拟南芥芥子酶基因TGG4的克隆、表达和酶活性鉴定

芥子酶是一类水解硫代葡萄糖苷的酶,广泛存在于十字花科植物中。人们在拟南芥中已经发现了3个芥子酶基因,分别是TGG1、TGG2和TGG3。通过对拟南芥基因组数据库的搜索,发现3个新的芥子酶基因TGG4、TGG5和TGG6。本研究克隆了TGG4基因全长cDNA序列,构建酵母表达载体,转化毕氏酵母GS115,进行甲醇诱导表达,重组蛋白用离子交换层析柱纯化。纯化的重组蛋白经测定具有芥子酶活性,而且其活性被低浓度的维生素C激活,具有芥子酶的典型特征。芥子酶系统发生树分析进一步表明,TGG4代表一个芥子酶基因新亚家族。     

拟南芥TGG5基因的克隆、表达和酶学特性

芥子酶是广泛存在于十字花科植物中的一类降解硫代葡萄糖苷的酶。当植物受到病虫侵袭时, 芥子酶与其底物硫代葡萄糖苷结合,释放有毒的水解产物形成植物重要的化学防御系统。TGG5 是新 发现的一类芥子酶基因,对其研究将有利于揭示芥子酶防御系统的功能。试验克隆了拟南芥TGG5 基 因cDNA,构建酵母表达载体,转化毕氏酵母GS115。经甲醇诱导表达和Ni 亲和层析,获得纯化的 TGG5 重组蛋白。SDS-PAGE分析表明,重组蛋白分子量集中在58 kD左右,并有较明显拖尾,呈现典型 的糖基化蛋白的特征。进一步探讨了TGG5 重组蛋白的酶学特性,结果表明：该芥子酶的Km为1.96 mmol/L,Vmax为0.084 mmol/(min·mg);酶反应的最适pH 为5.5;该芥子酶在37~80℃范围内有较广泛的 温度适应性,并具有较好的80℃热稳定性;NaCl对该酶有明显的抑制作用;低浓度抗坏血酸具有激活芥 子酶的作用,抗坏血酸终浓度为1.5 mmol/L时,酶活力最大。RT-RCR分析,证实了TGG5 只在拟南芥根 中特异表达,这表明TGG5 可能代表了一个芥子酶基因新亚家族。     

拟南芥硫代葡糖苷酶基因TGG1的克隆、表达和酶学特性

本研究克隆拟南芥硫代葡糖苷酶基因TGG1,利用毕氏酵母表达。重组蛋白用镍亲和柱纯化,获得高纯度芥子酶。重组蛋白分子量78 kD,与天然TGG1分子量接近,为糖基化蛋白。TGG1信号肽在酵母中具有分泌功能,约25%芥子酶分泌到培养基中。TGG1重组蛋白具有广泛的pH适应性,最适反应温度40℃左右。其活性被低浓度维生素C激活,被高浓度维生素C抑制。用Hanes plot方法计算TGG1重组蛋白以Sinigrin为底物时,Km为65μmol/L,最大反应速率Vmax=3.28μmol.min-1.mg-1。     

拟南芥根部芥子酶活性测定条件及其与重组蛋白酶学活性比较研究

芥子酶是一类降解硫代葡萄糖苷的酶,该基因表达具有组织特异性。研究表明,新型芥子酶TGG4和TGG5都是在根部表达。为了研究TGG4、TGG5的功能作用,提取了生态型拟南芥Col-0根部以及含有重组蛋白酵母的芥子酶,进行了酶活性条件测定以及对比分析。结果表明：根部芥子酶有更高的抗坏血酸激活浓度为2 mmol/L;根部芥子酶同重组蛋白的最佳反应温度以及pH范围一致,在37℃,体系缓冲液pH 4.5时,根部芥子酶活性测定效果最好;NaCl对根部芥子酶和重组蛋白芥子酶都有强烈抑制作用。因此推断根部芥子酶在耐盐碱、耐高温方面没有起作用,该酶也不能帮助根部抵御病虫侵袭,但是对根部的生长起到重要作用。     

