螺旋毛壳ND35 β-1,3-葡聚糖酶的诱导、性质及其抑菌作用

 以病原菌Rhizoctonia solani的细胞壁为诱导物,模拟毛壳菌自然的重寄生过程,研究了内生真菌螺旋毛壳(Chaetomium spirale) ND35 β-1,3-葡聚糖酶的产酶条件、性质,尤其是不同碳源的调控作用。结果表明,不同种类的真菌细胞壁及几丁质和昆布多糖,均可诱导产生β-1,3-葡聚糖酶,而作为分解代谢产物的葡萄糖则抑制产酶。经硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose阴离子交换层析及Phenyl-Sepharose疏水层析,并通过SDS-PAGE鉴定,纯化了一种分子量约为73 kDa的内切β-1,3-葡聚糖酶GLUC73。其最适反应温度为55℃,在40℃以下较稳定;最适pH值为5.5,在pH 5-9范围内均很稳定;酶活性受Hg²⁺、Fe³⁺、Zn²⁺、Mg²⁺等金属离子不同程度的抑制,Mn²⁺和Co²⁺对酶有激活作用;以昆布多糖为底物时,该酶的米氏常数K_m为0.412 mg·mL^-1,最大反直速度V_max为3.876 U·mL^-1。粗酶液同时具有β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶活性,离体抑菌试验表明,对苹果炭疽病菌(Glomerella cingulata)、杨树腐烂病菌(Valsa sordida)、苹果树腐烂病菌(Valsa mali)的菌丝生长和孢子萌发有明显的抑制作用。通过对β-1,3-葡聚糖进行免疫细胞化学标记和超微结构观察,间接证明了β-1,3-葡聚糖酶在螺旋毛壳重寄生过程中的作用。     

斑蝥素及去甲斑蝥素对七种植物病原真菌的抑制作用

采用菌丝生长速率法研究斑蝥素和去甲斑蝥素对苹果树腐烂病菌等7种植物病原真菌的抑菌活性.斑蝥素25～200mg/L对7种病原真菌的菌丝生长均有抑制作用,对苹果树腐烂病菌和苹果轮纹病菌EC50分别为0.1 mg/L和8.2 ms/L.去甲斑蝥素50～200 ms/L对苹果树腐烂病菌、苹果轮纹病菌、白菜黑斑病菌、黄瓜菌核病菌的菌丝生长有明显的抑制作用,对苹果树腐烂病菌和苹果轮纹病菌菌丝生长EC50分别为13.6mg/L和80.2mg/L.两种药剂EC卯处理5天后,在扫描电镜中发现两种供试菌菌丝加粗、皱缩,在透射电镜下观察到细胞膜畸形、细胞内空腔增多,出现电子致密物、囊泡等亚细胞结构变化.     

苹果树皮内生真菌的分离及其对腐烂病的生物防治潜力

为了明确苹果树皮中内生真菌的种类及其对苹果树腐烂病菌的抑制作用,对25年生富士苹果健康树皮中的内生真菌进行了分离和初步鉴定,并通过室内抑菌试验和田间保护作用试验测定其内生真菌对苹果树腐烂病菌的抑制作用。分离到的126株内生真菌分属于13个属,主枝中分离到的内生真菌的种类和数量较多;对峙试验中对苹果树腐烂病菌的抑菌率在40%以上的有24株,其中87.5%的菌株为链格孢属真菌。Al 6的培养滤液对腐烂病菌菌丝生长抑制作用较强,抑制率为83.76%;Al 58对其孢子萌发抑制作用较大,抑制率为82.42%;Al 67产生的挥发物质对腐烂病菌菌丝生长的抑制作用较大,为24.41%。田间试验结果显示,用拮抗性内生真菌预先占位接种苹果树枝干,能有效抑制腐烂病菌的侵入和病斑的扩展,Al 107的抑制作用最强。     

