流产布鲁菌转录调控子ArsR6缺失株的构建及其生物学特性分析

布鲁菌病是一种由布鲁菌感染引起的人畜共患传染病。布鲁菌是兼性胞内寄生的革兰氏阴性菌,其适应宿主环境、在胞内存活并建立慢性感染依赖于多种基因的表达和调控。前期研究利用转座子随机突变技术发现了转录调控子ArsR6与流产布鲁菌毒力相关,本研究通过基因定向缺失方法构建了流产布鲁菌arsR6基因卡那霉素抗性标记缺失株,并通过耐受性试验、免疫印迹试验、胞内存活试验、小鼠致病性试验等对arsR6缺失株的基本生物学特性进行了评估。结果显示,arsR6缺失显著减弱了布鲁菌抵抗阳性杀菌肽的能力,此外,arsR6缺失株的T4SS表达量增加,胞内存活能力增强,感染小鼠早期脾脏载菌量增加,慢性感染阶段导致小鼠脾脏显著肿胀,以上结果表明,ArsR6是布鲁菌毒力相关的重要转录调控子,本研究为布鲁菌致病机制研究提供参考。     

流产布鲁菌ppdk基因缺失株的构建及其生物学特性分析

布鲁菌病是由布鲁菌感染引起的呈全球性分布的人畜共患细菌性传染病。布鲁菌是一种兼性胞内菌,感染宿主依赖多种基因的表达和调控。近年来,胞内菌的碳代谢与致病力的关系成为研究的热点。前期研究发现碳代谢相关的丙酮酸磷酸双激酶(ppdk)基因与布鲁菌毒力相关。本研究利用同源重组方法构建流产布鲁菌ppdk基因缺失株,通过环境压力因子耐受性实验、胞内存活实验和动物致病性实验等探讨ppdk基因对布鲁菌毒力的影响。结果显示,ppdk基因缺失能减弱布鲁菌对多粘菌素B和大牛血清的抵抗性,减弱细菌胞内存活的能力和对小鼠的致病力,表明ppdk基因与流产布鲁菌的毒力密切相关。     

布鲁菌铁转录调控因子rirA基因突变株的构建与鉴定

为了构建牛布鲁菌S2308(简称S2308)的铁转录调控因子rirA基因突变株(S2308ΔrirA),探讨该基因对自身生长的影响以及其对不同类型细胞黏附侵袭和胞内繁殖的作用。利用同源重组和抗性替换的方法,以卡那抗性基因替换rirA基因,获得突变株S2308ΔrirA。将亲本株S2308、疫苗株RB51和突变株S2308ΔrirA在相同营养条件下培养,观察其振荡培养时的生长变化趋势和静置培养时的聚集状态。将各菌株侵染人胚胎滋养层细胞(HPT-8)和小鼠巨噬细胞(RAW264.7),分别检测其黏附侵袭能力和胞内生存能力。结果显示,成功获得了布鲁菌rirA基因突变株且10代内未发生回复性突变;与亲本株相比,S2308ΔrirA在相同体外培养条件下其生长趋势未发生明显改变,且其凝集状态与亲本株类似;黏附侵袭试验显示,S2308ΔrirA对HPT-8细胞的黏附侵袭能力显著强于亲本株,而其对RAW264.7的黏附侵袭能力在一定程度上弱于亲本株;布鲁菌胞内生存试验发现,布鲁菌侵染HPT-8细胞24h后,其胞内细菌数量显著升高,而侵染巨噬细胞24h后,S2308ΔrirA的繁殖能力明显低于亲本株。这些结果表明,铁转录调控因子rirA基因参与了布鲁菌胞内寄生的过程,并与菌株的毒力强弱存在密切联系。     

二元调控系统中的TcfSR在布鲁菌胞内存活过程中的作用及其调控基因的转录分析

为分析二元调控系统TcfSR在布鲁菌胞内存活中的调控作用,本研究采用同源重组和抗性替换的方法,利用卡那基因替换TcfSR启动子,构建布鲁菌16M株的突变株16MΔTcfSR,并利用亲本株和突变株侵染小鼠巨噬细胞,比较两者在宿主细胞内的生存能力及其胞内存活相关毒力基因的转录情况。同时在各种逆环境下刺激亲本株和突变株,比较两者在逆环境中的存活能力。结果显示16MΔTcf SR在小鼠巨噬细胞和逆环境中的存活能力均比亲本株下降,并且突变株的胞内存活相关毒力基因的转录水平较亲本株具有差异。表明TcfSR在布鲁菌胞内存活过程中具有重要的调控作用。本研究初步阐明了TCRS Tcf SR的调控机制,为进一步研究TCRS在布鲁菌致病过程中的作用奠定了基础。     

