表达猪瘟病毒E2蛋白重组猪繁殖与呼吸道综合征病毒的研究

为构建表达猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白重组猪繁殖与呼吸道综合征病毒(PRRSV),本研究首先利用高致病性PRRSV弱毒疫苗HuN4-F112株的感染性分子克隆作为平台,构建了一个在nsp2区有缺失的感染性分子克隆,命名为pHuN4-F112-△480-620。以pHuN4-F112-△480-620作为载体,采用突变PCR的方法将CSFV的主要保护性抗原E2基因1 bp～9 99 bp,1 bp～600 bp,1 bp～330 bp及256 bp～330 bp基因片段分别插到nsp2中aa 480～aa 620位氨基酸缺失编码区域。结果显示,插入完整E2基因或较大E2基因片段的重组PRRSV cDNA质粒均未能拯救出病毒,只有插入较小的E2基因片段(256 bp～330 bp)的重组病毒cDNA质粒成功地拯救出了重组病毒rPRRSV-F112-E2(256-330),拯救的病毒能够在MARC-145细胞上引起明显的细胞病变,而且生长速度明显高于其亲本病毒,间接荧光检测表明该重组病毒能够表达外源基因。     

猪繁殖与呼吸综合征重组病毒非必需基因区的鉴定

为鉴定猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)复制的非必需基因区,本研究在高致病性PRRSV细胞致弱株感染性克隆Hu N4-F112的基础上,在其基因组ORF1b和ORF2a之间插入增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因,并在外源基因3'端下游插入该病毒的转录调控序列6(TRS6),构建PRRSV-EGFP感染性克隆。将其体外转录制备的病毒全长RNA转染Marc-145细胞后,拯救获得了表达EGFP的重组病毒(r Hu N4-F112-EGFP)。将r Hu N4-F112-EGFP在Marc-145细胞中进行连续传代至20代,其外源gfp基因仍能够持续表达,表明该重组病毒具有良好的遗传稳定性。与亲本病毒Hu N4-F112相比,重组病毒在病毒滴度、空斑形态等方面差异不显著;病毒生长曲线的结果显示,重组病毒具有良好的增殖能力。本研究结果表明,在PRRSV的ORF1b和ORF2a基因区中插入外源基因并未影响该病毒体外复制,该非必需基因区的鉴定为进一步研究以PRRSV疫苗为活病毒载体多价重组疫苗的研发奠定基础。     

表达狂犬病病毒G蛋白重组犬瘟热病毒Snyder Hill株的构建及鉴定

为构建一株表达狂犬病病毒(RV) G蛋白的重组犬瘟热病毒(CDV),本研究以本实验室分离的CDVSnyder Hill疫苗株为基础,在CDV P和M基因之间插入RV弱毒疫苗株ERA G蛋白基因,构建重组质粒p CI-CDV-RVG及表达CDV N、P和L蛋白的辅助质粒p CI-CDVN、p CI-CDVP和p CI-CDVL,将重组质粒和辅助质粒共转染BSR细胞,拯救获得了表达RV G蛋白的重组犬瘟热病毒(rCDV-RVG),将该重组病毒在Vero细胞中传代,通过RT-PCR、间接免疫荧光试验(IFA)和western blot鉴定。结果显示RV G基因能够在r CDV-RVG中稳定存在并正确表达。病毒生长动力学曲线显示,重组病毒在Vero细胞中的增殖效率与拯救的亲本病毒r CDV无显著差异(p0.05)。本研究表明CDV Snyder Hill株作为载体表达外源基因的潜力,为研制高效、安全、廉价的CDV-RV二联活载体疫苗奠定基础。     

