非洲猪瘟病毒VP73结构蛋白表达及鉴定

根据GenBank登录的非洲猪瘟病毒(ASFV) VP73基因序列,人工合成VP73主要抗原表位区基因片段,克隆至pUC57载体中.设计1对引物,PCR扩增获得429 bp的VP73基因片段;将VP73基因片段使用EcoRI和SalI酶切后亚克隆至表达载体pGEX-KG,经PCR、酶切、测序鉴定挑选阳性克隆,转化至表达菌株BL21 (DM3)中,进行体外诱导表达,SDS-PAGE和Western blot分析蛋白表达及其活性.结果显示,成功构建表达重组载体pGEX-KG-VP73,对该重组载体进行诱导,有效表达了41 ku重组蛋白,表达量约占菌体总蛋白的17％,Western blot分析证实该蛋白具有良好反应原性.     

急性非洲猪瘟病毒感染致淋巴结损伤及淋巴细胞程序性坏死的研究

为了探讨非洲猪瘟病毒(ASFV)对感染猪淋巴结的损伤作用和致病机制,试验通过对13头猪肌肉注射ASFV毒株Pig/HLJ/18建立急性ASF模型,然后每头猪采集5对淋巴结(颌下、肺门、肝门、肠系膜和腹股沟淋巴结),利用H.E.染色、免疫组化法并结合透射电子显微镜观察,分析猪感染ASFV后淋巴结的病理组织学变化,以及炎症因子、相关坏死性凋亡因子的表达情况。结果表明：ASFV可对淋巴结造成明显损伤,剖检可见淋巴结肿胀、充血、出血,切面呈大理石样变甚至血肿样;镜下可见淋巴结被膜下出血,形成广泛微血栓,淋巴细胞崩解、坏死;炎症因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、γ干扰素(IFN-γ)的表达水平均极显著升高(P<0.01),相关坏死性凋亡因子受体相互作用蛋白3(RIP3)、混合系列蛋白激酶样结构域(MLKL)、多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶-1(PARP-1)、凋亡诱导因子(AIF)的表达水平均极显著升高(P<0.01)。说明ASFV可通过破坏淋巴结单核-巨噬细胞系统,促使炎症因子和相关坏死性凋亡因子过表达,引起淋巴结出血性炎性损伤,淋巴细胞可能发生程序性坏...     

非洲猪瘟病毒抗体检测间接ELISA方法的建立

以基因工程表达的非洲猪瘟病毒VP73蛋白作为包被抗原,建立了间接ELISA方法,用以检测猪血清中抗非洲猪瘟VP73蛋白的抗体。该方法对非洲猪瘟标准阳性血清的检测灵敏度可以达到1∶2 560,与同类进口ELISA试剂盒相当。此方法只特异性检出非洲猪瘟阳性血清,而对猪传染性胸膜肺炎等5种猪传染病阳性血清的检测结果均为阴性,表明其具有良好的特异性。批内和批间重复性试验结果发现,检测同一份血清的变异系数小于10%,表明其重复性较好。包被好的酶标板37℃放置5d后,对同一份血清的检测敏感性无明显变化,初步表明其稳定性较好。利用建立的间接ELISA方法和进口ELISA试剂盒分别对150份血清样品进行非洲猪瘟血清抗体检测,结果表明本方法的特异性和敏感性分别为99.1%和94.3%,2种方法检测结果的符合率为98%。以上试验表明,本试验建立的间接ELISA方法具有良好的特异性和敏感性、较好的重复性和稳定性,可以满足临床检测的需求。     

非洲猪瘟病毒VP73结构蛋白表达及鉴定

 
为获得可作为血清学诊断抗原的体外诱导表达ASFV VP73 结构蛋白,根据GenBank登录的ASFV 基因序列,人工合成VP73主要抗原表位区基因克隆至pUC57载体中,设计1对引物,PCR扩增获得429 nt的VP73基因片段;将VP73基因片段使用EcoRI和SalI酶切后亚克隆至表达载体pGEX KG,经PCR、酶切、测序鉴定挑选阳性克隆,转化进表达菌株BL21(DM3)中进行体外诱导表达,SDS PAGE和Western blot分析蛋白表达及其活性。结果显示,成功构建表达重组载体pGEX KG VP73,且诱导有效表达了41Ku重组蛋白,表达量约占菌体总蛋白的35％;Western blot分析表达该蛋白具有良好的表达活性。试验为建立无感染性、快速、敏感的血清学诊断方法奠定了一定基础。     