农抗120对苹果树腐烂病菌的作用研究

试验表明:农抗120单用,和农抗120加助剂B,对苹果树腐烂病菌菌丝的生长,均有明显的抑制作用。最小抑菌浓度为250μg/ml和125μg/ml;最小杀菌浓度为2000μg/ml和1000μg/ml。其杀菌作用机理是使病菌体的原生质凝集,小分子物质外流,形成大量空泡,菌体重量剧减。病菌在该浓度中浸泡12小时后便失去致病力。涂药试验:先刮除病斑,再用农抗120 1000μg/ml或农抗120加助剂B500μg/ml涂抹处理,16天后复发率仍为零,不刮除病斑,只用刀划刻病枝再涂药液,4天后病斑又继续扩展。     

苹果树腐烂病拮抗细菌菌株BJ1的鉴定及其抑菌作用

为开发对苹果树腐烂病有效的生防措施,对从山东栖霞苹果果园根际土壤中分离的63株细菌进行了筛选,获得有显著拮抗作用的菌株BJ1。采用玻片法和对峙培养法测定BJ1对苹果树腐烂病菌孢子萌发和菌丝生长的抑制作用及其抑菌谱,根据菌株BJ1的形态特征、生理生化特性及16S rDNA序列对其进行鉴定,并用离体枝条烫伤接种法对腐烂病的防效进行测定。菌株BJ1对腐烂病菌的抑制率为78.38%,其发酵滤液的抑菌率达到70.54%;BJ1可显著降低腐烂病菌分生孢子的萌发率,致使菌丝畸形、分支增多及细胞质外渗;该菌株对常见的8株果树病原真菌具有显著的拮抗作用。经鉴定,菌株BJ1属于微嗜酸寡氧单胞菌Stenotrophomonas acidaminiphila。BJ1不同稀释倍数的发酵滤液均对苹果树腐烂病有明显的抑制作用,其稀释50倍发酵滤液的防效仍可达81.06%,表明该菌株具有良好的生防潜力。     

内生菌螺旋毛壳抗生素和水解酶的协同抗真菌作用

 生防因子螺旋毛壳(Chaetomium spirale) ND35生长于含立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)菌丝细胞壁制备物的SM培养基中,从培养滤液提取的粗酶液强烈抑制Valsa sordida、Valsa mali、Glomerella cingulata和Curvulavia lunata病原真菌的菌丝生长和孢子萌发。经DNS法检测,粗酶液同时具有β-1,3-葡聚糖酶(包括内切和外切酶)和几丁质酶活性,分别为0.19 U.mg-1和0.09 U.mg-1。生长于3%玉米粉浸渍液的螺旋毛壳ND35的培养滤液也能抑制上述病原菌的菌丝生长和孢子萌发。离体条件下检测了ND35产生的一纯化的具有分子量为73 kD的内切β-1,3-葡聚糖酶(GLUC73)和一纯化的抗生素对苹果炭疽病菌的分生孢子萌发和芽管延长的抑制效果。当内切β-1,3-葡聚糖酶使用浓度为180 μg·mL^-1时,抑制了测试真菌的孢子萌发,造成细胞壁的改变,导致了菌丝顶端的破裂;抗生素的有效抑菌中浓度ED₅₀为1.75 μg·mL^-1。单独应用时,1.0 μg·mL^-1的抗生素或40 μg·mL^-1的内切β-1,3-葡聚糖酶没有或仅有很低的抑菌效果;两者组合导致孢子萌发约78%受抑制。甚至10 μg·mL^-1的内切β-1,3-葡聚糖酶也使1.5 μg·mL^-1抗生素的抑菌作用从低于25%增加到超过50%的抑菌效果。此外,80 μg·mL^-1的内切β-1,3-葡聚糖酶使1.0 μg·mL^-1抗生素的抑菌活性从0%提高到90%。抗生素和β-1,3-葡聚糖酶的协同抗菌活性可能在内生菌螺旋毛壳的植病生防中起重要作用。     