表达牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的嵌合狂犬病病毒生物学特性

牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus, BVDV)引起牛发热、腹泻、黏膜糜烂溃疡等症状，给养牛业带来严重经济损失，新型疫苗的研发意义重大。狂犬病病毒(rabies virus, RV)作为病毒载体可稳定表达外源蛋白，反过来外源蛋白也不会阻碍病毒的复制。本研究目的是利用反向遗传操作技术构建和拯救表达BVDV结构蛋白的重组RV,以期获得一种能表达高水平BVDV E2蛋白的重组病毒。选择Ⅰ型BVDV主要优势抗原E2蛋白基因序列进行优化后合成E2基因片段，利用Overlap PCR的方法将E2基因改造为DE2片段，以RV疫苗毒株LBNSE为病毒载体，利用BsiWⅠ和NheⅠ酶切位点，将DE2基因插入LBNSE基因组中，成功构建pRV-DE2重组质粒。脂质体法将全长重组质粒转染BSR细胞后，拯救重组病毒RV-DE2,并用直接免疫荧光和RT-PCR的方法对其鉴定，对构建成功的病毒进行生长特性、致病性、重组蛋白表达特性等生物学特性和小鼠体内免疫效力的研究。结果表明，RV-DE2病毒滴度在F3代之后趋于稳定，在相同的培养条件下比亲本LBNSE病毒滴度高。重组病毒对小...     

重组鸭肠炎病毒载体疫苗研究进展

重组病毒载体疫苗是一种以减毒活病毒为载体承载表达其他病原抗原性基因的新型疫苗,能感染宿主细胞、递呈外源基因所表达的抗原蛋白、诱导机体产生体液免疫应答和细胞免疫应答,从而有效地预防多种疾病。鸭肠炎病毒基因组长约160kb,包含多个非编码区和病毒复制非必需区,可携带多个或较大的外源基因,是构建重组活病毒疫苗的理想载体。随着分子生物学研究的不断深入和分子生物学实验技术的飞速发展,对鸭肠炎病毒基因组进行遗传修饰的技术手段已十分成熟,目前已通过这些技术成功构建了多株重组鸭肠炎病毒活载体疫苗。研究表明构建的重组鸭肠炎病毒活载体疫苗可成功抵抗鸭肠炎病毒和其他相应病原的攻击,具有作为重组病毒疫苗载体的潜力,并在未来的禽类新型疫苗研制中发挥重要作用。本文对以鸭肠炎病毒作为载体的重组病毒活载体疫苗的研究进展进行综述,以期为鸭肠炎病毒载体疫苗的研发提供参考。     

共表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因和猪瘟病毒E2基因的重组腺病毒的构建及其在小鼠模型上的免疫原性分析

本研究旨在以复制缺陷型人5型腺病毒为载体,构建一株同时表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株GP5蛋白和猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白的重组腺病毒疫苗。首先利用重叠PCR将GP5和E2基因通过口蹄疫病毒(FMDV)2A序列连接,形成一个完整的ORF,并将其克隆到腺病毒穿梭载体中,通过细菌内同源重组构建共表达PRRSVGP5蛋白和CSFVE2蛋白的重组腺病毒(rAdV-GP52AE2)。间接免疫荧光试验和western blot检测证实2个外源基因均获得表达。在小鼠上进行的免疫效力评价结果显示,rAdV-GP52AE2免疫组针对CSFV的中和抗体滴度可达1∶128,针对PRRSV的中和抗体滴度为1∶16;在淋巴细胞增殖试验中,免疫组与阴性对照组在增殖指数上有显著差异,表明该重组腺病毒可以同时诱导抗PRRSV和CSFV的特异性体液免疫和细胞免疫。这些结果显示,利用具有自动剪切功能的FMDV2A多肽构建的重组腺病毒有望开发成一种同时预防PRRS和CSF的新型载体疫苗。     