布鲁菌S19疫苗株znuA单基因及bp26/znuA双基因缺失株的构建及鉴定

通过等位基因交换,分别敲除牛流产型布鲁菌减毒活疫苗S19株和缺失株S19-Δbp26的znuA基因,构建了布鲁菌znuA基因单缺失株S19-ΔznuA和bp26、znuA基因双缺失株S19-Δbp26-ΔznuA,对获得的2种缺失株进行形态学、生长特性、稳定性和基因测序验证。结果表明,S19株和S19-Δbp26株的znuA基因均成功缺失,生长特性表示2种缺失株与亲本株生长基本无差异;体外连续传至20代,菌落PCR鉴定及基因测序结果显示2种缺失株均遗传稳定。牛流产型布鲁菌单缺失株S19-ΔznuA和双缺失株S19-ΔznuA-Δbp26的成功构建为布鲁菌新型疫苗的研发、布鲁菌感染动物过程中ZnuA蛋白的作用机理及其与Bp26蛋白之间关系的研究奠定了基础。     

非编码小RNA BSR1955在布鲁菌胞内生存和毒力中的作用

首先采用RT-PCR鉴定布鲁菌16M在模拟胞内条件下BSR1955的转录,利用TargetRNA2预测BSR1955的靶基因;然后采用融合PCR构建BSR1955缺失株;将BSR1955插入pBBR1-MCS4质粒并电转入16M构建过表达株16M-BSR1955;分析缺失株和过表达株在模拟胞内环境和小鼠体内的存活能力。BSR1955在布鲁菌16M中存在转录且在不同刺激条件下转录水平不同;共预测出BSR1955的靶基因45个;BSR1955缺失或过表达影响布鲁菌16M在体外的生长能力,缺失BSR1955后在高盐、高渗环境中生存能力提高,第28和45天在小鼠脾脏内的细菌数量显著增加,表明BSR1955影响了布鲁菌的毒力。非编码小RNABSR1955影响布鲁菌16M在胞内的生存能力。     

鼠伤寒沙门菌sapC基因缺失株的构建及生物学特性分析

旨在研究鼠伤寒沙门菌ABC转运膜蛋白SapC在沙门菌致病机制中的功能。本研究利用λ-Red重组技术构建了鼠伤寒沙门菌sapC基因缺失突变株SMΔsapC,对其进行生长特性、酸性应激试验、多黏菌素B敏感性试验、生物被膜检测、胞内存活和小鼠体内毒力试验。结果显示,基因缺失株SMΔsapC与亲本菌株和互补菌株相比,其生长速度无明显差异;在酸应激条件下,SMΔsapC存活率显著低于亲本菌株;sapC基因缺失降低了鼠伤寒沙门菌生物被膜的形成能力;同时,SMΔsapC基因缺失株在鼠源巨噬细胞内的增殖能力和小鼠体内的毒力显著低于亲本菌株。研究表明,sapC基因影响鼠伤寒沙门菌的抗酸能力、生物被膜形成能力,从而影响沙门菌在体内外的毒力。本研究为进一步阐释鼠伤寒沙门菌的致病机制奠定了基础。     

RNaseⅢ RncS对单核细胞增生李斯特菌毒力的调控作用研究

核糖核酸酶RnaseⅢ是一种调控nc RNA水平的重要酶系。为了解核糖核酸酶RnaseⅢRncS在单核细胞增生李斯特菌(LM)毒力中的调控作用,本研究在构建LM-ΔrncS基因缺失突变株的基础上,通过动物感染试验检测强毒株LM-SB5与缺失株LM-Δrnc S对昆明系小鼠的LD50、存活能力、脏器载菌量及病理组织学产生的影响;利用细胞侵染试验检测强毒株与缺失株对小鼠巨噬细胞RAW264.7的粘附率、侵袭率及其在胞内生存繁殖能力的影响,分析RnaseⅢRncS对LM毒力的影响。结果显示,LM-SB5强毒株和LM-Δrnc S缺失株对昆明系小鼠的LD50分别为105.60 CFU、106.90 CFU;与LM-SB5强毒株相比,LM-Δrnc S的LD50升高了1.30个对数数量级,小鼠的存活时间明显延长,表明毒力显著降低;第3~5 d肝脏、脾脏载菌量显著减少(P<0.05),其中第4 d差异极显著(P<0.01);LM-Δrnc S缺失株对肝脏、脾脏、肾脏的病理损伤降低;LM-Δrnc S缺失株对RAW264.7细胞的粘附率和侵袭率均显著低于LM-SB5强毒株(P<0.01),在2~6 h之间,LM-Δrnc S缺失株在细胞内的细菌量显著低于LM-SB5强毒株(P<0.05),证实LM-Δrnc S在细胞内的生存增殖能力显著降低,提示rnc S基因对LM毒力发挥有一定的调控作用。本研究为进一步揭示RnaseⅢ在LM毒力中的分子调控机制提供了科学依据。     

