鼠伤寒沙门菌SL1344株cAMP受体蛋白基因缺失株的构建及其生物学特性

通过自杀性质粒介导的细菌同源重组技术,构建鼠伤寒沙门菌SL1344株的crp基因缺失疫苗候选菌株,并对其生物学特性进行初步研究。首先构建含缺失321bp crp基因的重组自杀性质粒pREΔcrp,然后利用重组自杀性质粒介导的等位基因交换技术,两步法筛选SL1344的Δcrp缺失株,用PCR鉴定结果表明该缺失株构建成功。生物学特性研究发现,缺失株ΔcrpSL1344保留了亲本菌株SL1344的血清型1,4,5,12：i：1,2,且能够稳定遗传缺失321bp的crp基因;但是,与亲本株SL1344相比,其生化特性发生明显改变,生长速度明显减慢。缺失株ΔcrpSL1344口服感染1日龄雏鸡的LD50为7.40×109 CFU,毒力较亲本株SL1344降低32 456倍。以上研究结果表明,SL1344株crp基因缺失株构建成功,且遗传稳定,毒力明显降低,为进一步将其开发为鼠伤寒沙门菌弱毒疫苗候选菌株奠定基础。     

减毒鼠伤寒沙门菌ΔcrpΔcyaSL1344株asd平衡致死系统的构建及其特性

为构建能稳定携带外源基因的减毒鼠伤寒沙门菌ΔcrpΔcyaΔasdSL1344,本研究在减毒鼠伤寒沙门菌ΔcrpΔcyaSL1344基础上,以χ7213（pREΔasd）为供体菌,ΔcrpΔcyaSL1344为受体菌,利用自杀性质粒介导的等位交换技术成功筛选出缺失编码天冬氨酸β-半乳糖脱氢酶基因（aspartic semialdehyde dehydrogenase,asd）的ΔcrpΔcyaΔasdSL1344菌株,进一步对其生物学特性进行初步研究。结果显示,其血清型和亲本株ΔcrpΔcyaSL1344及强毒株SL1344相同且该缺失菌株能稳定遗传缺失后的asd基因;其生化特性和生长速度与强毒株SL1344相比有很大差异,与亲本株ΔcrpΔcyaSL1344基本一致,ΔcrpΔcyaΔasdSL1344失去了利用麦芽糖、乳糖、山梨醇等碳源的能力,也不能分解H2S、半乳糖和鼠李糖,但仍保留了利用葡萄糖的能力,其生长速度比强毒株更加缓慢。1日龄雏鸡攻毒试验表明ΔcrpΔcyaΔasdSL1344互补携带asd基因的pYA3493质粒后,ΔcrpΔcyaΔasdSL1344（pYA3493）毒力较强毒株SL1344降低了至少105倍,与亲本株ΔcrpΔcyaSL1344相比毒力仅相差10倍。结果表明,减毒鼠伤寒沙门菌ΔcrpΔcyaΔasdSL1344菌株构建成功,为深入研究以鼠伤寒沙门菌为载体的口服多价疫苗奠定基础。     

马耳他布鲁氏菌OmpR基因缺失株的构建及其对布鲁氏菌生长与复制的影响

为探究布鲁氏菌OmpR基因的功能,本研究以马耳他布鲁氏菌M28为亲本株,利用同源重组构建OmpR基因缺失株M28ΔOmpR。菌落生长实验显示:M28ΔOmpR生长速度极显著低于亲本株M28(p0.001),回补株M28ΔOmpR-com可恢复菌落生长速度。巨噬细胞感染试验显示:M28ΔOmpR与M28相比,细菌分离数极显著降低2 Log10以上(p0.001),回补株M28ΔOmpR-com可恢复其在巨噬细胞中的复制能力。小鼠感染实验显示:感染1周后,M28ΔOmpR接种小鼠比M28接种小鼠脾重极显著降低(p0.001);第4周,前者细菌分离数极显著降低,二者相差0.8 Log10(p0.001)。以上结果表明,OmpR基因缺失抑制马耳他布鲁氏菌菌落生长,显著降低其在巨噬细胞和小鼠体内的复制能力,研究结果为探究OmpR在布鲁氏菌中的作用机制奠定了基础。     