急性非洲猪瘟的实验病理学研究

旨在通过对非洲猪瘟临床病理学和组织病理学的研究,探讨病理学变化与疾病发生发展的内在关系及其病理机制。选用体重20 kg左右的长白猪13头,肌内注射非洲猪瘟病毒毒株Pig/HLJ/18,剂量10²HAD₅₀·mL^-1。试验期间的死亡猪,全部进行系统剖检和取材,制备石蜡切片,苏木素伊红染色。建立病理学评价标准,病变（无序分类变量）用频率和百分比表示,病变程度（有序分类变量）按各组织器官的不同病变进行分级和评分。结果表明,发病猪符合非洲猪瘟急性、热性、高传染性等临床特征,发病率100%,病死率100%。病死猪表现败血症典型特征,尸体易腐败,血凝不良或溶血,尸僵不全。主要病理损伤为出血性坏死性淋巴结炎、急性炎性脾肿（败血脾）、脑水肿、肺水肿和肺实变等。脾和淋巴结是非洲猪瘟病毒攻击的靶器官,病变最为显著,出现时间最早,持续时间最长,发生频率最高。病理变化以血液循环障碍尤为突出,包括水肿、充血、淤血、出血、梗死和弥散性血管内凝血等多种病理表现,出血性病变为其最主要的特征。非洲猪瘟病毒引发的以淋巴细胞渗出为主的炎症反应贯穿始终,在病程的中后期表现更为明显。结果提示,急性非洲猪瘟的主要病理过程为典型的免疫/炎症级联反应和严重的全身血液循环障碍,共同导致急性非洲猪瘟的高发病率和高死亡率。     

非洲猪瘟病毒VP73蛋白在昆虫细胞中的表达与间接ELISA方法的建立

为了建立检测非洲猪瘟病毒(ASFV)间接酶联免疫吸附试验(iELISA),利用杆状病毒表达载体pFastBac HTA在昆虫细胞Sf9中表达非洲猪瘟病毒的VP73蛋白,SDS-PAGE和Western blot检测显示重组蛋白大小约65ku,能与ASFV标准阳性血清发生特异性结合。以此重组蛋白作为检测抗原包被酶标板,初步建立了检测ASFV血清抗体的iELISA方法。表达的重组蛋白具有良好的特异性,为制备ASFV免疫血清学诊断检测试剂和疫苗提供了材料。     

非洲猪瘟病毒感染猪胃肝淋巴结病理组织学变化特征

为探究非洲猪瘟病毒(ASFV)感染猪胃肝淋巴结病理组织学变化特征,并分析不同病毒剂量感染猪的病变差异,通过注射103 HAD50(HAD50:半数红细胞吸附量)和104HAD50剂量的ASFVHLJ/18株处理SPF猪后取其胃肝淋巴结,使用HE染色、网状纤维染色、透射电镜等技术观察病理组织学变化,并用统计学软件分析.结...     

非洲猪瘟病毒的侵染机制及疫苗研究进展

非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)是一种对于养猪业危害极其严重的病毒,具有高致死性和强传染性的特点,每年该病对世界养猪业造成了数十亿美金的经济损失.2018年8月,中国首次报道了非洲猪瘟疫情.ASFV属于双链DNA病毒,基因组为170～193 kb,能够编码150～167个病毒...     

非洲猪瘟病毒VP73蛋白主要抗原表位区的原核表达及多克隆抗体的制备

构建重组原核表达载体pET32a-VP73,将pET32a-VP73转化BL21感受态细胞,经IPTG诱导,VP73蛋白主要抗原表位区可稳定高效的表达,SDS-PAGE结果表明,IPTG终浓度为1.0 mmol/L,诱导5 h蛋白质表达量最高,表达蛋白为融合蛋白,分子质量约为42 ku。蛋白质纯化后,经SDS-PAGE及Western blotting鉴定,确定表达产物为非洲猪瘟病毒VP73主要抗原表位区融合蛋白。将纯化的蛋白质免疫新西兰大白兔,免疫前后收集血清。用间接ELISA方法测定血清抗体效价,并以非洲猪瘟阳性血清、兔免疫前后血清及猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征、猪伪狂犬病阳性血清为一抗,确定该蛋白质的特异性。结果表明,制备的抗血清效价达到1∶1024000,能与纯化的VP73主要抗原表位区蛋白质发生反应。制备的多克隆抗体为VP73蛋白的免疫学研究和非洲猪瘟血清学诊断奠定了基础。     

