一株猪轮状病毒的分离与鉴定

将1份经RT-PCR检测猪轮状病毒阳性的临床腹泻粪样感染Vero细胞,连续盲传8代,出现病变,成功分离到1株病毒,经RT-PCR检验和电镜观察,鉴定该病毒为轮状病毒,命名为GD-01-2015。扩增该病毒的VP4和VP7基因进行分型和系统进化分析,结果发现,其VP4基因为P[7]型,与来自韩国的猪源毒株K71同源性达到99.8%;其VP7基因为G5型,与来自韩国的猪源毒株06-6-1同源性达到99.7%。由此可以推测GD-01-2015株与韩国猪源毒株有相似的进化来源。根据轮状病毒分类委员会(RCWG)提出的A群轮状病毒的最新分类方法,GD-01-2015株基因型为G5P[7]。本研究为监测轮状病毒的流行状况及其疫苗的研制提供了理论依据。     

G群轮状病毒鸽群分离株的全基因分析

为分析鸽轮状病毒中国分离株的特性,采用高通量测序方法,测定从山东省青岛市某活禽交易市场采集的肉鸽粪便样品中分离的轮状病毒基因组,并对其进行特性分析与比较基因组研究。结果显示,G群轮状病毒鸽群分离株全基因包含11个节段,总长度为17 803 bp,具有与其他轮状病毒相似的结构和基因顺序。与24株轮状病毒代表性毒株的VP6氨基酸序列进化分析结果,以及其他5个结构蛋白氨基酸序列遗传进化分析结果均证实,该病毒属G群轮状病毒。该毒株与2011年从香港鸽群中分离的G群轮状病毒同源性最高,但衣壳糖蛋白VP7的氨基酸序列同源性仅为71.7%,抗原性存在较大差异。     

猪A群轮状病毒的分离与鉴定

目前国内对猪轮状病毒的研究较少,作者旨在对猪A群轮状病毒进行分离与鉴定,为后续猪轮状病毒致病机理和分子生物学特性研究奠定基础.用胰蛋白酶处理RT-PCR检测猪A群轮状病毒病原阳性的临床腹泻粪样,然后接种长成单层的MA-104细胞,进行病毒分离传代.再对分离毒株进行常规RT-PCR鉴定和电镜观察,并对分离毒株的VP6、VP7和VP8基因进行测序及序列分析.结果成功分离猪A群轮状病毒TM-a株,经序列同源性分析发现,与TM-a株VP6、VP7和VP8基因同源性最高的毒株分别为中国北京人源LL3354株、印度人源RMC321株和日本野猪源GUB-71株,其相似性为96.0％、95.1％和97.0％.该TM-a株轮状病毒不同基因表现出与人源轮状病毒和猪源轮状病毒的高度同源性,推测猪A群轮状病毒可能在人畜间传播,发生基因重组现象.     

猪A群轮状病毒GZAS2020株与NX疫苗株的差异性分析

为比较实验室分离保存的猪轮状病毒田间株(GZAS2020株)与猪三联腹泻活疫苗NX株的差异，参照已发表的A群猪轮状病毒VP4、VP6、VP7序列设计合成3对扩增全基因的通用引物，分别克隆测序GZAS2020株和NX株的VP4、VP6、VP7全基因。采用DNAStar对GZAS2020株和NX株VP4、VP6、VP7这3个主要基因进行核苷酸、氨基酸同源性分析以及遗传进化树构建，结果显示，GZAS2020株与NX株VP4、VP6、VP7基因核苷酸同源性分别为75.2%、90.0%和79.4%,氨基酸同源性分别为78.5%、74.1%和82.4%,根据G/P分类命名法，GZAS2020株属于G5P[13]。与NX疫苗毒株相比，GZAS2020株的VP4基因在359、360、750 bp处存在C、A、C碱基的缺失，在347、348、570、571、572、579、580、581、757 bp处分别插入了C、C、C、A、A、G、G、G、C碱基；VP6基因不存在插入和缺失；VP7基因在258、1 029 bp处分别存在T、A碱基的插入，266 bp处存在1个C碱基的缺失。结果表明，GZAS2020...     