羊种布鲁氏菌M5-90疫苗株铁应答调控因子irr和rirA基因缺失株的构建与鉴定

为研究铁调控因子irr和rirA在羊种布鲁氏菌(Brucella melitensis)感染过程中的作用,本研究通过卡那替换的方法构建两个缺失株M5-90Δirr和M5-90ΔrirA,分别将亲本株和缺失株在相同营养条件下培养36 h,观察其振荡培养时的生长变化趋势。分别将1×10~8 CFU M5-90Δirr、M5-90ΔrirA和M5-90接种到含1.5 mol/L NaCl、pH 2.5、pH 11.5、10 mmol/L H_2O_2的1 mL布鲁氏菌液体培养基,比较缺失株和亲本株在不同条件下的生长特性;分别以1×10~6 CFU M5-90Δirr、M5-90ΔrirA和M5-90感染小鼠巨噬细胞RAW264.7检测缺失株的黏附、侵袭和胞内生存能力。结果显示,在相同体外培养条件下缺失株M5-90Δirr和M5-90ΔrirA生长速度明显低于亲本株;M5-90Δirr、M5-90ΔrirA在高盐、强酸和强碱环境下生存率均显著或极显著低于亲本株(P0.05;P0.01),在H_2O_2条件下这两个缺失株的生存率却显著高于亲本株(P0.05)。与亲本株相比,缺失株在小鼠巨噬细胞RAW264.7内的侵袭和黏附能力均减弱,在感染后45 min缺失株M5-90Δirr和M5-90ΔrirA的黏附和侵袭能力均极显著低于亲本株(P0.01),但在感染后24 h,这两个缺失株在细胞内繁殖能力与亲本株相比有所增强。本研究报道了irr和rirA基因不仅调控了羊种布鲁氏菌的生长,同时对细菌黏附和侵袭能力也产生一定的影响,M5-90Δirr和M5-90ΔrirA是两株具有潜力的布鲁氏菌候选疫苗株。     

鼠伤寒沙门菌sapC基因缺失株的构建及生物学特性分析

旨在研究鼠伤寒沙门菌ABC转运膜蛋白SapC在沙门菌致病机制中的功能。本研究利用λ-Red重组技术构建了鼠伤寒沙门菌sapC基因缺失突变株SMΔsapC,对其进行生长特性、酸性应激试验、多黏菌素B敏感性试验、生物被膜检测、胞内存活和小鼠体内毒力试验。结果显示,基因缺失株SMΔsapC与亲本菌株和互补菌株相比,其生长速度无明显差异;在酸应激条件下,SMΔsapC存活率显著低于亲本菌株;sapC基因缺失降低了鼠伤寒沙门菌生物被膜的形成能力;同时,SMΔsapC基因缺失株在鼠源巨噬细胞内的增殖能力和小鼠体内的毒力显著低于亲本菌株。研究表明,sapC基因影响鼠伤寒沙门菌的抗酸能力、生物被膜形成能力,从而影响沙门菌在体内外的毒力。本研究为进一步阐释鼠伤寒沙门菌的致病机制奠定了基础。     