2种昆虫病原线虫共生菌的代谢产物对苹果病原菌真菌的抑菌作用

嗜线虫致病杆菌(Xenorhabdus nematophila HB310)和发光杆菌(Photorhabdus luminescens HB140)是分别从小卷蛾斯氏线虫和异小杆线虫中分离到的2株昆虫病原线虫共生菌。为了明确这2种共生菌的抑菌活性,分别测定了其对苹果上6种主要病原真菌的抑菌活性。结果表明,这2种共生菌对6种苹果病原真菌均有不同程度的抑制作用。嗜线虫致病杆菌HB310菌株发酵液对苹果轮纹病病原菌抑制效果最好,抑制率达76.9%,对其他病原菌的抑制作用依次为苹果树腐烂病病原菌(74.1%)>苹果斑点落叶病病原菌(60.9%)>苹果灰霉病病原菌(46.7%)>苹果青霉病病原菌(44.5%)>苹果炭疽病病原菌(23.0%);发光杆菌HB140菌株发酵液对苹果灰霉病病原菌的抑制作用最好,抑制率达到86.7%,对其他病原菌的抑制作用依次为苹果树腐烂病病原菌(76.6%)>苹果轮纹病病原菌(58.8%)>苹果斑点落叶病病原菌(46.0%)>苹果青霉病病原菌(44.2%)>苹果炭疽病病原菌(39.9%)。2种共生菌发酵液对苹果轮纹病菌均有较强的抑制作用,其EC50分别为42.28和42.92 mL/L。     

产酶溶杆菌OH11代谢产物HSAF对梨树腐烂病的防治效果

HSAF(heat stable antifungal factor)是产酶溶杆菌Lysobacter enzymogenes OH11中分离鉴定的一种小分子广谱抗真菌和卵菌物质,为进一步明确HSAF防治梨树腐烂病的潜力,分别采用生长速率测定法、显微镜观察法和刮治涂抹法测定了HSAF对梨树腐烂病菌的室内毒力以及对梨树腐烂病的田间防治效果。结果表明,HSAF对梨树腐烂病菌有较强的生长抑制作用,EC50值为0.5μg/m L;HSAF可导致梨树腐烂病菌菌丝体出现扭曲、近顶端处分枝和顶端肿胀等畸形现象;40μg/m L HSAF凝胶剂对梨树腐烂病的涂治愈合率可达81.3%,与2.12%腐植酸铜水剂的涂治愈合率(85.3%)无显著差异;对于分枝裂口或冻伤处、向阴、主杆或中心枝上的病疤,经40μg/m L HSAF凝胶剂涂抹后的愈合率高于2.12%腐植酸铜水剂。对于剪锯口处和向阳或分枝上的梨树腐烂病病疤,经2.12%腐植酸铜水剂涂抹后的愈合率高于40μg/m L HSAF凝胶剂;两种药剂对不同位置病疤的涂治效果不同,可作互补使用。本研究结果为梨树腐烂病的田间防治提供了一种新的生防制剂,同时也可望为其他果树腐烂病害的防治提供生防药剂资源。     

解淀粉芽孢杆菌TS-1203生防制剂中助剂和载体的筛选及配方优化

为研发高效低毒的苹果树腐烂病生防制剂,采用菌丝生长速率法分别研究了不同表面活性剂、防腐剂、紫外保护剂和载体在不同浓度下对解淀粉芽孢杆菌TS-1203菌株生长及其抑菌活性的影响。助剂筛选结果表明:TS-1203的最适表面活性剂为吐温-80,其质量分数为0.50%、培养48 h时,对苹果树腐烂病菌的抑制率为88.90%,与对照无显著差异;最适防腐剂为柠檬酸三钠,其质量分数为0.10%、培养48 h时,对苹果树腐烂病菌的抑制率为93.39%,显著高于对照;最适紫外保护剂为木质素磺酸钠,其质量分数为0.50%、培养48 h时,对苹果树腐烂病菌的抑制率为84.18%,显著高于对照。采用响应面法对TS-1203生防制剂的最佳助剂条件进行了优化,得其最佳配比为:65 mL发酵液中分别加入650 μL吐温-80、164.58 mg柠檬酸钠及308.12 mg木质素磺酸钠,在此条件下,TS-1203菌剂对苹果树腐烂病菌的抑制率最高,达84.78%。载体筛选结果表明,硅藻土对TS-1203菌株生长促进作用最强,但易分层;海藻酸钠对该菌株生长抑制作用最强;有机膨润土为最佳载体。     

