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本研究旨在建立一种可靠的检测猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)IgG抗体的间接ELISA方法,了解四川地区PDCoV的流行情况。采用原核表达系统表达PDCoV膜蛋白(M)作为检测抗原,通过反应条件的优化,建立了基于PDCoV M蛋白的间接ELISA方法,命名为PDCoV-rM-ELISA,并用该方法对430份临床样品进行检测。成功构建了重组表达菌BL21-pET-32a-M,经诱导表达后获得了重组M蛋白,Western bolt检测表明,重组蛋白具有良好的反应原性。以其作为包被抗原建立的PDCoV-rM-ELISA方法仅对PDCoV血清检测为阳性,与猪流行性腹泻病毒等5种猪常见病原阳性血清均无交叉反应,具有良好的特异性;该方法灵敏性高、重复性好,批间和批内重复性变异系数均小于10%;与成品化PDCoV抗体检测试剂盒同时检测48份临床血清,两种方法的阳性符合率为88.46%,阴性符合率为90.91%,总符合率为89.58%。临床样品检测结果表明,各地样本PDCoV抗体阳性率平均为11.86%,且统计学分析显示,母猪比仔猪和育肥猪高2.25倍的PDCoV感染概率。笔者成功表达了PDCoV M蛋白,建立了PDCoV-rM-ELISA检测方法,该方法具有较高的敏感性、良好的特异性和重复性,可用于临床猪血清样品种PDCoV IgG抗体的检测。 相似文献
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采用RT-PCR扩增猪流行性腹泻病毒(PEDV)N蛋白基因并克隆至原核表达载体pET-28a,转化到宿主表达菌BL21后经IPTG诱导表达和Ni柱纯化,SDS-PAGE和Western Blot鉴定重组N蛋白,其大小约为58 ku。将纯化重组N蛋白免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤细胞融合,PEDV间接ELISA方法筛选,制备获得4株能稳定分泌PEDV抗体的杂交瘤细胞株1C9、4C8、4F8和6A11。Western blot和间接免疫荧光试验证明其与PEDV均有特异性反应,单抗亚类鉴定均属于IgG1,轻链为κ型。杂交瘤细胞培养上清ELISA抗体效价为1∶1 600~6 400,腹水ELISA抗体效价达1∶1.024×105以上;4株细胞连续培养20代,其ELISA抗体效价基本一致。本研究为PEDV感染的诊断和致病机制研究提供了有用工具。 相似文献
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猪急性腹泻综合征冠状病毒(swine acute diarrhea syndrome coronavirus, SADS-CoV)目前尚未有商品化诊断试剂盒,为填补行业空白,本研究制备了抗SADS-CoV核衣壳(N)蛋白单克隆抗体并对其序列进行了分析。利用原核表达系统表达SADS-CoV N蛋白并进行纯化,纯化的N蛋白作为免疫源免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合、筛选及亚克隆,获得5株能够稳定分泌抗SADS-CoV N蛋白的杂交瘤细胞株,将其命名为1C10、4B10、6G1、6F3和6E8;此外,利用套式PCR扩增技术获得了抗体可变区基因序列。间接免疫荧光试验(IFA)结果表明,5株单抗特异性识别Huh7细胞感染的SADS-CoV。ELISA结果表明,5株单抗与纯化的SADS-CoV N蛋白具有良好的反应性,但是,与SADS-CoV反应性分析发现,只有6E8的反应性较好,其余四株均不反应。Western blot结果表明,5株单抗均能特异性识别纯化的以及SADS-CoV感染表达的N蛋白。亚类分型鉴定结果表明,1C10、4B10、6G1和6F3重链为IgG1型,6E8为IgG2a型,它们... 相似文献
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为建立一种方便、快捷、实用的检测猪δ 冠状病毒(PDCoV)方法,本研究利用原核表达猪δ 冠状病毒N 蛋白,以纯化的N 蛋白免疫BALB/C小鼠,利用杂交瘤细胞技术研制2株分泌PDCoV N 蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为E8、A10。2株杂交瘤细胞分泌单克隆抗体敏感性及特异性良好,E8亚类为IgG2a,A10亚类为IgG1。以E8作为金标抗体,A10作为检测抗体,兔抗鼠作为质控线抗体,制备猪δ 冠状病毒胶体金检测试纸条,检测猪δ 冠状病毒敏感性为100TCID50,检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒、猪δ 冠状病毒阴性对照均为阴性。本研究建立的胶体金试纸条检测方法敏感性及特异性良好。该检测方法的建立,为猪δ 冠状病毒(PDCoV)流行病学调查提供一种方法,同时为规模化养殖集团及基层兽医组织提供一种检测猪δ 冠状病毒产品。 相似文献