双元调控系统LisRK对单增李斯特菌抗酸应激与侵袭力作用的研究

【目的】 试验旨在阐明双元调控系统LisRK在单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)抵抗不利环境应激以及感染过程中的作用。【方法】 以参考菌株10403S为亲本株，利用穿梭质粒pKSV7通过同源重组方法构建lisRK基因缺失株，并基于表达质粒pIMK2构建了lisRK回补株；比较了亲本株10403S、缺失株ΔlisRK与回补株CΔlisRK在酸(pH 4.5)、渗透压(5% NaCl)和氧化(10 mmol/L H₂O₂)应激条件下的生长与存活能力及其对胃腺癌细胞MGC803和肠上皮细胞Caco-2的侵袭率，进一步比较了亲本株10403S、缺失株ΔlisRK与回补株CΔlisRK经腹腔注射感染的小鼠肝脏和脾脏中的细菌载量。【结果】 应激试验结果显示，lisRK基因缺失显著降低单增李斯特菌在酸应激(pH 4.5)条件下的生长能力，但不影响该菌在5% NaCl和10 mmol/L H₂O₂中的生长能力；缺失株ΔlisRK在强酸应激条件下(pH 2.5)的存活率(0.57%)极显著低于亲本株(2.07%)与回补株(1.97%)(P < 0.01)。细胞侵袭试验显示，缺失株ΔlisRK对肠上皮细胞Caco-2和胃腺癌细胞MGC803的侵袭率分别为2.04%和0.13%，极显著或显著低于亲本株与回补株(P < 0.01；P < 0.05)。小鼠感染试验显示，在感染后48 h，缺失株ΔlisRK在小鼠肝脏和脾脏中的细菌载量分别为7.42×10⁷和1.87×10⁷ CFU，均低于亲本株和回补株感染小鼠肝脏和脾脏中的细菌载量，但并无显著性差异(P > 0.05)。【结论】 双元调控系统LisRK缺失减弱单增李斯特菌的抗酸应激能力和对宿主细胞的侵袭能力。     

羊种布鲁氏菌M5-90疫苗株铁应答调控因子irr和rirA基因缺失株的构建与鉴定

为研究铁调控因子irr和rirA在羊种布鲁氏菌（Brucella melitensis）感染过程中的作用,本研究通过卡那替换的方法构建两个缺失株M5-90Δirr和M5-90ΔrirA,分别将亲本株和缺失株在相同营养条件下培养36 h,观察其振荡培养时的生长变化趋势。分别将1×10⁸ CFU M5-90Δirr、M5-90ΔrirA和M5-90接种到含1.5 mol/L NaCl、pH 2.5、pH 11.5、10 mmol/L H₂O₂的1 mL布鲁氏菌液体培养基,比较缺失株和亲本株在不同条件下的生长特性;分别以1×10⁶ CFU M5-90Δirr、M5-90ΔrirA和M5-90感染小鼠巨噬细胞RAW264.7检测缺失株的黏附、侵袭和胞内生存能力。结果显示,在相同体外培养条件下缺失株M5-90Δirr和M5-90ΔrirA生长速度明显低于亲本株;M5-90Δirr、M5-90ΔrirA在高盐、强酸和强碱环境下生存率均显著或极显著低于亲本株（P<0.05;P<0.01）,在H₂O₂条件下这两个缺失株的生存率却显著高于亲本株（P<0.05）。与亲本株相比,缺失株在小鼠巨噬细胞RAW264.7内的侵袭和黏附能力均减弱,在感染后45 min缺失株M5-90Δirr和M5-90ΔrirA的黏附和侵袭能力均极显著低于亲本株（P<0.01）,但在感染后24 h,这两个缺失株在细胞内繁殖能力与亲本株相比有所增强。本研究报道了irr和rirA基因不仅调控了羊种布鲁氏菌的生长,同时对细菌黏附和侵袭能力也产生一定的影响,M5-90Δirr和M5-90ΔrirA是两株具有潜力的布鲁氏菌候选疫苗株。     

单增李斯特菌srtA基因缺失株的构建及srtA基因对其毒力的影响研究

为了研究srtA 基因对单增李斯特菌LM90SB2毒力的影响,本研究利用同源重组技术构建了LM90SB2 srtA 基因缺失株LM90SB2-ΔsrtA,比较分析了亲本株LM90SB2与缺失株LM90SB2-ΔsrtA对MBMEC、HBMEC、RAW264.7、SIEC 4种细胞系的粘附、侵袭、胞内增值能力及LM90SB2和LM90SB2-ΔsrtA 感染小鼠后,小鼠的LD50及肝脏、脾脏、脑载菌量变化差异。结果显示,本研究成功构建了srtA 基因缺失株;与亲本株LM90SB2比较,缺失株LM90SB2-ΔsrtA 对RAW264.7和SIEC的粘附率、侵袭率及胞内细菌数量均下降,且差异具有显著统计学意义(p <0.05);小鼠 LD50降低了21.38倍,肝脏、脾脏载菌量降低,差异具有显著统计学意义(p <0.05)。本研究结果表明,srtA 基因对单增李斯特菌LM90SB2的毒力具有关键作用,参与粘附、侵袭BMEC,该研究结果为进一步阐明单增李斯特菌毒力因子的致病机制提供理论依据。     

