BHK-21细胞中猪乙型脑炎病毒动态增殖的研究

为了研究猪乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)在仓鼠肾细胞(BHK-21细胞)中的增殖情况，试验首先建立了实时荧光定量PCR方法，并检测该方法的敏感性、特异性和重复性，然后利用建立的实时荧光定量PCR方法和病毒半数组织感染量(TCID₅₀)方法测定并比较猪JEV在BHK-21细胞中的增殖规律。结果表明：建立的猪JEV实时荧光定量PCR检测方法的扩增效率为99.3%,敏感性、特异性和重复性良好，检测敏感性可以达到1.0×10¹ copies/μL;TCID₅₀方法测定的细胞悬液和细胞培养上清液中的病毒含量分别为1.0×10^5.44 TCID₅₀/0.1 mL和1.0×10^4.86 TCID₅₀/0.1 mL,实时荧光定量方法测定的病毒粒子数量分别为1.0×10^7.50 copies/μL和1.0×10^5.60 copies/μL,两种方法在细胞悬液中...     

猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立一种快速、敏感、特异的猪瘟病毒（classical swine fever virus,CSFV）实时荧光定量PCR检测方法,本研究根据GenBank中CSFV E2基因保守区域序列,设计了一对特异性引物和一条特异性探针,以CSFV总RNA为反转录模板,经优化反应条件,建立CSFV实时荧光定量PCR检测方法,并对其进行了特异性、敏感性、重复性试验;利用所建立的方法对35份临床疑似CSFV感染样品进行了检测。结果表明,本研究建立的CSFV实时荧光定量PCR检测方法在10¹~10⁶拷贝/μL范围内有很好的线性关系,相关系数为0.999;CSFV细胞培养物出现阳性扩增信号,但ST正常细胞对照和其他8种病原对照未出现扩增,特异性良好;该方法重复性好、敏感性高,最低检测模板浓度为10拷贝/μL,并且CSFV的最低检测限为1 TCID₅₀/mL;自35份疑似CSFV感染样品中检出19份阳性样品,与本课题组建立的CSFV Nested RT-PCR检测结果和克隆测序结果一致。本研究成功建立了CSFV实时荧光定量PCR检测方法,可用于CSFV的快速检测。     

4种猪腹泻病毒恒温隔绝式荧光RT-PCR检测方法的建立及应用

为鉴别猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PoRV)和猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)这4种猪主要腹泻病毒，本研究分别针对PEDV M基因、TGEV M基因、PoRV NSP5基因、PDCoV M基因设计特异性引物和探针，经过方阵法优化恒温隔绝式荧光RT-PCR(iiRT-PCR)反应条件，建立了检测这4种猪腹泻病毒iiRT-PCR方法。用建立的iiRT-PCR方法分别检测PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、日本脑炎病毒(JEV),并对iiRT-PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果显示该方法特异性强，对PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV的检测下限分别为10²、10²、10³、10³ TCID₅₀/mL,并具有良好的组内和组间重复性；而荧光定量PCR方法的检测下限分别为10¹、10²、10²、10^2<...     

基于盖他病毒nsP3基因的TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用

为建立一种灵敏、特异且高效的检测盖他病毒(GETV)的TaqMan荧光定量RT-PCR方法，本研究根据GETV的nsP3基因设计特异性引物及探针，以GETV (SC483株) cDNA作为模板，扩增目的基因并克隆至p ET-29a载体中，构建重组质粒标准品p ET29a-nsP3并经PCR和测序鉴定。基于该质粒标准品，采用方阵法优化引物、探针浓度以及退火温度，初步建立了一种基于GETV nsP3基因的TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法，并绘制标准曲线。以GETV (SC483株、SC266株)、辛德毕斯病毒(SINV)、猪流感病毒(H3N2、SIV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪繁殖和呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)等病毒的基因组RNA反转录为cDNA作为模板，利用本实验建立的TaqMan荧光定量RT-PCR方法检测，结果显示，仅GETV为阳性，SINV、SIV、TGEV、PEDV、PRRSV均为阴性，表明该方法特异性较强；分别以10倍倍比稀释(3.07×10^-1拷贝/μL～3.07×10⁸拷贝/μL...     