猪布鲁菌S2omp10基因缺失株的构建及特性

现有的布鲁菌减毒活疫苗存在一定毒力,且野强毒株和减毒活疫苗株间缺少可供鉴别的抗原,导致在血清学检测上自然感染与疫苗接种很难区分,限制了现有的减毒活疫苗的广泛应用.本文拟对布鲁菌的减毒活疫苗株S2进行遗传改造,克服上述缺陷.本研究利用同源重组的方法,得到了布鲁菌S2株omp10基因缺失株.分别用基因缺失株和疫苗株感染小鼠,比较基因缺失株小鼠体内的存活能力.结果成功构建了布鲁菌S2株omp10基因缺失株,动物试验结果表明,基因缺失株仍能在小鼠体内存活,具备作为减毒活疫苗的特性.与原始S2株比较,基因缺失株的感染力进一步减弱.表明omp10基因在布鲁菌的毒力及体内生存方面发挥了作用,为基因标记疫苗的研制奠定了基础.     

单增李斯特菌谷氧还蛋白调控氧化应激相关基因转录的研究

本实验室前期对单增李斯特菌(LM)谷氧还蛋白(Grx)转录组数据进行了分析，在此基础上为了对Grx调控细胞色素氧化酶等应激相关基因(lmo0722、qox A、qox B、gr)的转录及其作用机制研究，本研究将Δgrx与野生株EGD-e经4 mmol/L肼应激后，分别提取总RNA并反转录为cDNA作为模板，利用RT-q PCR检测Grx调控细胞色素氧化酶等应激相关基因转录情况，结果显示，Δgrx与野生株EGD-e相比，grx基因缺失引起qox B、qox A、gr、lmo0722等基因的转录水平显著上调(分别上调30、29、17和5.6倍)。利用李斯特菌穿梭质粒构建携带调控基因启动子序列的gfp报告质粒，电转化至野生株EGD-e和缺失株Δgrx感受态细胞中，获得含GFP的重组报告菌株。将这两种含GFP的重组报告菌液分别加入4 mmol/L肼后检测荧光强度，结果显示，EGD-e携带的GFP荧光数值显著低于缺失株Δgrx (P<0.01)，进一步表明Grx参与调控上述应激相关基因的转录。将扩增的lmo0722、qox A、qox B和gr基因的启动子和Grx、Prf A和GAPDH重...     

肠炎沙门菌sufB基因缺失株的构建及其相关生物学特性研究

为了解铁硫簇蛋白对肠炎沙门菌致病作用的影响,本研究利用λ-Red同源重组系统构建了肠炎沙门菌(C50336) suf B基因缺失突变株(C50336Δsuf B),并对其生物学特性进行分析,探究Suf B蛋白在肠炎沙门菌致病过程中的作用。结果显示,缺失株C50336Δsuf B与野生型菌株和回复菌株相比,其生长速度、生化特性无明显差异,但其对酸性应激、H2O2处理和高渗环境的适应能力显著下降,在血清中存活率明显降低。动物实验结果显示,suf B基因缺失突变株的毒力和体内存活能力均严重下降。本研究证实suf B基因与肠炎沙门菌毒力密切相关,为进一步阐释肠炎沙门菌感染致病机制奠定基础。     

分子伴侣prsA2基因缺失对单增李斯特菌致病性的影响

【目的】构建单增李斯特菌分子伴侣prsA2基因缺失株与回补株，探究其对单增李斯特菌内化素B(InlB)锚定能力以及致病性的影响。【方法】利用穿梭质粒pKSV7和回补质粒pIMK2分别构建prsA2基因缺失株与回补株；通过生长曲线分析亲本株10403S、缺失株ΔprsA2和回补株CΔprsA2生长能力；利用Western blotting检测prsA2基因缺失对单增李斯特菌InlB锚定的影响；通过肠上皮细胞(Caco-2)黏附侵袭试验与免疫荧光试验、小鼠毒力试验分析prsA2基因缺失对单增李斯特菌黏附侵袭能力、在宿主细胞间迁移能力及小鼠致病性的影响。【结果】PCR扩增结果显示，试验成功构建了缺失株ΔprsA2和回补株CΔprsA2。生长曲线结果显示，prsA2基因缺失不影响单增李斯特菌在BHI培养基中的生长能力(P>0.05)。Western blotting结果显示，缺失株ΔprsA2细菌表面的InlB锚定量极显著低于10403S和CΔprsA2(P<0.01),细菌培养上清中InlB锚定量极显著高于10403S和CΔprsA2(P<0.01)。细胞试验结果显示，缺失...     