木薯Linamarase基因的克隆、表达及酶学特性分析

亚麻仁苷酶(Linamarase)是存在于木薯、巴豆等作物中的降解生氰葡萄糖苷Linamarin（亚麻仁苷）的酶,在结构上与芥子酶有很大的相似性,对它的研究有利于揭示生氰葡萄糖苷酶和芥子酶之间的关系以及芥子酶的起源问题。通过真核表达的方法,克隆了木薯Linamarase基因,构建酵母表达载体,转化毕赤酵母GS115,经诱导表达和亲和纯化,获得纯化的Linamarase重组蛋白。SDS-PAGE分析表明,重组蛋白分子量集中在71 kD左右。该酶最适反应温度在37℃左右,最适pH约为5。以pNPG为底物时,Km为1.70 mmol/L,最大反应速率Vmax为8.36 μmol/(min?mg)。     

植物RNA干涉载体的构建并用于拟南芥芥子酶基因的表达

为了研究RNA干涉在抑制芥子酶基因TGG4和TGG5表达中的作用,本文在TGG4、TGG5编码序列中设计IT45 siRNA的特异靶序列,以拟南芥7SL-4基因为模板扩增启动子和终止子,连接并克隆到植物表达载体pBP5中,构建成了siRNA真核表达载体.同时利用花序浸泡法转化拟南芥.最后酶活测定的结果显示,TGG4、TGG5基因的表达受到了大部分抑制.这说明本研究构建的RNAj载体对基因表达沉默是有效的.     

番木瓜芥子酶基因的表达调控和酶活性研究

以番木瓜为材料,通过RT-PCR方法,研究了芥子酶基因CpTGG1和CpTGG2在不同组织器官的表达情况,结果表明CpTGG1基因在番木瓜的茎、叶、花、种子中表达,在根和果实中不表达,而CpTGG2仅在根中表达,在其它器官中都没有检测到表达产物,表明两个芥子酶基因存在明确的分工。两个基因都不在果肉中表达。酶活性测定表明,除了果肉外的其它器官中都有芥子酶活性,这与RT-PCR的结果是一致的。对叶片芥子酶的活性研究结果表明,其最适pH为8.0,最适温度为45℃,高温下（80℃）酶迅速失活,最适Vc浓度为1.5mM,高盐浓度对酶活性有抑制作用。     

绿盲蝽膜结合型海藻糖酶ALTre-2基因表达、纯化及酶学特性

以绿盲蝽为材料,在前期获得绿盲蝽膜结合型海藻糖酶(ALTre-2)基因的基础上,构建了ALTre-2原核表达载体(pET28a-ALTre-2),经IPTG诱导表达、变性、复性和蛋白纯化后,获得具海藻糖酶活力的重组蛋白,最后在以海藻糖为底物及重组蛋白浓度为1.1 mg·mL-1的条件下,对纯化得到的重组ALTre-2蛋白进行活性检测,确定了其酶促反应的最佳pH和最适温度.试验结果表明:ALTre-2基因在大肠杆菌BL21(DE3)中能够高效表达一个约60 kD大小的蛋白,SDS-PAGE显示该蛋白以包涵体形式存在,经变性、复性及蛋白纯化获得了具海藻糖酶活力的重组蛋白;该重组ALTre-2蛋白在pH为7.0时活性最高,同时重组ALTre-2蛋白酶活性最适温度是50℃.研究结果为深入探讨绿盲蝽膜结合型海藻糖酶分子调控机制奠定基础.     

α-葡萄糖苷酶基因在黑曲霉中的同源表达

本实验以黑曲霉(Aspergillus niger)内源α-葡萄糖苷酶为基础,对黑曲霉菌株部分序列进行了克隆,构建了能够通过农杆菌介导法整合到黑曲霉基因组中的pSZH-10-6-agd C2表达载体。在转化黑曲霉之后检测到目的基因能够合成蛋白并分泌到细胞外的发酵液中。通过测定发酵液中的重组蛋白对底物的催化能力发现此基因在改造后仍具备酶活性,并且得出此酶的最适反应温度为40℃左右,最适pH值在6左右。     

海马齿甜菜碱醛脱氢酶基因克隆、高效表达及酶学特性分析

在许多渗透调节剂中,甜菜碱是最理想的有机小分子渗透调节物质。甜菜碱在植物体内大量积累不会带来危害,同时能提高植物对环境胁迫的抗性。将海马齿中克隆到的甜菜碱醛脱氢酶基因构建到表达载体pET-28a(+)上,获得重组载体pET-SpBADH并将其成功地转化到BL21(DE3)中得到重组工程菌,经IPTG诱导能高效表达55 kD目的蛋白,表达量可以达到301 μg mL–1。酶学特征分析表明,该蛋白最适pH值为7.2,在偏碱条件下能维持较高的催化活性;SpBADH蛋白对高温敏感,且温度对催化活性影响较大,超过55℃时酶活性只有20%,最适酶催化活性温度为37℃;而有机小分子醇类对酶的催化活性有保护作用,可以通过自身特征维持酶催化活性的微环境。     