一株G6P[5]型牛轮状病毒的分离鉴定与全基因组序列分析

为了对患腹泻疾病的犊牛进行病原学鉴定,并进一步丰富我国牛轮状病毒(BRV)的流行病学数据,本研究采用RT-PCR方法对8份腹泻犊牛的粪便样品进行BRV VP7基因检测,结果显示有1份样品为阳性。将该阳性病料样品接种Marc-145细胞。对产生细胞病变(CPE)的阳性样品连续传5代后,经间接免疫荧光试验(IFA)和电镜观察,结果表明从粪便样品中分离的病毒为BRV,命名为DZ株。对DZ株的11个基因节段进行RTPCR扩增、测序、拼接后对11个基因节段进行同源性及分型分析;构建分离病毒VP7、VP4基因进化树,分析其遗传进化关系及其氨基酸序列的变异情况。结果显示,DZ株基因组10个基因节段分别与来源于牛(VP2、VP7、NSP1、NSP3)、犬(VP3、NSP5)、羔羊(NSP2)、马(VP6)、猕猴(VP1)、人(NSP4)以及人-牛基因重配(VP4)的轮状病毒株。其中VP1基因与猕猴轮状病毒(RRV)的同源性最高,为81.3%,但低于VP1基因分型的临界值83%,因此DZ株的VP1为新出现的基因型,命名为R17;分离株NSP3基因与法国RF株NSP3基因的同源性高达98%,DZ株与RF株的NSP3属于同一基因型,命名为T18型。所以,本研究分离的BRV DZ株的基因型为G6-P5-I2-R17-C2-M2-A3-N2-T18-E2-H5。VP7和VP4基因遗传进化分析结果显示,DZ株VP7基因来源于韩国KJ69-1株,VP4基因来源于美国疫苗株RotaTeq-SC2-9。与同源性最高的病毒株相比,DZ株VP4、VP7蛋白氨基酸序列分别发生了9处和8处突变。这些突变可能会引起VP7和VP4蛋白的抗原性和组织嗜性变化,进而影响病毒的免疫原性、宿主嗜性以及致病性。综上所述,DZ株是多宿主来源的基因重配病毒株,且主要抗原蛋白VP7和VP4发生了较大变异。本研究为我国BRV遗传进化及其分子流行病学和疫苗的研究奠定了实验基础。     

猪轮状病毒L1株VP7基因克隆及序列分析

根据GenBank已发表的猪轮状病毒VP7基因保守序列,设计特异性引物扩增猪轮状病毒L1株VP 7全基因序列并进行序列测定及分析。结果显示, L1株猪轮状病毒VP 7基因全长为1062 bp,包含一个982 bp的开放阅读框,编码326个氨基酸,与G5型参考毒株核苷酸同源性和推导的氨基酸同源性分别为88．8％～93．7％和93．3％～94．2％,系统进化树分析结果亦显示L1株与G5型参考毒株处于同一个群,由此确定L1株为G5型。与我国近几年流行的G9型毒株NMTL进行抗原表位分析结果显示,两个毒株在 aa25～aa29、aa86～aa102、aa142～aa152、aa211～aa226、aa263～aa286等区域存在明显差异,可能对其免疫保护性存在一定的影响。     

牛A群轮状病毒G10型XJ-2022株分离鉴定及基因型分析

【目的】 试验旨在对新疆某规模牛场患腹泻疾病的犊牛进行病原学鉴定及基因型分析。【方法】 采用抗原诊断试剂盒方法对在新疆某牛场随机采集的15份腹泻犊牛粪便样品进行检测,对抗原检测结果为阳性的样品进行反复冻融和过滤处理,然后将样品接种于Marc-145细胞进行病毒的分离和传代。对分离毒株进行间接免疫荧光试验（IFA）和负染电镜观察进一步确定病原。对分离株的VP6和VP7基因进行PCR扩增测序,并对其进行基因相似性比对和进化树分析。【结果】 抗原诊断试剂盒结果显示,3份粪便样品呈牛轮状病毒（Bovine rotavirus,BRV）抗原阳性。将阳性粪便样品分别接种于Marc-145细胞,仅有1份样品连续盲传至第9代出现明显的细胞病变效应（CPE）。IFA结果显示,接种该分离株的Marc-145细胞有亮绿色荧光,对照组未见荧光。电镜观察可见约65 nm的圆形病毒粒子,并命名为XJ-2022株。经PCR扩增获得VP6和VP7基因的目的条带,长度分别为1 356和342 bp。基因相似性比对和遗传进化分析表明,VP6基因与人源A群轮状病毒参考株DB2015-066（LC367318.1）相似性最高且遗传进化亲缘关系最近;VP7基因与牛源G10轮状病毒参考株XJX2（MN937506.1）相似性最高,遗传进化亲缘关系最近,确定该分离株为A群G10型轮状病毒。【结论】 试验成功分离到基因型为A群G10型BRV XJ-2022株,该毒株为新疆地区首次发现的多宿主来源的基因重配病毒。     