肠炎沙门菌C50336ZinT基因缺失株构建及其相关生物学特性

为研究锌调控蛋白ZinT在肠炎沙门菌致病中的作用,本试验利用λ-Red同源重组系统构建了肠炎沙门菌(C50336)ZinT基因缺失突变株(C50336ΔZinT),并对其生物学特性进行分析。结果显示,与野生型菌株和回复菌株相比,缺失株C50336ΔZinT在LB培养基中生长速度无明显差异,生化特性亦无明显变化,但其在Minimal培养基中生长明显变慢。此外缺失株C50336ΔZinT对H_2O_2处理和高渗环境的适应能力显著下降,但在巨噬细胞内的存活率无明显降低。动物试验表明,ZinT基因缺失突变株的毒力和野生型菌株相比仅有轻微下降。本试验探讨了ZinT与肠炎沙门菌锌摄取和毒力间的联系,为进一步阐释肠炎沙门菌感染致病机制奠定基础。     

单增李斯特菌srtA基因缺失株的构建及srtA基因对其毒力的影响研究

为了研究srtA 基因对单增李斯特菌LM90SB2毒力的影响,本研究利用同源重组技术构建了LM90SB2 srtA 基因缺失株LM90SB2-ΔsrtA,比较分析了亲本株LM90SB2与缺失株LM90SB2-ΔsrtA对MBMEC、HBMEC、RAW264.7、SIEC 4种细胞系的粘附、侵袭、胞内增值能力及LM90SB2和LM90SB2-ΔsrtA 感染小鼠后,小鼠的LD50及肝脏、脾脏、脑载菌量变化差异。结果显示,本研究成功构建了srtA 基因缺失株;与亲本株LM90SB2比较,缺失株LM90SB2-ΔsrtA 对RAW264.7和SIEC的粘附率、侵袭率及胞内细菌数量均下降,且差异具有显著统计学意义(p <0.05);小鼠 LD50降低了21.38倍,肝脏、脾脏载菌量降低,差异具有显著统计学意义(p <0.05)。本研究结果表明,srtA 基因对单增李斯特菌LM90SB2的毒力具有关键作用,参与粘附、侵袭BMEC,该研究结果为进一步阐明单增李斯特菌毒力因子的致病机制提供理论依据。     

单增李斯特菌inlK基因缺失株的构建及其生物学特性分析

为了分析内化素InlK对单增李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)生物学特性及致病性的影响,利用自杀性质粒进行同源重组构建LM标准菌株10403s的inlK基因缺失株,然后比较分析野生株、inlK基因缺失株的生长特性、生物被膜形成能力、细胞侵袭能力、动物致病力等差异。结果显示,inlK基因缺失不影响LM的生长速度,但可导致LM的生物被膜形成能力下降。细胞感染试验表明基因缺失株ΔinlK对RAW264.7细胞的侵袭及胞内存活能力分别下降了18%和31%。动物感染试验显示野生株和基因缺失株ΔinlK对小鼠的致死率分别为80%(4/5)和40%(2/5),且基因缺失株ΔinlK的体内定殖能力显著低于野生株。本研究表明内化素InlK在LM感染过程中发挥着重要作用,为了解LM的致病作用提供参考。     

肠炎沙门菌SPI-19编码的Hcp基因缺失株的毒力相关功能研究

为研究肠炎沙门菌SPI-19编码的Hcp基因在肠炎沙门菌感染中的毒力作用,利用Red同源重组系统对2株肠炎沙门菌(国内标准株50336和国际参考株SD-2)SPI-19的Hcp基因进行敲除,成功构建了50336ΔHcp和SD-2ΔHcp基因缺失株,并构建了回补株50336ΔHcp/pHcp和SD-2ΔHcp/pHcp。分析比较缺失株与野生株对人肠上皮细胞系Caco-2黏附和侵袭能力,以及在鸡巨噬细胞HD11的存活能力。结果显示:缺失Hcp基因后,肠炎沙门菌50336对Caco-2细胞黏附和侵袭数量分别下降39.1%和47.9%;SD-2对Caco-2细胞黏附和侵袭数量分别下降46.5%和58.9%。吞噬作用2h后,50336ΔHcp和SD-2ΔHcp与野生株相比在HD11的存活量下降了35.7%和37.2%,差异显著。通过Real Time-PCR试验分析,与野生株相比,Hcp基因缺失后fliC、sefA、ompA,ompC这4个重要粘附因子编码基因的表达量显著下降。试验表明,肠炎沙门菌SPI-19编码的Hcp基因对肠炎沙门菌的毒力具有增强作用。     