制备乳清抗氧化肽的水解条件优化

采用碱性蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶3种酶对乳清蛋白进行酶水解试验,研究了不同酶解产物、水解时间、水解温度和pH值下的乳清抗氧化肽的水解度和TBARS值,确定了制备乳清抗氧化肽的最佳水解参数。结果表明,乳清蛋白水解物具有抗氧化活性,最佳复配条件是碱性蛋白酶的水解时间5 h,最佳水解温度为65℃,pH值8.5;胰蛋白酶的水解时间1 h,最佳水解温度为45℃,pH值8.0。当水解度达到32.28%时,乳清肽具有较强的抗氧化能力。     

欧李仁蛋白多肽的制备

以欧李仁蛋白为底物,采用碱性蛋白酶、中性蛋白酶和酸性蛋白酶进行分步复合酶解,以水解度为指标,确定其分步复合酶解的条件。结果表明,碱性蛋白酶的最适条件为底物质量分数5%,酶添加量为1.5%(基于底物蛋白质的质量),温度50℃,pH值10;中性蛋白酶添加量为5%,温度40℃,pH值7;酸性蛋白酶添加量5%,温度50℃,pH值5。分别水解30 min,经这3种酶酶解后其多肽质量浓度可达27.566 1 mg/mL。     

温度、pH对泥鳅消化酶活力影响的研究

为了研究温度和pH值对泥鳅成鱼肠道和肝胰脏3种消化酶活力的影响。以Folin-酚法、3,5-二硝基水杨酸法及对硝基苯酚法分别测定泥鳅肠道和肝胰脏蛋白酶、淀粉酶及脂肪酶活力。研究发现：泥鳅肠道蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶的最适温度分别为40℃、45℃、35℃;肝胰脏蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶的最适温度分别为30℃、40℃、35℃。泥鳅肠道及肝胰脏蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶的最适pH 7.2。最适温度下,肠道3种消化酶的活力均高于肝胰脏、肠道、肝胰脏A/P值均＞1。建议在泥鳅适宜的养殖水温内,应随着水温的升高适当提高泥鳅的投饵量;泥鳅的食性为偏植食性,对糖类具有较好的利用能力,泥鳅的饵料中可适当增加糖类的比重,既可满足泥鳅的营养需求又节约了饲料成本。     

牡蛎蛋白酶解液对α-葡萄糖苷酶的抑制作用研究

以太平洋牡蛎为原料,研究了牡蛎蛋白酶解液对α-葡萄糖苷酶的抑制作用,以期为新型α-葡萄糖苷酶抑制剂的开发提供基础性研究数据。试验结果表明,胃蛋白酶、胰蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶及Alcalase酶6种蛋白酶解液中,菠萝蛋白酶与Alcalase酶酶解液对α-葡萄糖苷酶的抑制率最高,分别为37.53%和35.59%,与其他处理差异达显著水平(p<0.05)。采用正交试验对这2种酶的酶解条件进行优化,结果显示,菠萝蛋白酶在50℃,pH值6.0,料水比1∶4,加酶量2 400 U/g,酶解时间2 h时对α-葡萄糖苷酶的抑制率最高;Alcalase酶在温度50℃,pH值8.5,料水比1∶4,加酶量1 800 U/g,酶解时间2 h的条件下对α-葡萄糖苷酶的抑制率最高。     

板栗果实酶促褐变相关因素的研究

笔者对板栗中引发褐变的多酚氧化酶,过氧化物酶及多酚类物质进行了提取研究。对板栗中的多酚提取方式采用单因素实验筛选最佳条件;粗提物经聚酰胺柱纯化,使用紫外光谱扫描,高效液相色谱进行鉴定。对板栗中多酚氧化酶以及过氧化物酶进行提取,并对其特性进行研究。结果表明：板栗果实中多酚提取的最佳工艺为：用60%的丙酮溶液采用超声提取法提取60min,提取温度4℃;粗提物经聚酰胺柱分离纯化,光谱扫描和利用高效液相色谱鉴别纯化后可获得两种组分,初步鉴定为黄烷-3-醇组分;多酚氧化酶的最适作用温度为25~30℃,最适作用pH为5.0~6.0;过氧化物酶的最适作用温度为30℃,最适作用pH为4.0。