猪A群轮状病毒BJ株的分离与鉴定

轮状病毒是引起幼龄动物和儿童病毒性腹泻的主要病原,轮状病毒的分离鉴定为该病的流行病学调查和分子生物学特性研究奠定了基础。本研究采集北京某猪场腹泻发病仔猪肠内容物,将其接种MA104细胞,分离得到一株能产生明显细胞病变的病毒。对分离毒株进行胶体金、实时荧光定量RT-PCR和免疫荧光等方法鉴定,并对分离毒株的VP4、VP6和VP7基因进行测序及序列分析。结果表明,分离毒株为猪A群轮状病毒。按照A群轮状病毒的最新分类方法,确定该分离株VP4、VP6和VP7基因的基因型分别为P[13]型、I5型和G11型。因此,将该分离株命名为Rotavirus A pig/China/BJ/2015/G11P[13]。     

猪流行性腹泻病毒X-6/2021株的分离鉴定及其S1基因序列分析

为了了解四川地区流行的猪流行性腹泻病毒（PEDV）的生物学特征及基因的遗传进化关系,从四川某地采集了发病仔猪小肠,病料处理后在Vero细胞上进行盲传,通过RTPCR、间接免疫荧光鉴定（IFA）验证,成功分离出1株猪流行性腹泻病毒,命名为X-6/2021株。对X-6/2021株S1基因进行RT-PCR扩增,获得的分离株S1序列与国内外PEDV毒株进行序列比对和遗传进化分析。结果显示,PEDV-X-6/2021毒株与Ⅰ型参考毒株的同源性为90.6%～93.2%,与Ⅱ型参考毒株的同源性为97.6%～99.0%。试验成功地从四川省分离鉴定得到1株猪流行性腹泻病毒,为该地区PEDV防控及候选疫苗毒株的筛选提供了物质基础。     

猪轮状病毒的分离与鉴定

将疑似感染猪轮状病毒的内蒙古某猪场的腹泻仔猪粪便样品在MA104细胞上分离培养,得到一株能产生明显细胞病变的毒株(命名为PRV L1株).经纯净性检测,该毒株无菌生长、无支原体污染及外源病毒污染.特异性检测结果显示该PRV L1株能被猪轮状病毒单特异性血清中和,并可被猪轮状病毒单克隆抗体识别,其VP7基因序列与G5型猪轮状病毒VP7基因序列同源性为99％.动物回归试验结果表明,该毒株口服攻击3日龄仔猪,可引起典型的猪轮状病毒病发病症状,并能在发病仔猪小肠内容物中检测到猪轮状病毒.     

华东地区猪A群轮状病毒的VP7和VP4基因序列分析

为了掌握华东地区猪轮状病毒(PRV)的流行情况,通过对华东地区猪轮状病毒流行病学的调查,分析临床猪轮状病毒对应的2个抗原序列VP7和VP4的基因型,进而丰富VP7和VP4基因库。采集2017-2018年华东地区包括江苏、浙江、上海、山东、安徽等省(市),部分猪场猪的粪便拭子共201份,PCR检测PRV阳性52份,阳性率25.9%。选择5个阳性样本进行VP7和VP4基因全长扩增并克隆测序,应用DNASTAR、MEGA5等生物学软件对其进行比对分析。结果显示:5个VP7核苷酸序列全长均为1 062 bp,5个VP4序列全长均为2 362 bp。VP7与2008年分离的G9型代表毒株NMTL的核苷酸同源性和氨基酸同源性分别为93.2%～95.2%和97.2%～97.5%。VP4与OSU毒株的核苷酸同源性和氨基酸同源性分别为98.5%～98.7%和99.3%～99.4%。表明这5株猪轮状病毒的基因型鉴定为G9P7。与参考毒株相比,VP7氨基酸第100、122、180、309位有突变,但无插入和缺失现象,VP4氨基酸在第30、137、686、774位有突变,但无插入和缺失。     