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旨在研究猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus, PDCoV)N蛋白的抗原性,为下一步诊断试剂盒的研发提供依据。试验通过RT-PCR的方法扩增PDCoV CH/GX/1468B/2017株完整的N基因并构建原核表达质粒pET32a-N,将pET32a-N转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中,经诱导表达获得重组N蛋白,纯化后经Western blot方法检测其反应原性,免疫昆明小鼠制备重组N蛋白多克隆抗体并进行效价测定(间接ELISA法)和特异性验证(间接免疫荧光法)。结果显示:重组N蛋白在IPTG终浓度为1.0 mmol/L,37℃诱导表达6 h的条件下可获得最高表达量,该重组蛋白主要以可溶性蛋白的形式表达;Western blot结果显示,纯化后的重组N蛋白可以和PDCoV阳性猪血清发生特异性结合,具有良好的反应原性。制备的多克隆抗体的效价可达1∶64 000,间接免疫荧光法结果表明其能特异性识别和结合PDCoV,说明重组N蛋白具有较好免疫原性。提示:PDCoV N蛋白抗原性好,可作为诊断试剂盒的候选抗原。 相似文献
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《中国兽医杂志》2019,(1)
为了制备猪流行性腹泻病毒(PEDV)的单克隆抗体,本实验以重组PEDV-N蛋白免疫BALB/c小鼠,利用细胞融合技术,经过3~5次亚克隆与筛选,获得了4株分泌抗PEDV McAb的杂交瘤细胞,分别命名为4A7、6C1、5E10和6F7。4株杂交瘤细胞分泌的McAb均为IgM,其轻链均为κ链。ELISA、Western Blot和免疫荧光鉴定结果表明,4株单抗均与N蛋白及PEDV具有良好的结合活性。复苏冻存的4株杂交瘤细胞,连续传代培养30代,4株杂交瘤细胞能够持续稳定分泌抗体,细胞上清的ELISA抗体效价均在1∶800以上。4株细胞诱生的小鼠腹水抗体效价为1∶10~5~1∶10~6。将单克隆抗体(4A7)用于免疫组化试验和IPMA时,其能够特异地识别PEDV人工感染猪小肠组织和Vero细胞内的病毒。上述实验结果表明,制备的单克隆抗体可以用于PEDV抗原检测以及体内病毒的组织定位分析,并可为进一步研发PEDV抗原或抗体检测技术奠定基础。 相似文献
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旨在制备布鲁氏菌外膜蛋白16(OMP16)单克隆抗体,建立OMP16抗体竞争ELISA方法,为布病临床防控提供免疫血清学检测手段。本研究选取保守性高、免疫原性良好的布鲁氏菌OMP16,经原核表达获得携带GST或His标签的重组OMP16(rOMP16)。利用杂交瘤技术筛选可稳定分泌OMP16特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株,经亚型鉴定、细胞核型分析和抗体交叉反应性试验分析单抗性质。制备小鼠腹水并纯化,方阵滴定法建立布鲁氏菌OMP16抗体竞争ELISA方法。结果表明,成功构建OMP16原核表达系统,经表达、纯化获得rGST-uOMP16和rHis-OMP16。筛选到1株遗传稳定的OMP16特异性杂交瘤细胞株,命名为B7;经鉴定,该抗体亚型为IgM-κ型,可识别目的蛋白,与标签蛋白无交叉反应。建立了布鲁氏菌OMP16抗体竞争ELISA方法,该方法与试管凝集试验检测结果相比总体符合率为90.53%,显示出良好的一致性。本研究有望为布鲁氏菌病的临床防控提供特异性高、敏感性好的免疫血清学检测方法。 相似文献
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为制备猪圆环病毒4型(PCV4)Cap蛋白单克隆抗体,以原核表达的重组Cap蛋白免疫6~8周龄小鼠,三次免疫后取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合。利用亚克隆技术和间接免疫荧光(IFA)方法筛选到2株阳性单克隆杂交瘤细胞株,分别命名为5H9和2F3。间接免疫荧光和Western blot试验表明,2株单抗均能特异性识别293T细胞中特异表达的Cap蛋白,且5H9和2F3的IFA效价分别为1∶12 800和1∶6 400。亚类鉴定结果表明,两株单抗重链均属于IgG1,轻链类型为kappa型。本研究制备的抗PCV4 Cap特异性单抗,为PCV4检测方法的建立和流行病学调查提供了有效的生物材料,也为该病毒的分离鉴定与Cap蛋白功能的探究奠定了基础。 相似文献