肠炎沙门菌双组份系统qseC基因缺失株的构建及其生物学特性分析

为研究肠炎沙门菌qseC基因功能,构建qseC缺失株C50041ΔqseC以及回复株C50041ΔqseC::qseC,分析qseC基因缺失对肠炎沙门菌生化特性、生长曲线、运动性、黏附侵袭等方面的影响,探究该基因在肠炎沙门菌感染致病中的作用。结果显示:利用框内缺失突变技术成功获得肠炎沙门菌C50041ΔqseC缺失株,以野生株C50041、回复株C50041ΔqseC::qseC为对照,发现C50041ΔqseC缺失株的生化特性、生长曲线与C50041野生株一致,但其运动性(P=0.001 9)以及对巨噬细胞J774A.1的黏附率(P=0.032 5)、侵袭率(P=0.005 3)相比野生株显著下降。研究提示:qseC基因的缺失对肠炎沙门菌的生化特性和生长曲线没有影响,但会显著降低肠炎沙门菌的运动能力及对宿主细胞的黏附和侵袭。研究初步探究了肠炎沙门菌qseC基因的功能,为后续深入研究奠定基础。     

鼠伤寒沙门菌SL1344株AcrpAasd缺失株的构建及生物学特性初步研究

构建鼠伤寒沙门菌SL1344△cr户△nsd双基因缺失突变株,并对其生物学特性进行初步研究。首先以Y7213（pREAasd）为供体菌,SL1344Acrp为受体菌进行结合转移,通过自杀性质粒介导的等位交换技术两步法筛选sI,1344的AcrpAasd双缺失株。该缺失株在有外源DAP的存在下能够正常生长,且能稳定遗传缺失的“sd基因;其血清型与亲本株SL1344Acrp及强毒株SL1344保持一致;其生化特性与亲本株基本相同,但与强毒株相比变化较明显,且生长速度明显减慢;雏鸡毒力试验结果表明其毒力较SL1344降低约10j倍。鼠伤寒沙门菌SL1344AcrpzSasd缺失株构建成功,为进一步开发以鼠伤寒沙门菌为载体的口服疫苗奠定了基础。     

牦牛源多杀性巴氏杆菌C47-8株外膜蛋白H基因互补株的构建及生物学特性研究

根据Gen Ban K中发表的多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,P.multocida)HN06株(登录号为NC017027)的omp H核苷酸序列设计合成一对特异性引物,将PCR扩增获得的牦牛源P.multocida C47-8的omp H基因片段连接到p MR10载体上,构建了C47-8株Δomp H缺失株互补质粒p MR10-Δomp H,并将该质粒电转化至C47-8Δomp H缺失株中,成功获得其互补菌株。在此基础上,对C47-8亲本株、Δomp H缺失株以及互补株的生物学特性进行研究。形态学观察结果表明,3株菌的生长形态无差异;生化试验结果表明,除了缺失株发酵蕈糖、硝酸盐试验呈现阳性外,3株菌的其余生化特性未发生改变;体外生长曲线表明亲本株C47-8的生长速度比缺失株和互补株的生长速度慢,说明omp H基因对C47-8的生长有显著影响。本试验为深入研究P.multocida的致病机制以及研制安全有效的基因缺失减毒活疫苗奠定了基础。     