非洲猪瘟的临床症状及防控建议

非洲猪瘟是一种急性的比较强烈的传染性疾病,也是一种出血性疾病,由非洲猪瘟病毒感染所致,发病过程比较短,分为最急性和急性感染。该疾病是我国重点防范的动物类传播疾病之一,其死亡率高达100%,主要传染的宿主是家猪与野猪,因此对于养猪业会造成很大经济损失。本文对非洲猪瘟的病理特征及防控策略进行综述,以供相关人士参考。     

国内外非洲猪瘟扑杀补偿机制对比研究

扑杀补偿机制是降低非洲猪瘟疫情对养殖户损失的有效手段,是推动疫情防控工作顺利开展的有力保障.本文分析了国外典型国家的非洲猪瘟扑杀补偿机制,从补偿主体、补偿对象、补偿标准、法律基础、监管保障等方面进行比较,运用SWOT分析法总结了我国扑杀补偿机制的优势与不足,并提出了补偿对象全面化、补偿主体多元化、补偿标准市场化等政策建...     

急性非洲猪瘟脑损伤及NF-κB介导脑水肿形成机制研究

【目的】 在试验条件下研究非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）所致急性脑损伤及核因子κB （NF-κB）介导脑水肿发生的相关病理机制。【方法】 18头健康长白猪随机分为2组,攻毒组（13头）和对照组（5头）,攻毒组肌内注射剂量为10²HAD₅₀/mL （HAD₅₀：半数红细胞吸附量）的ASFV毒株Pig/HLJ/18,对照组注射等体积生理盐水,试验期为15 d。试验期间观察临床症状,剖检死亡猪并观察脑部病变;利用原位PCR检测进行病毒定位;HE染色及甲苯胺蓝染色观察脑组织病理变化;免疫组化染色法检测脑组织中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、干扰素-γ（IFN-γ）、NF-κB、基质金属蛋白酶9（MMP-9）、水通道蛋白4（AQP-4）的表达。【结果】 攻毒组9头猪表现出临床神经症状,脑部剖检病变主要为脑膜充血和不同程度的脑实质水肿;ASFV主要位于脑部微血管中;病变早期主要为脑水肿,脑皮质区结构疏松、血管周围间隙增宽、神经元肿胀变圆、染色变淡,中后期除了表现脑水肿的特征外,还可见脑血管充血、多量微血栓形成及淋巴细胞浸润;免疫组化结果显示,攻毒组TNF-α、IL-1β、IFN-γ、NF-κB及MMP-9主要在神经元及胶质细胞中表达,AQP-4的阳性细胞主要是微血管周围的星形胶质细胞,与对照组相比,攻毒组上述6种因子的阳性表达率均极显著增高（P<0.01）。【结论】 急性非洲猪瘟脑损伤的主要表现为脑膜血管充血出血和脑实质水肿、组织学病变显示病毒性脑炎,ASFV感染脑部,促进炎性因子的异常高表达,通过激活NF-κB信号通路对TNF-α、IL-1β、IFN-γ的转录进行调控,使这几种炎性因子的产生和释放增多,扩大炎症反应,影响血脑屏障的通透性,还能上调MMP-9与AQP-4的表达,破坏血脑屏障,促进脑水肿的发生发展。     

非洲猪瘟的流行病学及疫苗研究新进展

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒引起的猪急性、出血性传染病,病毒主要的靶细胞是单核细胞和肺泡巨噬细胞。自1921年在非洲首次报道非洲猪瘟后,此病已传播至欧洲、南美洲和亚洲。2018年8月,我国暴发首例非洲猪瘟疫情,随后几个月,疫情扩散到全国大部分省市,而且我国周边的国家越南、蒙古、柬埔寨和韩国等也相继暴发了非洲猪瘟疫情。疫苗接种被认为是阻止非洲猪瘟病毒蔓延的有效手段,尽管科研人员经过长时间的努力研究,但到目前仍没有既安全又有效的疫苗问世。本文将从非洲猪瘟病毒的流行病学特征和疫苗研究的最新进展加以综述。     

非洲猪瘟疫情对猪肉及相关肉类价格的影响分析

8月份之后,非洲猪瘟在我国多个省份点状散发。疫情发生后,全国猪肉平均价格止涨回跌,各地区猪肉价格水平差异显著,东北地区跌幅较大,达17.51%,华中地区跌幅较小,为1.45%,华北和华东地区略有上涨,涨幅分别为3.68%、4.69%。与此同时,牛肉、羊肉和鸡肉等价格稳定上涨,非洲猪瘟疫情若继续蔓延,全国及各地区猪肉价格水平将可能出现下跌趋势,由此带动其他相关肉类的价格持续上涨。     