地肤子提取物对苹果树腐烂病菌的抑制作用及对其菌体结构和功能的影响

为开发新型安全高效的植物源苹果树腐烂病防治剂,采用菌丝生长速率法测定中草药地肤子乙醇提取物及各层析流分L1～L9对苹果树腐烂病菌Valsa mali的抑制作用,同时通过室内常规分析方法观测流分L7对该菌菌丝形态结构、细胞膜通透性及物质吸收和代谢的影响。结果表明,地肤子乙醇粗提物浓度为2 mg/mL时对苹果树腐烂病菌具有较强的离体抑制活性,处理后96 h的抑菌率达到92.16%。分别用石油醚、氯仿、正丁醇萃取醇提物,石油醚萃取物对苹果树腐烂病菌的抑制效果最为明显,其EC_(50)为0.07 mg/mL;在石油醚萃取物通过硅胶柱层析分离得到的9种流分中,流分L7对苹果树腐烂病菌的抑制作用显著,离体抑菌率高达96.73%;且在流分L7处理下,病菌菌丝体出现肿胀、膨大或畸形等现象,细胞膜通透性增大,可溶性蛋白、还原糖以及丙酮酸的含量随流分L7浓度的升高而持续降低,当浓度为100μg/mL时,菌丝体可溶性蛋白、还原糖及丙酮酸的含量分别降低70.78%、71.74%和78.68%。表明在离体培养条件下地肤子乙醇提取物能明显抑制苹果树腐烂病菌的生长,并对菌丝体细胞膜结构和功能稳定性产生显著影响,具有进一步开发为新型植物源苹果树腐烂病防治剂的潜力。     

黄腐酸处理对苹果树腐烂病菌的抑制作用及对苹果树防御酶活性的影响

黄腐酸作为一种广谱性植物生长调节剂,具有稳定可靠的抗逆增产效果。本试验以黄腐酸为生长调节剂,研究其对苹果树腐烂病菌(Valsa mali)的抑制作用及对苹果树皮抗腐烂病的影响。试验结果表明,黄腐酸能抑制苹果树腐烂病菌菌丝的生长,浓度越大抑制效果越明显。经黄腐酸处理后,苹果树腐烂病组织中SOD、POD、PAL和CAT均呈现先升高后降低的趋势。其中黄腐酸处理后SOD活性于14d达到峰值,而其他酶活性均在21d达到最大值。说明黄腐酸能显著提高苹果树体内相关防御酶系的活性,很大程度上提高了植物的免疫力,即增强了苹果树的抗病性。     

苹果树腐烂病内生拮抗放线菌A-2的鉴定及其活性评价

以苹果树腐烂病菌Valsa mali为靶标菌,从健康苹果树枝条中获得一株高效内生放线菌A-2。采用生长速率法、对峙培养法和玻片法测定了菌株A-2的抑菌谱及对苹果树腐烂病菌菌丝生长和孢子萌发的影响;利用离体枝条烫伤接种法测定了菌株A-2对腐烂病的防治效果。结果表明:A-2发酵滤液对腐烂病菌的抑制率达90%以上,对其他9种常见的植物病原真菌也具有良好的拮抗作用;菌株A-2可导致腐烂病菌菌丝畸形、分支增多和局部膨大;不同稀释倍数的A-2发酵滤液对苹果离体枝条腐烂病均有明显的防效,接种病原菌前后24 h和同时施用500倍发酵滤液的防效均达70%以上。根据培养特征、生理生化特性和16S rDNA 序列分析,将菌株A-2鉴定为卡伍尔链霉菌Streptomyces cavourensis。     

3-二氟甲基-1-甲基吡唑-4-羧酸肟酯衍生物的合成及抑菌活性

为发现具有高抑菌活性的先导化合物,结合本课题组前期研究,设计并合成了18个新型3-二氟甲基-1-甲基吡唑-4-羧酸肟酯衍生物,其结构均经核磁共振氢谱、碳谱及高分辨质谱分析确证,化合物 9g 的单晶衍射结果证明肟酯的构型为E式。离体生物活性测定结果表明,目标化合物在50 μg/mL下对番茄灰霉病菌 Botrytis cinerea、苹果树腐烂病菌Valsa mali 和小麦全蚀病菌Gaeumannomyces graminis均表现出一定的抑制活性,其中化合物 9d 对苹果树腐烂病菌、 9r 对小麦全蚀病菌的EC₅₀值分别为0.89 μg/mL和3.34 μg/mL,表现出比先导化合物 L1 (E-2-氯-6-氟苯甲醛-O-(1-甲基-3-苯基-1H-吡唑-5-羰基)肟)和肟菌酯更优或相似的抑菌活性。     