猪轮状病毒贵州株VP7基因克隆及生物信息学分析

为了解贵州省猪轮状病毒(PoRV)VP7蛋白的结构及功能,根据Gen Bank发表的猪轮状病毒VP7基因序列设计1对特异性引物,扩增1株猪轮状病毒贵州流行株VP7基因全序列并进行序列测定及生物信息学分析。结果显示:VP7基因全长为1 062 bp,包含一个981 bp的开放发阅读框,编码326个氨基酸,氨基酸突变主要发生在高变区。与已知的14个国内外参考毒株VP7核苷酸和推导的氨基酸序列比较,同源性分别为71.5%~97.0%和72.4%~98.7%,与G4型毒株核苷酸同源性及推导的氨基酸同源性分别为86.6%~97.0%和92.9%~98.7%。核苷酸系统进化树结果显示,贵州流行株与G4型毒株CMP070/09属同一个分支,因此推测贵州流行株为G4型猪轮状病毒。预测PoRV VP7蛋白理论相对分子质量为37.2 ku,等电点为4.75,半衰期为30 h,不稳定系数为31.22;跨膜结构及信号肽分析表明VP7蛋白有2个跨膜区,无信号肽区域;抗原表位预测显示VP7蛋白在第69~104、145~150、176~183、210~224、311~321位及其附近肽段可能为其优势抗原表位;结构预测显示,VP7蛋白存在1个N-糖基化作用位点、14个磷酸化位点,不存在O-糖基化位点。     

猪轮状病毒Rotavirus A pig/China/NMTL/2009/G9P[23]株的分离与鉴定

A群轮状病毒(GAR)是引起人类和多种动物腹泻的主要病原体,病原的分离与鉴定是轮状病毒(RV)流行病学、病原学等研究的基础.本研究采用接种MA 104细胞的方法,从内蒙古某猪场患病猪腹泻粪便中分离一株病毒,经3次蚀斑克隆纯化后,采用电镜观察、PCR鉴定和序列测定进行分析,结果表明该分离株为猪轮状病毒(PoRV).致病性试验表明该分离株能够引起仔猪急性腹泻,RT-PCR扩增其VP4、VP6和VP7的基因节段并进行序列测定,按照A群RV的最新分类方法,确定该分离株的VP6、VP7和VP4基因型分别为I5型、G9型和P[23]型.因此,将该分离株命名为Rotavirus A pig/China/NMTL/2009/Q9P[23].     

一株牦牛源G6P[11]型牛轮状病毒的分离鉴定及部分基因的序列分析

本研究的目的是分离、鉴定牦牛源牛轮状病毒(bovine rotavirus, BRV)。将经RT-PCR检测BRV阳性的牦牛腹泻粪便样本接种MA-104细胞,进行病毒分离和鉴定,并对其VP4、VP6和VP7完整基因进行测序,分析其分子特征。结果显示:病毒盲传3代后出现细胞病变,至第7代后出现细胞病变的时间稳定,经蚀斑纯化后测得病毒滴度为10^8.39TCID₅₀·mL^-1。分离株经RT-PCR、间接免疫荧光和电镜观察证实为BRV,命名为HY-1株;扩增HY-1株VP4、VP6和VP7完整基因序列,分析表明HY-1株为G6P[11]I2型;系统发育树显示,HY-1株VP4、VP6和VP7节段分别与中国牛源DQ-75株和印度牛源M-1和RUBV319株遗传演化关系最近,可能为重配毒株。与国内的G6型和P[11]型BRV毒株相比,HY-1株的VP4和VP7蛋白重要氨基酸位点变化较大。成功分离得到一株牦牛源BRV,基因型为G6P[11]型,为我国首次报道。     

中国不同地区猪轮状病毒的分离鉴定及分子流行病学分析

为鉴定国内不同地区猪轮状病毒(Porcine rotavirus,PRo V)并分析其分子流行病学特征,本研究将从我国不同地区收集病料中检测到的16份PRoV阳性仔猪粪便样品和小肠内容物处理后接种MA-104细胞,传代后进行荧光定量PCR (qPCR)和间接免疫荧光试验(IFA)鉴定,并经电镜观察。结果显示,其中7份样品F1～F3代病毒液qPCR Ct值均随着传代次数的升高而逐渐降低,IFA鉴定结果显示均能在细胞中观察到特异性荧光,电镜观察到直径约70 nm无囊膜的病毒粒子,表明本实验分离到7株PRoV。利用RT-PCR扩增7株分离株和其余9份PRoV的阳性样品的VP7基因并测序分析基因型,基于VP7基因进行同源性和遗传进化分析。结果显示,16份阳性样品包含3种G型,即G9(7/16)、G4 (6/16)和G3 (3/16),同时G9型FJ-2021分离株和G4型JS01-2021分离株与近两年流行株亲缘关系较近。统计16份样品中G型PRoV的地域分布,结果显示华东地区有G9、G4和G3型的流行,四川有G3和G9型流行,广东有G9型的流行,分别与华东地区、四川地区和广西地区报道的流行G...     