非洲猪瘟的流行传播特点及防控策略研究

非洲猪瘟有着死亡率高、传染性极强的特征,会对养猪业造成较大的危害,因此,做好非洲猪瘟的防控工作对于养猪业的健康发展具有十分关键的实际意义。本文从分析非洲猪瘟的流行传播特点这一角度出发,研究非洲猪瘟的防控策略,旨在为非洲猪瘟的防控工作提供相应策略。     

非洲猪瘟的病理特征及防控措施

非洲猪瘟是近年兴起的一种急性传染病,有着较高的传染性和死亡率,一旦发生将会给整个养猪行业带来较大损失.因此,重视非洲猪瘟防控工作的开展非常有必要.因此,本文就以此为例,对非洲猪瘟的病理特征进行分析,并且提出科学有效的防控措施.     

非洲猪瘟病毒入胞过程相关蛋白及分子机制的研究进展

非洲猪瘟病毒(ASFV)是非洲猪瘟(ASF)的病原,可引发家猪和野猪急性、传染性出血死亡,目前尚无有效的疫苗和抗病毒药物。ASFV是囊膜病毒,其囊膜蛋白的结构和功能可能是影响病毒入侵和细胞嗜性的重要因素。病毒入胞是病毒感染细胞的第一步,通常是通过细胞表面特定的分子与病毒蛋白相结合吸附于宿主细胞表面,对ASFV入胞过程的病毒蛋白或宿主因子为靶点或可有效抑制ASFV的复制。本文从ASFV入胞过程中起重要作用的囊膜蛋白出发,对ASFV的入胞分子机制进行综述,为ASFV入胞深入研究以及治疗性药物和疫苗的研发提供参考。     

猪瘟的几个特有病变及病理机制

猪瘟是一种和猪丹毒、猪肺疫等病很难区分的一种病,掌握此病的特殊病变很重要。1猪瘟的特有病变1.1喉部会厌软骨不肿胀,仅有单纯的点状出血。而猪丹毒、猪肺疫,多伴有肿胀、充血等变化。1.2皮肤头、尾、四肢端部,有新小密布的点状出血。若上述部位呈现粟粒大小不规则环形的出血斑,可能不是本病的特有病变。1.3淋巴结腔内各淋巴结,呈边缘出血,但不肿胀,此为本病的特有的病理变化。若体表淋巴结呈现边缘出血,应是两个以上不同部位而相距较远的淋巴结群,再结合皮肤、肾脏的病理变化,则判定是否为猪瘟。若仅体表淋巴结的某一组呈现相似变化,应注…     

非洲猪瘟CD2v截短蛋白的原核表达及间接ELISA方法的建立

为建立非洲猪瘟(ASF)抗体检测方法,本研究根据ASFV HLJ18株基因组序列合成CD2v蛋白的胞外区段基因序列,连接至原核表达载体p ET28a,构建表达质粒p ET28a-CD2v。经测序鉴定正确后转化至大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)p Lys S,构建表达菌株p ET28a-CD2v/BL21(DE3)PLys S。经IPTG诱导和镍柱纯化后,获得纯化的CD2v蛋白并经SDS-PAGE和Westernblot鉴定。以纯化的CD2v蛋白作为包被抗原,通过优化反应条件建立检测CD2v抗体的间接ELISA方法,并评价该方法的特异性、敏感性和重复性及在临床血清中的应用。结果显示,经测序构建的表达质粒序列正确,CD2v蛋白表达经SDS-PAGE可见略小于25k Da的条带,Westernblot显示能与ASFV感染血清发生特异性反应。建立了ASFCD2v蛋白抗体检测方法CD2v-ELISA,抗原包被质量浓度为50μg/L,血清稀释倍数为1∶100,羊抗猪HRP-Ig G稀释倍数为1∶100000,阴阳性临界值为0.26;与PRRSV、CSFV、PRV(g I)、PRV(gb)、FMD...     

非洲猪瘟病毒感染机制和诊断方法的研究进展

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由属于非洲猪瘟病毒科、非洲猪瘟病毒属的非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的猪的一种急性、高度接触性传染病。强病毒株感染家猪的发病率和死亡率达100%,曾在非洲、美洲和欧洲部分地区广泛流行,并造成了严重的经济损失。目前,该病在非洲的东部和南部地区、俄罗斯的北高加索地区仍时有发生。由于对养猪业危害很大,而且无有效的疫苗