亚单位疫苗通过肌肉注射免疫小鼠,检测小鼠不同时期的淋巴细胞转化功能、T淋巴细胞亚群动态变化情况以及PPV、PCV2抗体水平.试验结果显示,在转染重组质粒的MDBK细胞中能扩增到ORF2-VP2和IFN-γ基因;转染后48 h用间接免疫荧光法能在荧光显微镜下观察到绿色荧光,检测到特异性蛋白的表达.pCI-IFN-γ.ORF2.VP2免疫组从第7天开始脾淋巴细胞对ConA有明显反应,显著高于对照组和PCI-ORF2.VP2免疫组;CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴细胞的数量高于或显著高于对照组和pCI-ORF2.VP2免疫组;在免疫后第14天检测到PPV PCV抗体.结果表明,pCI-IFN-γ.ORF2.VP2能够有效诱导机体产生细胞免疫和体液免疫.     

猪2型圆环病毒辽宁分离株ORF2基因真核表达载体的构建及鉴定

PCV2基因片段ORF2编码病毒衣壳蛋白,是主要的免疫原蛋白,并且基因序列比较保守,是构建核酸疫苗的首选基因片段.本试验构建真核表达载体pIRES-ORF2,并转染Hela细胞,进行了间接免疫荧光试验.结果表明,在荧光显微镜下可以看到转有pIRES-ORF2质粒的细胞玻片上有明显的黄绿色荧光.     

猪圆环病毒2型重组Cap蛋白在昆虫杆状病毒中的表达

猪圆环病毒2型(PCV2)基因组包含2个开放阅读框架(ORFs),其中ORF1编码病毒复制相关蛋白(Rep),ORF2编码病毒衣壳蛋白(Cap).为了在昆虫细胞表达Cap蛋白,本研究采用PCR扩增PCV2-ORF2编码基因,将PCR产物插入到昆虫杆状病毒转移载体上,经酶切反应及DNA序列分析得到验证.重组质粒与昆虫杆状病毒线性基因组混合,转染到昆虫细胞(Sf-21)进行基因重组,经3次病毒蚀斑克隆,获得高效表达Cap蛋白的重组杆状病毒,毒价可达1.28×108pfu/mL.采用SDS-PAGE凝胶电泳分析表明,重组Cap融合蛋白分子量为32.8 ku,占总蛋白含量的17.2%.免疫印迹试验分析表明,重组Cap蛋白与PCV2阳性血清产生特异性反应,证明该重组蛋白具有良好的免疫活性反应.本研究为进一步进行该病毒分子诊断、亚单位疫苗以及分子生物学等研究奠定了基础.     

猪圆环病毒2型广西株的分离和全基因组序列分析

从广西表现为断奶仔猪多系统衰竭综合征的猪群中分离到1株猪圆环病毒2型(PCV-2),命名为GXB株.对GXB株的全基因组进行PCR扩增,扩增产物克隆至PMD18-T载体.测序结果表明,全基因组为1 767 bp,与GenBank上已知的8株PCV-2参考株序列的同源性在95.0%～99.6%之间.序列分析表明,GXB株基因组包含11个读码框(ORF),其中ORF1和ORF2是最主要的读码框,分别编码314个和233个氨基酸,与其他PCV-2毒株的ORF1、ORF2氨基酸的同源性分别为97.8%～100%、91.5%～98.7%.对GXB株ORF2编码的Cap蛋白基因进行功能分析,表明含有1个潜在的糖基化位点,3个明显的亲水区,有较强的抗原性和亲水性,为作为主要的免疫原性蛋白基因提供了依据.     

稳定表达猪圆环病毒2型衣壳蛋白P815细胞系的建立

应用脂质体介导的基因转染方法,将表达猪圆环病毒2型(porcine circovirus,PCV2)衣壳蛋白的重组质粒pcDNA3.1-orf2转染P815细胞,筛选G418抗性单克隆细胞,并经PCR、RT-PCR和间接免疫荧光鉴定,随后对目的蛋白表达稳定性进行了检测。结果表明PCV2orf2基因已经整合进P815细胞基因组DNA中,ORF2编码的衣壳蛋白在获得的阳性P815细胞中稳定表达,建立了稳定表达PCV2衣壳蛋白的P815细胞系。该细胞系的建立为PCV2新型疫苗的研究提供了必要的实验材料,同时也可为其他病毒疫苗的研究提供有价值的参考。     

两株不同来源的猪圆环病毒1型ORF2基因的克隆与序列分析

根据GenBank中猪圆环病毒1型（PCV1）ORF2基因序列，设计了1对引物，应用PCR方法从PK-15细胞和疑似患断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）的仔猪组织病料中分别扩增出了PCV1 ORF2全基因（702bp）。将此基因片段克隆入pMD18-T载体，筛选获得了重组质粒pMD-PCV1-ORF2，并对其进行了测序与分析。结果表明：所克隆的PK-15来源和组织病料来源的ORF2基因的同源性为99．4％，二者与GenBank中登录的PCV1 ORF2基因的同源性为97．3％～99．9％，与PCV2 ORF2基因的同源性为67．9％～68．4％，二者编码的蛋白在几个功能区比较保守。抗原表位预测表明，PCV1 ORF2编码的蛋白具有良好的免疫原性。     