基于RNA-seq识别布鲁菌酸调控候选基因

布鲁菌作为胞内寄生菌,在胞内生存面临很多压力。特别是感染早期,胞内的酸化是布鲁菌生存的必要条件。本试验利用RNA-seq,对正常培养条件、酸性培养条件的布鲁菌进行比较转录组学分析。结果表明,在酸性条件下113个基因表达发生显著变化(IlogRatiol≥3),其中44%表达上调。经pathway分析,差异基因分布在51个通路,其中与布鲁菌胞内生存及毒力相关的通路有6个,分别是氧化磷酸化、离子转运、细菌分泌系统、转录调节系统、二元转运调控系统和ABC转运系统。布鲁菌对于酸性生存环境表现多通路、多基因的适应性变化,该研究为系统掌握酸调节基因奠定基础。     

不同种型布鲁菌标准株的比较基因组学研究

探究不同种型布鲁菌标准株的基因组构成差异。通过布鲁菌全基因组DNA芯片技术对19株不同种型布鲁菌标准株进行比较基因组学研究。结果显示：19株不同种型布鲁菌标准株之间存在大量缺失基因,同时发现一些基因以多拷贝形式存在。缺失基因的功能大致分为4类：信息储存和传递;胞内活动处理;营养代谢、功能未知或仅了解部分功能,共鉴定到这类基因211个。深入认识了19株不同种型布鲁茵标准株基因组组成上的差异,为我们进一步认识不同种以及亚型在毒力以及宿主特殊性提供了依据。大量缺失基因在19株布鲁菌标准株出现,构成了布鲁菌标准株不同种以及亚型之间的遗传学基础。     

迟缓爱德华菌menF基因缺失株的构建及生物学特性研究

为研究异分支酸合成酶MenF在迟缓爱德华菌(E.tarda)致病中的作用,本研究利用自杀载体构建了E.tarda menF基因缺失菌株(ET-CLΔmenF),并分析其生物学特性。结果显示,ET-CLΔmenF株比野生菌株生长减缓。体外应激试验结果表明,ET-CLΔmenF菌株对铁饥饿的耐受能力明显下降,应对酸性和过氧化氢处理的能力显著下降。细胞感染实验表明ET-CLΔmenF菌株的胞内存活能力显著下降(p0.01)。对斑马鱼的致病性结果表明,ET-CLΔmenF株毒力下降。本研究为E.tarda致病机制研究以及疫苗的研制提供了参考。     

LIPI-4 EⅡC调控单增李斯特菌关键毒力因子转录的研究

【目的】探究单增李斯特菌(LM)毒力岛4(LIPI-4)中膜透性酶ⅡC(EⅡC)对LM关键毒力基因表达的影响。【方法】构建分离株LM928 EⅡC基因缺失株LM928ΔEⅡC和回补菌株CLM928ΔEⅡC,测定各菌株的生长曲线和对不同糖的发酵情况,测定侵染人脑微血管内皮细胞(HCMEC/D3)后的黏附、侵袭和胞内增殖能力,利用实时荧光定量PCR方法检测在脑心浸液(BHI)培养条件下和侵染HCMEC/D3后各菌株毒力基因的转录水平。【结果】成功构建LM928 EⅡC基因缺失株LM928ΔEⅡC和回补菌株CLM928ΔEⅡC。EⅡC基因的缺失不影响LM928的生长和对葡萄糖、纤维二糖、果糖、鼠李糖、七叶苷和水杨苷的发酵。EⅡC基因缺失后,LM928对HCMEC/D3的侵袭率极显著下降(P<0.01),黏附能力无显著变化(P>0.05)。LM928ΔEⅡC胞内增殖菌量在2～4 h时显著低于LM928和CLM928ΔEⅡC(P<0.05),但在8～12 h时均显著高于LM928和CLM928ΔEⅡC(P<0.05)。在BHI培养条件下,LM928ΔEⅡC毒力基因hly、...