5-甲基异噁唑-4-甲酸肟酯衍生物的合成及抑菌活性

异噁唑是具有较好活性的五元杂环,本文设计并合成了15个5-甲基异噁唑-4-甲酸肟酯类新化合物,利用核磁氢谱、核磁碳谱和高分辨质谱对其结构进行确证,并测试了其对番茄灰霉病菌Botrytis cinerea、水稻纹枯病菌Rhizoctonia solani、苹果树腐烂病菌Valsa mali和小麦全蚀病菌Gaeumannomyces graminis的离体抑菌活性。结果表明,在50μg/mL下,目标化合物对供试病原菌均有一定的抑菌活性,其中化合物5g对番茄灰霉病菌的抑制活性优于先导化合物L1和肟菌酯,EC₅₀值为1.95μg/mL。     

香豆素肟酯衍生物的合成及抑菌活性

为发现具有高抑菌活性的肟酯类化合物, 结合本课题组前期研究, 设计并合成了18个新型香豆素肟酯衍生物, 并对抑菌活性及构效关系进行了研究。离体生物活性测定结果表明, 目标化合物在50 μg/mL下对番茄灰霉病菌、苹果树腐烂病菌和水稻纹枯病菌均表现出一定的抑制活性, 其中化合物 4n 对番茄灰霉病菌和水稻纹枯病菌的EC₅₀值分别为4.44 μg/mL和3.65 μg/mL，表现出比香豆素和肟菌酯更优或相似的活性。     

10种N-取代氨基香豆素的合成及生物活性

基于结构拼接思想,设计合成了10个N-取代氨基香豆素类化合物,并测定了其抑菌及除草活性。6-硝基香豆素经Fe/NH4Cl还原得6-氨基香豆素,再与不同醛缩合得Schiff碱,最后经硼氢化钠还原制得10个N-取代氨基香豆素类化合物(4a~4J),其中9个未见文献报道,其结构均经红外光谱、核磁共振氢谱和质谱确认。抑菌活性测试结果表明,所有化合物对苹果腐烂病菌Valsa mali、葡萄白腐病菌Coniothyrium diplodiella、棉花枯萎病菌Fusarium oxysporium和柑橘炭疽病菌Citrusanthrax bacteria均有一定抑制作用,其中 4e 的抑菌活性最强,对苹果腐烂病菌和柑橘炭疽病菌的EC50值分别为7.53和12.93 mg/L,对其余2种植物病原菌的EC50值均小于25 mg/L;化合物 4f 次之,对苹果腐烂病菌和葡萄白腐病菌的EC50值均约为11 mg/L。除草活性测试结果表明,除 4f 外,所有目标化合物均有一定除草作用,其中 4c 的活性最强,100 mg/L下对反枝苋Amaranthus retroflexus种子根、茎生长的抑制率均为99%。     

7种杀菌剂对3种林木腐烂病菌的毒力测定及活性评价

林木腐烂病是苹果树、梨树和杨树等林木枝干的重要真菌性病害。为了筛选出对苹果树腐烂病菌Valsa mali var. mali、梨树腐烂病菌V. mali var. pyri和杨树腐烂病菌V. sordida等3种不同寄主腐烂病菌都能有效防控的杀菌剂,本研究开展室内毒力试验比较了7种杀菌剂对3种腐烂病病原菌菌丝生长和分生孢子萌发的抑制效果,并进一步通过田间活性测定试验比较7种杀菌剂对梨树腐烂病病斑扩展和分生孢子发生的防治效果,同时测定了增效剂8.6%聚乙二醇(PEG)对7种杀菌剂的增效作用。毒力测定结果表明,苯醚甲环唑、戊唑醇、吡唑醚菌酯和丙唑·多菌灵对3种腐烂病病原菌菌丝生长和分生孢子萌发的抑制作用较强,其中EC50平均值最低的是苯醚甲环唑,而戊唑醇的MIC平均值最低,在0.33 mg/L浓度下对3种腐烂病病原菌的菌丝生长和分生孢子萌发抑制率均达到100%。田间试验结果表明,45%苯醚甲环唑SC、43%戊唑醇SC和35%丙唑·多菌灵SE对梨树腐烂病病斑扩展和分生孢子萌发的防治效果突出,其中45%苯醚甲环唑SC 30.00 mg/L对病斑扩展防治效果达到82.23%,孢子萌发抑制效果达到85.96%,田间防治效果最好。10%丙硫唑SC+8.6% PEG处理组对病斑扩展防治效果提高了15.39百分点,达到73.46%,分生孢子萌发抑制率提高了23.75百分点,达到83.06%,增效作用显著。本研究为苹果树、梨树和杨树等3种寄主腐烂病的化学防控提供了科学依据。     