水貂圆环病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为快速检测水貂圆环病毒(MiCV),本试验根据MiCV Cap基因序列设计合成特异性引物,建立了水貂圆环病毒SYBR Green II实时荧光定量PCR检测方法。结果显示,该方法在模板浓度为1.0×10⁶ ～1.0×10¹ copies/μL范围内呈良好线性关系,相关系数为0.9983。本试验建立的检测方法对水貂阿留申病毒、猪圆环病毒2型、水貂肠炎病毒、犬瘟热病毒和猪伪狂犬病毒进行检测均无特异性扩增,批内和批间CV均小于2%,对重组阳性质粒的检测下限为1.0×10¹ copies/μL,比普通PCR的敏感度高100倍,对阳性样品DNA的检测下限为2.38×10^-2 pg/μL,比普通PCR的敏感度高1000倍。应用该方法对吉林省部分毛皮动物养殖场的水貂、狐狸、貉和环境样品进行检测,结果其阳性率分别为57.23%、48.42%、39.71%和68.48%。上述结果表明,本研究建立的实时荧光定量PCR检测方法具有良好的灵敏性、特异性和重复性,为MiCV的诊断及流行病学调查提供技术支持。     

一种快速检测非洲猪瘟病毒I177L基因缺失毒株的荧光定量PCR方法

本研究旨在建立一种特异、灵敏、快速的ASFV-G-ΔI177L实时荧光定量PCR(FQ-PCR)检测方法。针对ASFV I117L基因的保守区域设计特异性引物/探针对，通过优化反应条件和反应程序，从而提高检测方法的灵敏性，并验证检测方法的重复性和特异性。对170份临床样品进行了检测，并与OIE推荐的检测方法进行对比。结果表明，基于ASFV I117L基因所设计的特异性引物/探针对，能扩增2.2×10¹～2.2×10¹⁰copies·μL^-1的pMD18-I177L标准质粒，建立的标准曲线R²可达0.995 7,最低检测模板浓度为2.2×10¹copies·μL^-1;该方法扩增反应采用一步法，耗时35 min,批内、批间变异系数均<1.8%;针对ASFV I177L基因特异性扩增，但对其他5种常见猪病毒核酸样品及无酶水未见阳性扩增；用该方法对170份临床样品进行检测，本方法和OIE推荐的检测方法具有良好的一致性。本研究成功建立了一种特异、灵敏、快速AS...     

四种致泻性大肠杆菌多重PCR检测方法的建立及在大熊猫上的应用

致泻性大肠杆菌可引起大熊猫血水样便、休克，严重者可危及生命。为准确鉴定4种致泻性大肠杆菌病原，本研究通过对引物浓度、退火温度、反应条件等进行优化，建立了能同时检测EPEC和EHEC的多重PCR方法以及ETEC和EAEC的多重PCR方法。结果得出：两种多重PCR方法特异性强，仅对特有的毒力基因进行扩增，对其他10种大熊猫源病原菌的扩增结果均为阴性；敏感性较高，细菌基因组DNA检测中EHEC和EPEC的检测下限为2.71×10⁴拷贝/μL,EAEC的检测下限为3.23×10⁴拷贝/μL,ETEC的检测下限为3.23×10³拷贝/μL；菌液检测中EPEC和EHEC的检测下限为1.85×10⁴CFU/mL,ETEC的检测下限为2.9×10³CFU/mL,EAEC的检测下限为2.62×10⁴CFU/mL；不同时间段重复8次，均扩增出对应的目的条带，证明重复性好。利用多重PCR和单一PCR方法分别检测110份样品，结果得出esc V基因阳性率为1.82%(2/110)...     

基于胞内劳森菌16S rDNA基因的TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与应用

参考GenBank发表的胞内劳森菌(Lawsonia intracellularis,L.intracellularis)基因组16SrDNA序列,设计1对特异性引物和1条TaqMan探针,以L.intracellularis疫苗核酸为模板,建立L.intracellularis TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。对该检测法制作了标准曲线,并进行了特异性、敏感性和重复性试验,并将其应用于猪增生性肠炎诊断。结果表明,所建立的TaqMan实时荧光定量方法特异性强,仅对含有L.intracellularis扩增出S型荧光曲线,而对大肠杆菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌、副猪嗜血杆菌等均无扩增;该方法在1.2×102¹.2×108 copies/μL有良好的线性关系,相关系数为0.972;最低检测浓度为10copies/μL,重复性良好。对79份临床样品检测表明,该方法灵敏度高于普通PCR方法,可用于猪增生性肠炎的临床诊断。     