布鲁菌铁转录调控因子rirA基因突变株的构建与鉴定

为了构建牛布鲁菌S2308(简称S2308)的铁转录调控因子rirA基因突变株(S2308ΔrirA),探讨该基因对自身生长的影响以及其对不同类型细胞黏附侵袭和胞内繁殖的作用。利用同源重组和抗性替换的方法,以卡那抗性基因替换rirA基因,获得突变株S2308ΔrirA。将亲本株S2308、疫苗株RB51和突变株S2308ΔrirA在相同营养条件下培养,观察其振荡培养时的生长变化趋势和静置培养时的聚集状态。将各菌株侵染人胚胎滋养层细胞(HPT-8)和小鼠巨噬细胞(RAW264.7),分别检测其黏附侵袭能力和胞内生存能力。结果显示,成功获得了布鲁菌rirA基因突变株且10代内未发生回复性突变;与亲本株相比,S2308ΔrirA在相同体外培养条件下其生长趋势未发生明显改变,且其凝集状态与亲本株类似;黏附侵袭试验显示,S2308ΔrirA对HPT-8细胞的黏附侵袭能力显著强于亲本株,而其对RAW264.7的黏附侵袭能力在一定程度上弱于亲本株;布鲁菌胞内生存试验发现,布鲁菌侵染HPT-8细胞24h后,其胞内细菌数量显著升高,而侵染巨噬细胞24h后,S2308ΔrirA的繁殖能力明显低于亲本株。这些结果表明,铁转录调控因子rirA基因参与了布鲁菌胞内寄生的过程,并与菌株的毒力强弱存在密切联系。     

羊种布鲁氏菌WadC基因缺失株的构建与鉴定

试验旨在分析糖基转移酶编码基因WadC影响布鲁氏菌胞内存活的作用。以羊种布鲁氏菌Rev.1基因组为模板,通过同源重组方法获得WadC基因上、下游同源臂融合片段,并与载体pUC19-SacB连接,构建pUC19-SacB-ΔwadC重组载体,电转至羊种布鲁氏菌Rev.1,构建ΔwadC缺失株（Rev.1ΔwadC）,检测菌株Rev.1ΔwadC的遗传稳定性,比较分析亲本株Rev.1和缺失株Rev.1ΔwadC的生长特性及其在BMDC和RAW264.7细胞中的生存能力。结果显示,试验成功构建基因缺失株,连续传代30次未发现基因回复突变;在体外相同培养条件下,缺失株Rev.1ΔwadC与亲本株Rev.1生长趋势相似,均在20 h到达对数生长期,44 h进入平台期;侵染BMDC细胞48和72 h时,其胞内存活率显著低于亲本株（P<0.05）;而侵染小鼠RAW264.7巨噬细胞试验显示,亲本菌株和基因缺失株无显著性差异（P>0.05）。综上所述,本试验成功构建并获得了具有良好遗传稳定性的布鲁氏菌WadC基因缺失株,该缺失株在体外培养条件下与亲本株生长趋势相似;但该缺失株在BMDC细胞内的存活能力显著变弱,为深入研究布鲁氏菌WadC基因功能奠定基础。     

肠炎沙门菌ArgG基因缺失株的构建及生物学特性分析

为研究ArgG基因对肠炎沙门菌的致病作用和生物学特性的影响，本试验利用λ-Red重组法构建肠炎沙门菌ArgG基因缺失株，并从生化特性、生长特性、生物被膜形成能力、运动能力、体外应激、巨噬细胞存活能力等方面进行研究。结果显示，与野生型菌株相比，ArgG基因缺失株生化特性、运动能力无明显变化，在LB培养基中生长速度变化不明显，但在M9培养基中缺失株不生长；ArgG基因缺失株生物被膜形成能力下降约60%,抗酸、碱应激能力分别下降约12%和10%左右，巨噬细胞内的存活能力和其对小鼠的毒力降低。本研究成功构建了肠炎沙门菌ArgG基因缺失株，并证明ArgG基因与营养代谢、抗应激能力和毒力密切相关，为肠炎沙门菌的基因缺失苗的研究提供理论依据。     