冬青卫矛内生放线菌Streptomyces flavofuscus G1 发酵液中抑菌活性成分研究

从冬青卫矛内生放线菌Streptomyces flavofuscus G1的发酵液中分离得到化合物G13和G19。经核磁共振波谱及质谱分析,并结合相关文献,两个化合物分别被鉴定为phencomycin(G13)和4'-deacetyl-(-)-griseusin A(G19)。抑菌活性测定结果表明:G19对水稻白叶枯病菌Xanthomonas oryzae pv.oryzae、铜绿假单孢菌Pseudomonas aeruginosa(1.203 1)、蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus(1.184 6)及金黄色葡萄球菌Staphyloccocus aureus(1.008 9)等供试病原细菌具有强烈的抑制作用,其最低抑菌浓度(MIC)值均为1.56μg/m L;对苹果树腐烂病菌Valsa mali和小麦赤霉病菌Fusarium graminearum菌丝生长亦有明显的抑制作用,其IC50值分别为14.70和24.35μg/m L。而G13对植物病原真菌油菜菌核病菌Sclerotinia sclerotiorum和苹果树腐烂病菌V.mali菌丝生长有强烈的抑制作用,其IC50值分别为5.21和4.82μg/m L。     

苹果树腐烂病菌拮抗放线菌JPD-1的筛选及鉴定

为筛选对苹果树腐烂病菌Valsa mali具有拮抗作用的放线菌,从苹果树根际土壤中分离获得放线菌,利用平板对峙法和生长速率法筛选拮抗活性较高的菌株,通过菌株培养特征、形态特征、生理生化特性及16S rDNA序列分析确定其分类地位,并采用离体枝条烫伤接种法测定所筛选获得的拮抗菌株对苹果树腐烂病的防效。结果表明,从苹果树根际土壤中共分离获得28株放线菌,其中菌株JPD-1对苹果树腐烂病菌的拮抗作用最强,抑制率为72.50%,该菌在高氏合成1号培养基上生长最好,培养7 d时菌落生长旺盛,气生菌丝白色,基生菌丝深粉红色,无可溶性色素产生;经形态特征观察、生理生化试验及16S rDNA序列分析,将菌株JPD-1鉴定为公牛链霉菌Streptomyces tau‐ricus。菌株JPD-1发酵滤液对苹果树腐烂病菌的抑制率及对离体枝条上苹果树腐烂病的防效均随稀释倍数的增大而减弱,发酵滤液原液使苹果树腐烂病菌菌丝膨大、末端畸形,抑制率为78.14%,对离体枝条上苹果树腐烂病的防效为76.37%。表明分离到的放线菌菌株JPD-1可以用作苹果树腐烂病的生防材料,具有很好的开发及应用前景。     

竹红菌甲素对18种植物病原菌的抑制作用

Inhibition of Hypocrellin A (HA) against 18 pathogenic fungi by mycelium growth rate in light and dark conditions was evaluated. The results showed that 50 mg·L^-1 HA exhibited antifungal activities against all of 18 pathogenic fungi under luminous intensity of 12 000 Lx. The inhibition rates of HA to Lecanosticta acicola, Fusarium graminearum, Valsa mali and Botryosphaeria dothidea were all higher than 90%. The EC₅₀ of HA to Botryosphaeria dothidea and Lecanosticta acicola was 0.60 mg·L^-1 and 0.77 mg·L^-1 respectively. However, HA showed weak and even no antifungal activity in dark condition. The study suggested that the potential of HA could be as a new kind of photoactivated biopesticide.