猪圆环病毒2型灭活疫苗中病毒抗原含量实时荧光定量PCR检测方法的建立

依据GenBank公布的猪圆环病毒2型Cap基因序列,在保守区域设计特异性引物和TaqMan探针,优化反应体系,建立评价猪圆环病毒2型灭活疫苗中病毒含量的实时荧光定量PCR检测方法,对方法的特异性、敏感性和重复性进行试验,并验证灭活剂用量和灭活时间对检测结果的影响。结果显示：该方法只对猪圆环病毒2型基因有特异性扩增,其他3种对照病毒基因的扩增结果均为阴性;检测灵敏度达到10^2.0 TCID₅₀/mL,比普通PCR方法高100倍;方法的重复性好,对同一样品进行10次检测,变异系数为2.28%;不同灭活剂用量和灭活时间对结果的影响较小,不会因各厂家使用的灭活剂用量和灭活时间不同,影响疫苗对比实验的公平性。该研究成功建立了一种评价猪圆环病毒2型灭活疫苗中病毒含量的实时荧光定量PCR检测方法,用于猪圆环病毒2型灭活疫苗样品中病毒抗原含量的定量,其结果可以反映不同猪圆环病毒2型灭活疫苗样品中抗原含量差异,为研究猪圆环病毒2型灭活疫苗病毒抗原含量评估方法提供了新的思路。     

猪呼吸道病原菌多重PCR检测方法的建立及应用

为建立一种快速诊断由猪链球菌(SS)、猪胸膜肺炎放线杆菌(App)、猪多杀性巴氏杆菌(Pm)、副猪嗜血杆菌(Hps)、猪支气管败血波氏杆菌(Bb)和猪肺炎支原体(Mhp)单独或混合感染引起的猪呼吸道疾病的检测方法,基于上述6种病原菌对应的gdh(SS)、apxⅣA(App)、KMT1(Pm)、16S rRNA(Hps)、fla(Bb)和p36 ldh(Mhp)基因设计特异性引物,通过优化各反应条件建立了能同时检测SS、App、Pm、Hps、Bb和Mhp的多重PCR方法。结果显示,该方法特异性强,仅对SS、App、Pm、Hps、Bb和Mhp有特异性扩增,对大肠埃希氏菌、奇异变形杆菌、停乳链球菌和金黄色葡萄球菌等其他病原菌的扩增结果均为阴性;敏感性较高,对6种病原菌DNA的最低检出限分别为SS 8.66×10²拷贝/μL、App 1.05×10⁴拷贝/μL、Pm 8.61×10²拷贝/μL、Hps 9.01×10²拷贝/μL、Bb 7.54×10²拷贝/μL、Mhp 3.86×10...     

猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒双重荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为实现对猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的快速鉴别诊断,根据PEDV的N基因和TGEV的S基因序列设计引物,并以猪β-肌动蛋白(ACTB)作为内参对照,建立了PEDV和TGEV的TaqMan探针双重荧光定量PCR检测方法。结果显示：该方法对PEDV、TGEV和ACTB的检测灵敏度分别为1、10和10 copies/μL;PEDV和TGEV敏感度为10^0.02 TCID₅₀和10^0.05 TCID₅₀,高于常规RT-PCR,批内和批间变异系数均小于1%。与猪德尔塔冠状病毒、猪急性腹泻综合征冠状病毒、猪轮状病毒、乙型脑炎病毒、塞内卡谷病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、脑心肌炎病毒、猪瘟病毒、伪狂犬病毒和猪圆环病毒2型均无交叉反应。采集124份临床病料样品进行检测,PEDV阳性率为42.74%,TGEV阳性率为8.87%,检测结果与该病毒单一荧光RT-PCR方法的检测结果均一致,证明该方法具有较高特异性和敏感性,可用于PEDV和TGEV临床病料检测。     

猪圆环病毒2型TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

采用PCR方法克隆了猪圆环病毒2型 (porcine circovirus 2,PCV2) 衣壳蛋白（capsid protein,CAP）基因,构建了重组质粒p-18T-CAP,并将其作为标准阳性模板。参照GenBank收录的PCV2 ORF2基因设计合成1对特异性的引物和与该引物相匹配的特异探针,通过对反应条件进行优化,以定量的10倍系列稀释的质粒p-18T-CAP为标准品进行TaqMan荧光定量PCR扩增,建立了一种检测PCV2的TaqMan荧光定量PCR方法。试验结果显示,该方法与猪圆环病毒 1 型、猪流感病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪瘟病毒等均无交叉反应;该方法最低可检测到4.53×10²拷贝/μL,比PCR检测方法高100倍;其标准曲线线性范围是10²～10⁹拷贝/μL,且具有良好的重复性。     