表达H5亚型禽流感病毒不同形式HA基因重组鸭瘟病毒的构建及HA表达形式的鉴定

为研究禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)基因的信号肽以及跨膜区对HA蛋白在重组病毒中表达的影响,本研究以鸭瘟病毒(DEV)为载体,在DEV基因组的US7和US8基因之间通过同源重组插入去除信号肽或跨膜区的H5N1亚型AIV HA基因编码序列,分别构建了缺失信号肽HA基因的DEV重组病毒(r DEV-PK)和缺失跨膜区HA基因的DEV重组病毒(r DEV-PSM),并传至20代,经PCR对插入的外源基因编码序列扩增及序列测定,表明外源基因能够在重组病毒基因组中稳定存在;间接免疫荧光和western blot鉴定结果表明去除信号肽的HA蛋白能够在重组病毒感染的鸡胚成纤维细胞浆中正确表达,而去除跨膜区的HA蛋白能够在感染细胞的培养液中检测到。本研究为表达H5N1亚型AIV HA基因重组DEV载体弱毒疫苗在鸭体内免疫机制的进一步研究奠定基础。     

猪瘟病毒E2蛋白主要抗原区编码基因的原核表达及抗原性研究

本试验旨在分析猪瘟病毒E2蛋白的免疫反应,应用RT-PCR方法扩增了编码猪瘟病毒兔化弱毒疫苗株C株囊膜糖蛋白E2基因主要编码区,并定向克隆到表达载体pET-30a-c(+)中,获得重组表达载体pET30a-E2,将其转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达。SDS-PAGE和Western blottin分析结果表明,E2基因获得高效融合表达,且具有免疫反应活性。本试验为建立E2抗原的检测试剂盒奠定基础。     

表达多个外源基因的重组伪狂犬病病毒的构建及其细胞培养特性研究

将SV40启动子控制下的LacZ报告基因表达盒与分别在CMV启动子控制下的含有猪瘟病毒（CS-FV）E2基因及猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）GP5基因的表达盒插入到伪狂犬病病毒（PRV）Bartha-K61株TK基因中，通过蓝斑筛选获得了一株插入CSFVE2、PRRSVGP5与LacZ基因的重组伪狂犬病病毒，命名为rPRV-E2-GP5。经Western blot、间接免疫荧光试验证实E2、GP5基因在重组病毒感染细胞中获得了表达。重组病毒感染Vero、PK-15、IBRS2和CEF细胞后的增殖滴度和致细胞病变特征与亲本病毒比较，无显著差异。本试验结果表明在PRV基因组中可以插入多个外源基因，为进一步研究多价基因工程载体疫苗奠定了基础。     

Tn5转座子介导表达猪瘟E2蛋白和EGFP重组伪狂犬病毒的构建

为构建猪瘟重组伪狂犬疫苗,以Tn5转座子为介导,采用体外转座的方法将猪瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）E2基因和增强绿色荧光蛋白（enhanced green fluoresce protein,EGFP）的表达盒随机插入伪狂犬病毒（Pseudorabies virus,PRV）基因组中,随后将转座产物转染BHK-21细胞,获得表达E2蛋白和EGFP的病毒库,并对E2蛋白和EGFP在细胞上的表达效果进行PCR鉴定和间接免疫荧光分析。试验结果表明,运用体外转座的方法可以将外源基因插入PRV基因组中,并且外源基因可以在细胞中表达。本研究为重组病毒的研究提供了新思路,并为新型重组猪瘟疫苗的研制进一步奠定了基础。     

猪日本乙型脑炎病毒DNA复制子载体的构建及外源基因表达分析

猪日本乙型脑炎病毒(JEV)是引起以母猪流产为主要特征的繁殖障碍性疾病病原之一,笔者拟构建JEV的DNA型复制子载体,并利用该载体表达外源基因。以JEV毒株SA14-14-2为基础,去除病毒结构蛋白基因prM和部分E基因而保留全部非结构蛋白和非编码区序列,插入FMDV2A和丁肝病毒核酶序列构建复制子表达载体pAC-JEV,实时定量PCR、间接免疫荧光、Western blotting方法检测JEV自身蛋白(NS3)表达,验证复制子的自主复制能力。在pAC-JEV的结构蛋白C基因下游插入EGFP基因、猪流感病毒的HA和猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒的GP5基因构建重组复制子pAC-JEV-EGFP、pAC-JEV-HA、pAC-JEV-GP5和NS5基因缺失载体pAC-JEV-ΔNS5,该复制子载体转染BHK-21,荧光显微镜直接观察EGFP表达,Western blotting方法检测外源蛋白质(GFP、GP5、HA)表达情况。结果表明:随着转染时间延长,复制子转染细胞内NS3的表达逐渐增加,表明所构建的JEV复制子表达载体具有自主复制能力。EGFP mRNA转录水平和EGFP蛋白质荧光信号随着转染时间的延长逐渐增加,并且荧光信号可持续8d以上,携带猪流感病毒的HA和猪繁殖与呼吸综合征病毒的GP5基因的复制子载体转染BHK-21细胞后,HA和GP5能有效表达,说明复制子具有表达外源蛋白质的能力。该复制子表达载体的成功构建,为深入研究JEV各蛋白质的功能、各蛋白质与细胞内蛋白质相互作用关系以及基于复制子载体的疫苗开发等提供了技术平台。     