表达猪圆环病毒2型衣壳蛋白的重组猪痘病毒的构建及鉴定

为探索猪痘病毒（swinepox virus,SWPV）作为猪圆环病毒2型（porcine circovirus type 2,PCV2）疫苗载体的可行性,本试验以痘苗病毒启动子P11启动绿色荧光蛋白筛选标记,猪痘病毒TK基因为外源基因的插入位点,P28、P7.5启动子启动PCV2 ORF2基因,以猪痘病毒JX20G株为亲本病毒,采用同源重组技术分别构建了两株表达PCV2衣壳蛋白的重组猪痘病毒rSWPV11-28C和rSWPV11-7.5C。结果显示,重组猪痘病毒rSWPV11-28C和rSWPV11-7.5C均成功表达了PCV2衣壳蛋白,表达的蛋白能与PCV2单克隆抗体6E12发生特异性反应;痘苗病毒启动子P28的启动效果明显优于P7.5,P28适合用于启动目的基因;利用重组猪痘病毒制备的PCV2灭活疫苗免疫小鼠后,rSWPV11-28C疫苗组的PCV2抗体水平与某PCV2商品疫苗相当,该重组病毒的成功构建为PCV2相关疾病及其他疫病在猪群中的防控提供了新的方向。     

我国猪博卡病毒的流行现状及检测技术

<正>猪博卡病毒(PBo V)属于细小病毒科(Parvovirus)细小病毒亚科(Parvovirus)博卡病毒属(bocavirus),为无囊膜的单股DNA病毒,病毒粒子大小为25~30 nm,呈正二十面体结构。病毒基因组全长5.2 kb,编码3个主要的开放阅读框(ORF1~3),其中ORF1编码非结构蛋白NS1,ORF2编码衣壳蛋白VP1和VP2,     

兔抗猪圆环病毒Ⅱ型ORF2重组蛋白抗体的研制

猪圆环病毒Ⅱ型(Porcine circovirus 2,PCV2)是仔猪断奶后多系统衰竭综合征(PWMS)的病原.目前,PCV2已成为严重阻碍养猪业发展的主要病原之一,给世界各地的养猪业造成了巨大的经济损失.衣壳蛋白(ORF2)是编码PCV2的主要结构蛋白,具有免疫原性,且不发生血清学交叉反应,是病毒刺激机体产生中和性抗体的重要蛋白.近年来的研究证实,猪圆环病毒Ⅱ型ORF2(PCV2-ORF2) 重组蛋白是良好的免疫原,但国内的相关研究报道较少.试验以家兔为试验动物,以PCV2-ORF2重组蛋白为免疫原,探索兔抗PCV2-ORF2重组蛋白抗体的制备方法,以期建立新的动物试验模型,为进一步深入研究PCV奠定基础.     

猪圆环病毒Ⅱ型ORF2基因在酵母中的表达

为探索猪圆环病毒Ⅱ型(PCVⅡ) ORF2基因的高效表达,将ORF2基因整合到酵母表达载体pPICZαC中,构建重组质粒pPICZαC-ORF2,通过SacⅠ酶切线性化,经电穿孔法转到毕赤酵母菌SMD1168。经Zeocin^TM抗性筛选得到转化子,通过SDS-PAGE分析和Western blotting鉴定,结果表明衣壳蛋白在酵母菌中成功分泌表达。     

猪圆环病毒2型ORF3基因的原核表达

用原核表达系统表达猪圆环病毒2型ORF3基因,分析ORF3蛋白的抗原性。根据GenBank上公布的猪圆环病毒2型(PCV-2)核苷酸序列进行分析,针对ORF3基因设计并合成1对特异性引物,PCR扩增该基因,并将此片段克隆入原核表达载体pET-32a(+)上,命名为pET32a-ORF3,转化大肠杆菌Rosetta-blue(DE3)pLacⅠ感受态细胞,1.0mmol/L IPTG37℃诱导表达。结果表明,PCR扩增得到315bp的片段,重组蛋白大小约为29ku,与预期大小相符。Western blotting分析结果表明,重组蛋白能与抗His-tag的单克隆抗体反应,不与PCV-2阳性血清发生反应。猪圆环病毒2型ORF3基因能在大肠杆菌中成功表达,但与阳性血清之间没有反应原性,为进一步研究PCV-2ORF3蛋白的功能及特性奠定基础。     

猪圆环病毒2型ORF2基因片段的原核表达

猪圆环病毒2型(PCV2)的衣壳蛋白由ORF2编码。采用PCR技术扩增得到ORF2基因片段,克隆入p UCm-T载体,构建了重组质粒p UCm-PCV2-ORF2。根据p UCm-PCV2-ORF2测序结果设计引物,用Pfu酶扩增替换稀有密码子三联体。改造后的基因片段连接入表达载体p GEX-4T-1,并转化到BL21(DE3)宿主菌,成功构建了GST-PCV2-ORF2蛋白大肠杆菌工程菌。经诱导表达后,对以包涵体形式存在的GST-PCV2-ORF2重组蛋白进行纯化、复性。复性后的GST-PCV2-ORF2重组蛋白具有良好的反应原性。