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为制备猪血凝性脑脊髓炎病毒(porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus, PHEV)N蛋白的单克隆抗体,本研究构建了pET-32a-N重组质粒,原核表达并纯化重组N蛋白,免疫BALB/c小鼠,细胞融合后利用间接ELISA进行筛选,获得了3株稳定分泌的阳性杂交瘤细胞株,分别命名为2C3、4F3、5C6。Western blot与间接免疫荧光试验表明,3株单抗均能与293T细胞中表达的N蛋白产生特异性反应。经测定,3株单抗的效价均为1×106,重链类型均为IgG1,轻链类型均为κ。利用一系列表达的部分重叠的N截短蛋白片段,经Western blot鉴定单抗所识别的抗原表位,结果显示,267KPRQK271为单抗2C3、4F3、5C6所识别的表位。本研究为PHEV临床检测方法的建立和表位疫苗的研发奠定了基础。 相似文献
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为研究猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的N蛋白特性及在诊断中的应用,本研究采用RT-PCR方法从猪流行性腹泻病毒FJ-11A株中扩增其N蛋白基因片段,并将其克隆到原核表达载体pET-32a上,构建原核表达重组质粒pET32a-PEDV-N,进行条件优化诱导表达、SDS-PAGE、Western blot和ELISA试验。结果表明,该重组目的蛋白(约60 kDa)得到表达,且具有良好的免疫学活性,该研究为开发猪流行性腹泻病毒诊断方法和研究N蛋白功能奠定基础。 相似文献
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【目的】表达与纯化猪丁型冠状病毒(Porcine deltacoronavirus, PDCoV)的核衣壳(nucleocapsid, N)蛋白,并制备其多克隆抗体(polyclonal antibody, PcAb)。【方法】以PDCoV CHN-HN-1601分离株基因组RNA为模板,利用RT-PCR扩增PDCoV全长的N基因编码序列,将其克隆至原核表达载体pET-28a(+)中构建重组质粒pET-28a-PDCoV-N。经酶切和测序鉴定后,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,利用0.5 mmol/L IPTG于37℃诱导表达12 h。在非变性条件下,利用Ni-NTA琼脂糖树脂从菌体裂解液上清中纯化N-端和C-端均携带6×His标签的重组N蛋白,并将其免疫新西兰白兔制备抗血清。利用Protein A/G琼脂糖树脂从免疫兔的抗血清中亲和层析纯化多克隆抗体,并对多克隆抗体进行Western blotting和间接免疫荧光试验(IFA)鉴定及抗体效价的间接ELISA测定。【结果】重组PDCoV-N蛋白以可溶性和包涵体两种形式表达,分子质量约为42 ku;上清可溶性N蛋白的... 相似文献
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猪圆环病毒3型Cap蛋白单克隆抗体的制备及其在免疫组化试验中的初步应用 总被引:1,自引:0,他引:1
为制备猪圆环病毒3型(PCV3)Cap蛋白单克隆抗体(MAb),并初步应用于感染细胞或组织样品中PCV3抗原的间接免疫荧光试验(IFA)或免疫组化(IHC)检测,本研究将PCV3 Cap蛋白的去核定位信号肽基因克隆于原核表达载体pET-28a中,经IPTG诱导表达了具有免疫原性的融合蛋白。以表达的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,共获得8株能够稳定分泌针对PCV3 Cap蛋白的MAb杂交瘤细胞株。Western blot与IFA试验结果显示,8株MAbs均能够与真核表达的重组Cap蛋白反应。选取3株杂交瘤细胞制备3株MAbs,小鼠腹水效价分别为1∶409 600、1∶204 800和1∶409 600。利用3株MAbs对自然感染PCV3临床病猪的腹股沟淋巴结进行IHC检测,结果显示3株MAbs的腹水均能够与感染PCV3的临床样品发生特异性的免疫反应。本研究制备的MAbs具有较好的特异性,为深入研究Cap蛋白的结构和PCV3快速诊断奠定了基础。 相似文献