表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白基因的新城疫病毒感染性克隆的构建及病毒拯救

应用反向遗传技术对新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)LaSota株感染性克隆PBRN-FL质粒进行操作,构建插入欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)ORF5基因的重组质粒LaSota-ORF5并进行病毒拯救及鉴定。依据GenBank所发表的欧洲型PRRSV LV株ORF5序列,设计引物扩增ORF5片段,通过PBRN-FL质粒上P和M基因间的PmeⅠ酶切位点插入目的片段,构建重组质粒LaSota-ORF5。采用磷酸钙转染法将重组质粒和PCI-NP、PCI-P、PCI-L等3种辅助质粒共转染BSR-T7/5/细胞拯救病毒并对其分别进行RT-PCR、间接免疫荧光(IFA)和Western blot(WB)试验鉴定。结果显示:拯救病毒的RT-PCR产物测序结果正确,IFA出现绿色荧光,WB试验条带大小符合预期,证明GP5蛋白有效表达。结果表明:成功构建并拯救得到重组病毒rLaSota-GP5,为制备表达PRRSV GP5蛋白的重组NDV疫苗奠定基础。     

非洲猪瘟病毒pE248R蛋白的原核表达及其多克隆抗体制备

本研究利用PCR方法从非洲猪瘟病毒的灭活样品中扩增出747 bp的E248R基因全长序列,利用同源重组法构建原核表达质粒pCold I-pE248R,经1 mmol/L的IPTG诱导1 h后,利用SDS-PAGE对重组蛋白进行表达鉴定和反应原性分析,表达蛋白的分子量约为32 kDa,利用纯化后得到pE248R重组蛋白作为免疫原经过4次免疫后制备鼠源抗pE248R多克隆抗体。利用该多克隆抗体检测实验室构建并拯救的已证明能够稳定表达ASFV pE248R蛋白的重组病毒rPRRSV-E248R,结果显示制备的抗pE248R的多克隆抗体能够与rPRRSV-E248R发生特异性结合反应,证明利用本试验中原核表达的pE248R蛋白制备的多克隆抗体具有抗pE248R蛋白的特异性,为进一步针对ASFV E248R基因建立快速,特异性的血清学检测方法奠定了基础,也为针对pE248R蛋白的功能性研究提供了研究基础。     

稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的BHK细胞系的构建

猪瘟病毒(CSFV)的E2蛋白是引起猪体产生针对猪瘟保护性抗体的主要抗原,构建可稳定表达CSFV E2蛋白的细胞系,可为E2蛋白功能研究及基因工程猪瘟疫苗的研制提供物质基础。本研究将CSFV E2基因克隆至慢病毒表达载体,构建重组慢病毒表达质粒pCDH-E2。将pCDH-E2重组质粒与慢病毒包装质粒共转染293T细胞,获得重组慢病毒。将该慢病毒感染BHK-21细胞,经嘌呤霉素抗性筛选结合有限稀释法筛选出可表达CSFV E2蛋白的BHK细胞系。Western blot分析结果显示,所构建的重组细胞系传至第10代仍能稳定表达CSFV E2蛋白。该细胞系的建立为研制猪瘟新型重组疫苗及其生产奠定基础。     