胞内劳森菌TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立用于检测临床粪便样品中胞内劳森菌(Lawsonia intracellularis,L.intracellularis)的TaqMan荧光定量PCR方法,本研究参考GenBank中发表的L.intracellularis PHE/MN1-00株基因组序列设计50对引物,通过SYBR GreenⅠ荧光染料法PCR验证引物的特异性,针对扩增效率最好的特异性上、下游引物合成相应的TaqMan探针,优化反应条件,对其线性范围、敏感性和重复性进行验证,系统的完成了该方法的建立。结果表明,所建立的TaqMan荧光定量PCR方法,特异性强;在靶标核酸为2.95×10¹～2.95×10⁶拷贝/μL区间线性关系良好,相关系数R²=0.998 1,扩增效率为96.51%;最低检测浓度为5拷贝/μL;批间和批内的CV均小于2%,重复性好。使用普通PCR方法与本方法对2020年10月至2021年2月采自江西地区猪场的373份粪便样品进行检测,L.intracellularis的总检出率分别为21.4%(80/373)和27.6%(103/...     

猪冠状病毒通用荧光定量PCR检测方法的建立

已知感染猪群的冠状病毒有猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)、猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)、猪呼吸道冠状病毒(PRCV)、猪血凝性脑脊髓炎病毒(PHEV);本研究拟建立针对这6种病毒的通用荧光定量PCR检测方法。依据NCBI公布的这6种猪冠状病毒序列，利用MEGA软件进行全基因序列比对，通过分析在ORF1b中找到1段长为196 bp的保守序列，设计兼并引物，建立了用于检测猪冠状病毒的通用荧光定量PCR检测方法；结果显示，该检测方法能扩增出6种猪冠状病毒，对PDCoV、PRCV、PHEV、SADS-CoV、TGEV的灵敏性均可达到10¹拷贝/μL,对PEDV的灵敏性可达到10⁰拷贝/μL;与CSFV、PRRSV、PPV、PCV、PRV无交叉反应，特异性良好；组内和组间变异系数均小于2.2%,重复性良好。利用建立的检测方法对62份病料进行检测，检测出27份样品呈现猪冠状病毒阳性，而利用普通RT-PCR方法共检测出24份阳性样品。选择2份猪冠状病毒阳性样品进行克隆测序，在NCB...     

猪流感病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

本研究选取猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)的NP基因序列设计引物和探针,建立了检测SIV的TaqMan实时荧光定量PCR方法。以梯度稀释的含有SIV目的扩增片段的质粒作为标准品,进行定量PCR反应以确定检测灵敏度。2.0×10⁸至2.0×10²拷贝/μL 7个数量级的范围内定量PCR有"S"型扩增曲线,检测灵敏度为20个拷贝/μL。根据病毒拷贝数与Ct值的关系绘制了标准曲线。该方法具有特异性,对猪瘟病毒、伪狂犬病病毒、口蹄疫病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸都没有扩增反应。本研究建立的实时定量PCR方法,灵敏度高、特异性好,可以进行定量分析,在猪流感的快速检测上具有重要意义。     