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为了制备猪IL-10的单克隆抗体(MAb),本研究根据GenBank登录的猪白细胞介素10(PIL-10)基因序列设计两对特异性引物,利用套式PCR扩增PIL-10成熟蛋白编码基因(490bp),构建原核表达载体pET28a-PIL-10,并转化至大肠杆菌BL21,经IPTG诱导,SDS-PAGE和western blot分析鉴定,证明PIL-10重组蛋白获得表达。提取纯化该重组蛋白包涵体,免疫BALB/c小鼠,经过3次细胞融合,间接ELISA方法筛选,获得一株能稳定分泌抗猪IL-10MAb的杂交瘤细胞,将其命名为2F4。Western blot结果证明该MAb能够与重组蛋白发生特异性反应。间接ELISA测定细胞上清抗体效价为1∶1024,腹水效价为1∶128000,该MAb为IgG3亚型,轻链为λ型。杂交瘤细胞连续传代20代,分泌抗体的效价基本一致,从而为进一步建立猪IL-10的检测方法奠定了物质基础。 相似文献
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猪δ冠状病毒(PDCoV)是一种新发现的猪肠道冠状病毒,可引起新生仔猪的腹泻、呕吐、脱水、死亡,而且具有跨种感染潜能,给养猪业和公共卫生构成了巨大威胁。冠状病毒的辅助蛋白(accessory protein)是一类功能特殊的蛋白,不同属甚至同属不同种的冠状病毒编码的辅助蛋白数量、同源性均存在较大差异,具有属或种特异性。虽然辅助蛋白是冠状病毒增殖非必需的,但在调控宿主天然免疫、病毒复制与致病性中发挥重要作用。目前,已证实PDCoV至少编码3个辅助蛋白,而且近年来在PDCoV辅助蛋白的功能研究方面取得了显著进展。本文简要介绍了PDCoV辅助蛋白的鉴定及其在免疫调控和致病性中的作用,并对今后的研究进行了展望。 相似文献
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本研究旨在建立一种灵敏、快速检测猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)的TaqMan荧光定量RT-PCR方法。参照GenBank中PDCoV有关基因序列,设计一对特异性引物用于扩增PDCoV M 基因。将测序正确的基因片段克隆入pMD18-T载体,构建重组质粒作为建立标准曲线的病毒模板。设计合成一对特异性引物与TaqMan探针,进行反应条件和反应体系的优化,建立快速检测PDCoV的TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法,并进行该方法的灵敏性、特异性与重复性验证。结果表明,该方法能有效扩增1.0×10^1 ~1.0×10^9 拷贝·μL^-1 的PDCoV标准质粒,建立的标准曲线呈现良好的线性关系。该方法的检测灵敏度为1.0×10^1 拷贝·μL^-1;对猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪伪狂犬病病毒等病原不发生交叉反应,具有很好的特异性;重复性试验结果显示变异系数(CV)小于1%,重复性良好。对2017—2018年期间收集的河南省不同猪场的100份腹泻病料进行检测,PDCoV的阳性检出率为23%(23/100),与PDCoV SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法的符合率为100%。人工感染PDCoV的仔猪,取攻毒后不同时间的粪便样品,应用本研究建立方法与常规RT-PCR方法对样品进行检测,TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的灵敏度远远优于常规RT-PCR。上述结果表明,本研究所建立的TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法能够灵敏、特异地检测PDCoV,可用于临床PDCoV的检测。 相似文献
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本研究以猪流行性腹泻病毒(PEDV)全基因组为模板,利用RT-PCR方法扩增PEDV S基因的亲水区,将其克隆至pMAl-c2E原核表达载体,获得重组质粒pMAl-c2E-PEDV-S。经EcoRⅠ/SalⅠ双酶切测序鉴定后,转化BL21菌,经IPTG诱导,成功表达了约74 kDa的重组蛋白MBP-PEDV-S,亲和层析法纯化重组蛋白。将重组蛋白免疫3只健康的6~8周龄雌性BALB/c小鼠,将小鼠脾脏B淋巴细胞与SP2/0瘤细胞融合,采用间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞株,获得了4株能稳定分泌抗PEDV S蛋白抗体的杂交瘤细胞株1B11、1B10、1C8、3L3,其腹水效价都高于1∶100 000。获得的4株单克隆抗体与PEDV经IFA和Western blot检测,结果显示均具有良好的反应性。而且3株单克隆抗体重链为IgG2a,1株重链为IgG2b;3株轻链为Kappa,1株轻链为Lambda。本研究表达了PEDV S蛋白并制备了单克隆抗体,为研究S蛋白的结构和功能提供了条件,为揭示PEDV致病机制奠定了基础。 相似文献