猪瘟病毒E2基因抗原结构域A、B、C、D区在大肠杆菌中的表达

采用PCR技术扩增出猪瘟病毒E2基因抗原结构域A、B、C、D区并克隆于PGEM-T easy载体上，测序结果表明插入的为猪瘟病毒E2基因抗原结构域，切出目的基因，将目的基因克隆到表达质粒pProEX—HTb中，获得重组质粒经PCR、酶切和序列分析鉴定E2基因抗原结构域插入的位置、大小和读码框均正确，SDS—PAGE检测表明受体菌经IPTG诱导后能表达E2基因抗原结构域蛋白，Westernblot检测表明受体菌诱导表达E2基因抗原结构域蛋白可与猪瘟阳性血清发生特异性反应。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白在重组牛痘病毒中的表达与鉴定

为重组表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)M蛋白,本研究将RT-PCR获得的PRRSV CH-1a株M蛋白基因,克隆于pMD18-T载体中,经测序鉴定正确后,亚克隆至牛痘病毒重组转移质粒pSC11中,构建了转移重组质粒pSC11-PRRSV-M。将pSC11-PRRSV-M在脂质体的介导下转染WR株牛痘病毒感染的TK-143细胞,在含有X-gal的琼脂培养基上通过蓝斑筛选含有PRRSV M基因的重组病毒rWR-PRRSV-M。Western blot与IFA检测表明,重组病毒成功表达了PRRSV M蛋白,而且所表达的蛋白保持了良好的免疫原性。动物实验表明,rWR-PRRSV-M所表达的PRRSV M蛋白在免疫小鼠体内诱生了抗PRRSV的抗体。rWR-PRRSV-M的构建,为进一步探讨PRRSV M蛋白免疫原性提供了基础数据,也为PRRS重组活载体疫苗的研究奠定了基础。     

猪瘟病毒E2基因在毕赤酵母中的表达

猪瘟是严重危害养猪业的一种烈性传染病,病死率高,被世界动物卫生组织(OIE)列为必须报告的动物疫病。E2蛋白是猪瘟病毒中最主要的保护性抗原,因此,围绕E2的基因工程疫苗研究已成为热点。本研究以含有猪瘟E2基因的重组质粒pMD18-T-E2为模板,设计一对特异性引物扩增去除跨膜区的E2基因,将PCR产物插入巴斯德毕赤酵母表达载体pPICZαA中,构建重组质粒pPICZαA-E2,将该质粒用SacⅠ酶切线性化后,电穿孔导入巴斯德毕赤酵母X-33中,经Zeocin筛选得到高拷贝转化子,通过甲醇诱导表达、SDS-PAGE和Western bolt试验验证,结果表明E2蛋白在酵母中获得成功表达。     

非洲猪瘟病毒CP312R基因编码蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备与应用

为制备ASFV CP312R基因编码蛋白的多克隆抗体,利用PCR方法从非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)的灭活样品中扩增出924 bp的CP312R基因全长序列,利用同源重组法构建出原核表达质粒pCold-Ⅰ-ASFV-CP312R,将其转化至原核表达感受态细胞BL21中,经1 mmol/L的IPTG低温条件下诱导表达CP312R编码蛋白并经过镍柱亲和层析纯化后,利用SDS-PAGE对重组蛋白进行表达鉴定和反应原性分析,表达蛋白的相对分子质量约为34 kDa,通过Western blot分析,该蛋白能被ASFV抗体特异性识别。将所得的蛋白经处理纯化后免疫小鼠3次,得到含多克隆抗体的血清。利用该抗体检测实验室构建并拯救的表达ASFV CP312R基因编码蛋白的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV),结果显示该多抗具有良好的反应原性和特异性,并且证明了ASFV CP312R基因编码蛋白可在PRRSV活载体中稳定表达。     

科技进展

在PRRSV非结构蛋白2(nsp2)的非必需区插入的标记疫苗的外源基因稳定表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)非结构蛋白2(nsp2)在PRRSV各株显示高度的多样性和可变性,nsp2区