单增李斯特菌(LM90)inlA单基因及inlB/inlA双基因缺失株的构建及其生物学特性初步研究

为探究内化素inlA、inlB基因缺失对单核细胞增生性李斯特菌(LM)生物学特性的影响,本研究采用同源重组技术构建了inlA基因缺失株(LM90-inlA)和inlB、inlA双基因缺失株(LM90-ΔinlB/ΔinlA),并对其生物学特性进行了初步研究。结果显示:PCR和测序结果证实成功构建了目的基因(inlA、inlB)缺失株;菌落PCR和测序结果显示2种缺失株在体外连续培养20代过程中均能稳定遗传;生长特性实验表明2种缺失株与亲本株生长差异无统计学意义(t_(LM90/LM90-ΔinlA=0.34),p0.05;t_(LM90/LM90-ΔinlB/ΔinlA)=0.324,p0.05;t_(LM90-ΔinlA/LM90-ΔinlB/ΔinlA)=0.008,p0.05)且inlA缺失后2缺失株对小鼠的LD_(50)分别升高了0.64、1.26个对数数量级。研究结果表明inlA基因和inlB基因对LM90的部分生物学特性具有一定的调控作用,这对于阐明LM毒力因子的致病机理提供了参考依据,也为研究内化素介导LM穿越血脑屏障(BBB)的作用机制奠定了科学基础。     

糖基转移酶GalU对单增李斯特菌致病性的影响

为了探明糖基转移酶GalU对单增李斯特菌致病性的影响,本研究利用同源重组技术构建了galU基因缺失株,分析了亲本株ScottA、缺失株ΔgalU和回补株CΔgalU的生长能力、对细胞的黏附侵袭能力以及对小鼠的致病性。生长试验结果显示,galU基因缺失并不影响单增李斯特菌在BHI培养基中的生长能力。细胞侵染试验结果显示,ΔgalU对肠上皮细胞Caco-2的黏附率(0.74±0.18)%和侵袭率(0.70±0.10)%均显著低于亲本株ScottA的黏附率(2.01±0.11)%和侵袭率(2.48±0.25)%,回补株CΔgalU与亲本株的黏附侵袭率则并无显著性差异。免疫印迹结果显示,内化素InlB在ΔgalU细菌表面的锚定量显著低于亲本株,但其表面InlA的锚定量与亲本株并无显著性差异。小鼠试验结果显示,ΔgalU感染的小鼠肝脏和脾脏中的细菌载量分别为(3.76×10~7±1.41×10~7)CFU/g和(2.88×10~7±2.31×10~7)CFU/g,均显著低于亲本株感染小鼠肝脏和脾脏中的细菌载量;此外,ΔgalU感染组小鼠的存活率高于亲本株,但与回补株感染组小鼠的存活率一致。上述结...     

牛种布鲁氏菌A19 VirB启动子缺失株的构建及其生物学特性研究

为探究VirB基因对牛种布鲁氏菌A19株毒力的影响,深入了解布鲁氏菌胞内存活的机制,本研究以牛种布鲁氏菌A19株为模板,利用VirB基因的上下游同源臂融合kana抗性基因构建自杀质粒。以瞬间电击的方式,将自杀质粒电转进菌体,利用同源重组将VirB启动子用kana基因替换,构建A19ΔVirB缺失株。通过实时荧光定量PCR检测缺失株VirB相关蛋白的转录水平,并对缺失株的生长曲线、体外应激、黏附侵袭及胞内生存进行分析。结果显示,试验成功构建A19ΔVirB缺失株。实时荧光定量PCR结果显示,缺失株VirB相关蛋白的表达量极显著低于A19株(P0.01),其生长曲线虽然不同于亲本株,但生长趋势相同。体外应激结果显示,A19株和A19ΔVirB株热休克应激没有明显变化,但在强酸、强碱、高盐的刺激下,A19株的存活率显著高于A19ΔVirB株(P0.05)。黏附侵袭结果显示,缺失株对巨噬细胞的黏附侵袭能力近似于亲本株。胞内生存结果显示,随着时间的延长,A19株的胞内存活趋势逐渐上升,而缺失株A19ΔVirB总体趋势逐渐下降并且与A19的差距越来越大。综上所述,本研究成功构建了VirB启动子缺失株,极显著降低了相关蛋白的表达,为后续相关缺失株的构建及布鲁氏菌毒力的研究奠定基础。     