仔猪感染猪轮状病毒的鉴定及基因分析

为弄清2013年年初上海某猪场发生的仔猪腹泻疫情病因,本研究随机采集发病猪场的仔猪腹泻样品9份,利用RT-PCR方法对采集样品进行病原检测。结果显示,9份临床样品中有4份为猪轮状病毒阳性,而猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒均为阴性。根据GenBank公布的猪轮状病毒参考株序列设计两对引物,对其中阳性样品的VP6和VP7基因进行RT-PCR扩增、基因克隆和序列测定分析。结果显示,4份阳性样品的VP6基因大小为1356 bp,VP7基因大小为1100 bp;序列分析结果显示,VP6基因与A群代表株OSU的氨基酸同源性为64.1%~87.0%,与代表株Gottfriend的氨基酸同源性为26.3%~60.8%;VP7基因与不同G型代表株的氨基酸同源性为71.8%~97.3%。根据上述结果分析,我们推测引起此次仔猪腹泻疫情中的主要病原是由属于A群G9血清型的猪轮状病毒引起,本研究为此次仔猪腹泻疫情的诊断提供了依据。     

G8P[1]型牛轮状病毒的分离鉴定及序列分析

为了对大庆地区患有腹泻疾病的舍饲牛进行病原鉴定,通过RT-PCR方法对病料进行检测,将轮状病毒阳性样品接种MA104细胞进行病毒分离,扩增分离株VP7、VP4片段,将扩增产物纯化后连接在pMD18-T载体上,转化到大肠杆菌TOP10感受态细胞中进行亚克隆,将鉴定为阳性的重组质粒进行序列测定,并利用DNA Star与GenBank上的参考序列进行同源性分析。结果表明,从样品中分离到1株BRV毒株,将其命名NX23。核苷酸序列分析表明,分离株NX23属于G8P[1]型轮状病毒,确认了G8P[1]型牛轮状病毒在我国的流行,为我国BRV分子进化及其RV分子流行病学的进一步研究奠定基础。     

猪轮状病毒分离与鉴定

采用MA104细胞从广东省某猪场患有明显腹泻症状的仔猪粪便中分离了1株产生明显细胞病变(CPE)的病毒。电镜观察显示,病毒粒子呈现较为典型的轮状病毒的形态特征;对其VP6基因进行序列分析,结果表明该分离株与A群猪轮状病毒代表株OSU和Gottfried的核苷酸同源分别为86.3%和80.8%,氨基酸序列同源性分别为97.7%和93.2%。综合所见,所分离的毒株为A群猪轮状病毒。     

新分离牛轮状病毒及其血清型的研究

从爆发犊牛腹泻的牛群中分离到一株轮状病毒,（CHLY）并以其感染的MA-104为试验材料,较为系统的对轮状病毒的形态结构及其宿主的超微病变进行了观察,并将其主要保护性抗原VP7基因克隆入pUCm-T载体进行序列分析及测定,鉴定其血清型。轮状病毒粒子为圆形颗粒,直径在60-70nm之间,病毒粒子由双层衣壳包裹,呈典型的轮状病毒车轮状结构。在轮状病毒感染的细胞质中,可观察到处于不同发育阶段的子代病毒粒子。对轮状病毒的中和抗原VP7的序列分析结果表明CHLY与G6血清型轮状病毒RF株同源性最高,核苷酸同源性为98．9％,结果表明分离的轮状病毒CHLY株为G6型轮状病毒。     

A群猪轮状病毒JS株vp7基因序列分析

根据已发表的猪轮状病毒OSU毒株vp7基因核苷酸序列ORF两端保守区序列,设计一对特异引物,以猪轮状病毒JS毒株反转录cDNA为模板,通过PCR方法扩增出长约1000 bp目的片段。将其进行T-A克隆、序列测定和分析。结果表明,vp7基因全长1062 bp,含有一个981 bp的开放阅读框,编码326个氨基酸。与已知的15个毒株vp7全长基因的核苷酸及推导的氨基酸序列比较,同源性分别为74.5%～78.5%和75.2%～83.1%,核苷酸系统发育进化树结果表明,JS毒株与轮状病毒G9型参考毒株ICB2185、O-1亲缘关系较近,分为一个群,表明JS毒株血清型为G9型。目前,我国尚未见猪及其它动物轮状病毒G9型流行株的报道。