猪轮状病毒VP4基因重组腺病毒的构建及抗体水平评价

【目的】构建猪轮状病毒（Porcine rotavirus,PoRV）流行株PoRV G9P[23]型的VP4基因重组腺病毒,为开发PoRV候选基因工程疫苗奠定基础。【方法】参考GenBank中流行株PoRV G9P[23]型的VP4基因序列（登录号：MH898990.1）合成PoRV VP4基因,将得到的目的基因与腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV进行重组,转化大肠杆菌Top10感受态细胞,构建腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV-VP4;腺病毒穿梭载体经过Pme Ⅰ内切酶线性化处理后与含有腺病毒骨架pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态细胞进行同源重组获得重组质粒pAd-VP4,对重组质粒进行Pac Ⅰ酶切鉴定,并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。将重组质粒转染HEK293A细胞获得重组腺病毒rAd-VP4,对该重组腺病毒进行扩大培养并测定重组腺病毒的半数组织培养感染剂量（TCID₅₀）;通过RT-PCR检测其体外表达情况,Western blotting检测其反应原性;将制备的重组腺病毒用不同病毒滴度和不同免疫次数对小鼠进行腹腔免疫,收集血清通过ELISA法测定IgG抗体水平。【结果】RT-PCR扩增出1条大小为2 343 bp的rAd-VP4重组腺病毒条带,测序结果正确,表明重组腺病毒rAd-VP4构建成功,测得rAd-VP4病毒滴度为10^6.5 TCID₅₀,Western blotting结果表明,重组腺病毒rAd-VP4在蛋白水平上得到了正确表达,蛋白的分子质量约为87 ku。小鼠IgG抗体检测结果表明,在用10^6.5 TCID₅₀ rAd-VP4免疫后的第35和42天,小鼠血清中的IgG抗体水平显著高于10^5.3 TCID₅₀ TGE-PED-PRV三联活疫苗IgG抗体水平（P<0.05）;10^6.5 TCID₅₀ rAd-VP4在免疫后第35和42天产生的抗体水平显著高于10^5.5和10^4.5 TCID₅₀ rAd-VP4（P<0.05）,而10^5.5 TCID₅₀ rAd-VP4在免疫后第28天产生的抗体水平显著高于10^6.5和10^4.5 TCID₅₀ rAd-VP4（P<0.05）。10^6.5 TCID₅₀ rAd-VP4的2次免疫和3次免疫产生的IgG抗体在不同免疫时间均差异不显著（P>0.05）。【结论】本研究成功构建了重组腺病毒rAd-VP4,其病毒滴度为10^6.5 TCID₅₀。10^6.5和10^5.5 TCID₅₀ rAd-VP4分别在第42和28天产生较高的IgG抗体水平,2次免疫和3次免疫对产生IgG抗体水平均无显著影响。试验结果可为开发PoRV重组腺病毒候选疫苗提供参考。     

猪主要腹泻病毒多重RT-PCR检测方法的建立及初步应用

为建立检测猪主要腹泻病毒的多重RT-PCR方法，本试验参考GenBank中登录的猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus of swine, TGEV)M基因、猪萨佩罗病毒(porcine sapelovirus, PSV)VP1基因、猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus, PDCoV)N基因和猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)N基因的序列，分别设计相应的引物，构建4种病毒的阳性质粒。以阳性质粒为标准品，通过优化反应条件和反应程序，建立了检测猪主要腹泻病毒的多重RT-PCR方法，并确定了该检测方法的特异性、灵敏性和重复性。结果显示，该方法具有较高的灵敏性，对PSV、TGEV、PDCoV和PEDV的最低检测量分别为1.37×10²,1.44×10²,1.51×10²和1.56×10²拷贝/μL。而扩增猪细小病毒(porcine parvovirus, PPV)、猪瘟病...     

鸡大肠杆菌、沙门氏菌、空肠弯曲杆菌和奇异变形杆菌SYBR Green Ⅰ多重定量PCR方法建立

研究旨在鉴别检测鸡场中大肠杆菌、沙门氏菌、空肠弯曲杆菌和奇异变形杆菌等4种常见病原菌。试验在已有4种病原菌单一定量PCR检测方法的基础上,采用SYBR GreenⅠ多重定量PCR检测方法检测大肠杆菌、沙门氏菌、空肠弯曲杆菌和奇异变形杆菌。结果显示,建立检测鸡大肠杆菌、沙门氏菌、空肠弯曲杆菌和奇异变形杆菌SYBR GreenⅠ多重定量PCR检测方法与其他菌株无交叉反应;大肠杆菌、沙门氏菌、空肠弯曲杆菌和奇异变形杆菌的最低检测限分别为5.6×10¹、8.9×10⁰、7.8×10⁰、3.8×10¹CFU/mL;Ct值变异系数在2.22%之内。研究表明,试验所建立的方法特异性强、灵敏性高、重复性好,可应用于临床中大肠杆菌、沙门氏菌、空肠弯曲杆菌和奇异变形杆菌感染的快速检测。     

牛传染性鼻气管炎病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立

为检测牛传染性鼻气管炎病毒,通过设计针对gB基因的特异性引物扩增gB基因,构建阳性重组质粒。经过优化建立了牛传染性鼻气管炎病毒的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法。结果显示,建立的实时荧光定量PCR检测方法在阳性标准质粒拷贝数在5.474×10⁴～5.474×10⁹拷贝/μL时线性关系良好,线性相关系数R²=0.999 3。该方法最低检测限为5.747×10²拷贝/μL;可以特异性检测牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV),与牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛副流感病毒(BPIV)、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)不发生交叉反应。病毒滴度与拷贝数的线性关系良好,线性相关系数R²=0.985 4。该方法为牛传染性鼻气管炎病毒的快速检测提供了技术支持。