鼠伤寒沙门氏菌SL1344株△crp△cya缺失株的构建及其生物学特性初步研究

为研制更加安全并保持良好免疫原性的弱毒株鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)及疫苗活载体,本研究通过自杀性质粒介导的细菌同源重组技术,将已缺失cya基因的SL1344株进一步缺失crp基因,构建S.typhi-murium SL1344△crp△cya双基因缺失突变株,并对其生物学特性进行初步研究。双基因缺失株的构建是以含有重组自杀性质粒pRE△crp的大肠杆菌χ7213为供体菌,SL1344△cya为受体菌进行接合转移,两步法筛选crp/cya基因双缺失突变株,并通过PCR和测序鉴定。对双缺失菌株的生物学特性鉴定表明,SL1344△crp△cya血清型与亲本株SL1344△cya及野生株SL1344保持一致,并且能够稳定遗传缺失后的crp基因;其生化特性与亲本株基本相近,但与野毒株相比发生明显变化,生长速度也更为缓慢;对雏鸡致病性测定试验显示,双缺失株毒力比SL1344至少降低了约106倍。实验结果表明,S.typhimurium SL1344△crp△cya缺失株具有良好的遗传稳定性,毒力明显降低,为深入研究以S.typhimurium为载体的口服疫苗奠定了基础。     

RNaseⅢ RncS对单核细胞增生李斯特菌毒力的调控作用研究

核糖核酸酶RnaseⅢ是一种调控nc RNA水平的重要酶系。为了解核糖核酸酶RnaseⅢRncS在单核细胞增生李斯特菌(LM)毒力中的调控作用,本研究在构建LM-ΔrncS基因缺失突变株的基础上,通过动物感染试验检测强毒株LM-SB5与缺失株LM-Δrnc S对昆明系小鼠的LD50、存活能力、脏器载菌量及病理组织学产生的影响;利用细胞侵染试验检测强毒株与缺失株对小鼠巨噬细胞RAW264.7的粘附率、侵袭率及其在胞内生存繁殖能力的影响,分析RnaseⅢRncS对LM毒力的影响。结果显示,LM-SB5强毒株和LM-Δrnc S缺失株对昆明系小鼠的LD50分别为105.60 CFU、106.90 CFU;与LM-SB5强毒株相比,LM-Δrnc S的LD50升高了1.30个对数数量级,小鼠的存活时间明显延长,表明毒力显著降低;第3~5 d肝脏、脾脏载菌量显著减少(P<0.05),其中第4 d差异极显著(P<0.01);LM-Δrnc S缺失株对肝脏、脾脏、肾脏的病理损伤降低;LM-Δrnc S缺失株对RAW264.7细胞的粘附率和侵袭率均显著低于LM-SB5强毒株(P<0.01),在2~6 h之间,LM-Δrnc S缺失株在细胞内的细菌量显著低于LM-SB5强毒株(P<0.05),证实LM-Δrnc S在细胞内的生存增殖能力显著降低,提示rnc S基因对LM毒力发挥有一定的调控作用。本研究为进一步揭示RnaseⅢ在LM毒力中的分子调控机制提供了科学依据。     

布鲁菌Ⅳ型分泌系统效应蛋白DK63-887基因缺失株的构建及鉴定

为了构建羊布鲁菌16M(简称16M)的DK63-887基因缺失株(16MΔDK63-887),探讨该基因与16M介导自噬的关系。利用同源重组和抗性替换的方法,以卡那基因替换DK63-887基因,获得突变株16MΔDK63-887。将亲本株16M、疫苗株M5-90、突变株16MΔDK63-887在相同条件下振荡培养,观察其生长趋势变化;将各菌株置于不同外界环境中,观察其生存率;将各菌株侵染小鼠巨噬细胞,比较它们在宿主细胞内的生存能力及RT-qPCR检测自噬相关基因的表达。成功获得了布鲁菌DK63-887基因缺失株且在20代内未发生回复性突变现象。与亲本株相比,16MΔDK63-887在体外培养生长趋势与亲本株相似,只是细菌的浓度存在一定差异;突变株在外界应激条件下生存能力低于亲本株;侵染4h后缺失株胞内细菌数量明显下降;RT-qPCR检测到突变株的ULKI、Beclin1表达量均显著降低(P0.01),结果表明,布鲁菌Ⅳ型分泌系统效应蛋白与16M介导的细胞自噬密切相关,为16M胞内寄生机制的研究奠定了基础。