我国进口种鸡群禽白血病及禽网状内皮组织增生症的血清学检测

为了解河北进口种鸡群禽白血病病毒(ALV)及禽网状内皮组织增生症病毒(REV)的感染情况,对实验室留存的2011—2013年间来自美国、加拿大和法国的15批进口种鸡的血清样品450份,通过ELISA方法进行ALV-A、B亚群和REV的抗体检测。结果共有8批28份样品为ALV-A、B亚群抗体阳性,群体阳性率和个体阳性率分别为53.3%和6.2%;未检出REV抗体阳性样品。结果表明目前我国进口种鸡群中存在一定比例的禽白血病病毒A、B亚群抗体阳性个体。     

双重PCR检测禽源生物制品中禽网状内皮组织增生症病毒和禽白血病病毒

为了快速、准确检测禽源生物制品中的禽网状内皮组织增生症病毒(REV)和禽白血病病毒(ALV),根据GenBank中登录的REV参考毒株LTR基因序列和ALV P27基因序列,设计合成2对特异性引物。在建立各病毒单项PCR检测技术的基础上,优化反应条件,建立2种病毒的双重PCR检测方法。结果:可同时扩增REV的467 bp和ALV的675 bp的特异性片段,而对其他5种禽病病原的PCR扩增结果均为阴性。敏感性测定结果表明,该双重PCR技术能检出10 pg的ALV和10 pg的REV模板。用双重PCR技术与REV的间接免疫荧光法及ALV ELISA对245份疫苗株检测,进行同步比较,结果总符合率为100%。表明建立的双重PCR检测方法,具有特异、快速、准确的特点,对这2种外源病毒的同时检测,显示出了较好的可行性。     

从J亚群禽白血病肿瘤中检测出禽网状内皮组织增生症病毒

将表现为典型 J亚群禽白血病肿瘤的病料分别接种于鸡胚成纤维细胞和 DF1细胞 ,采用间接荧光抗体试验(IFA)和 PCR方法 ,从这些肿瘤病料中分离和鉴定出 8株 J亚群禽白血病病毒 (AL V- J)。对证明感染了 AL V- J的细胞继续培养 ,并用禽网状内皮组织增生症病毒 (REV)的特异性单抗及引物做 IFA和 PCR,在 8株 AL V- J中 ,有 3株AL V- J的感染细胞中同时有 REV感染。由此表明 ,发生肿瘤的肉鸡中 ,AL V- J和 REV的共感染已相当普遍。将这 3株 REV- SD0 0 0 3、SD0 0 0 4和 SD0 10 2的 3′- L TR用 PCR扩增、克隆和序列比较 ,发现分离的 SD0 0 0 3、SD0 0 0 4和SD0 10 2与国内的另外 2株 REV- SD990 1和 HA990 1的同源性为 96 .7%和 96 .1% ;而与另 1株 REV参考株鸭脾坏死性病毒 (SNV)的同源性高达 99%。     

禽网状内皮组织增生症病毒检测方法研究进展

禽网状内皮组织增生症(RE)是危害养禽业的一种重要病毒性肿瘤病。本文概述了禽网状内皮组织增生症病毒(REV)实验室检测方法的研究进展。在细胞生物学方面,主要依靠病毒分离培养、病毒电镜形态检查、病毒特异性抗原及其抗体的检查等。在分子生物学方面,主要依靠国内外相继建立起的PCR、荧光定量PCR、LAMP技术及斑点分子杂交等。介绍和比较了各种方法的优缺点和实用性,为临床兽医科技工作者建立快速、简便、准确、实用的检测方法提供参考。     

禽网状内皮组织增生症病毒检测方法研究进展

禽网状内皮组织增生症（Reticuloendotheliosis,RE）是危害养禽业的一种重要病毒性肿瘤病。本文概述了禽网状内皮组织增生症病毒（REV）实验室检测方法的研究进展。在细胞生物学方面,主要依靠病毒分离培养、病毒电镜形态检查、病毒特异性抗原及其抗体的检查等。在分子生物学方面,主要依靠国内外相继建立起的PCR、荧光定量PCR、LAMP技术及斑点分子杂交等。介绍和比较了各种方法的优缺点和实用性,为临床兽医科技工作者建立快速、简便、准确、实用的检测方法提供参考。     

禽网状内皮组织增生症流行现状及检测技术研究进展

禽网状内皮组织增生症(RE)是禽类一种重要的致瘤性和免疫抑制性疾病。近年来,国内外鸡群中网状内皮组织增生症病毒(REV)流行比较严重;REV与马立克病病毒(MDV)、鸡贫血病病毒(CAV)和J亚群禽白血病病毒(Avianleukosis virus subgroup J,ALV-J)几种免疫抑制性病毒的混合感染在我国部分养鸡场中均普遍存在,使得鸡群处于免疫力低下的状态,导致禽流感、新城疫等重要疫苗免疫失败,并容易造成继发感染,使疫病的诊断和防控难度加大。另外,REV可以整合到MDV和鸡痘病毒(Fowlpox virus,FPV)基因组中,从而导致商品化疫苗受到污染,并可用做将外源基因插入到鸡和哺乳动物细胞内的表达载体;基于REV传统检测方法的基础上,新型的分子生物学检测技术如PCR、实时荧光PCR、LAMP提高了诊断REV的敏感性和特异性。     

禽网状内皮组织增生症病毒研究进展

禽网状内皮组织增生症病毒(Avian reticuloendotheliosis virus, REV)属于反转录病毒科正反转录病毒亚科γ反转录病毒属的一种具有包膜的单股正链RNA病毒。禽感染REV后引发急性网状细胞肿瘤、慢性淋巴肿瘤、矮小综合征等症状,导致鸡群大量死亡或发育不良,严重威胁着我国养禽业的安全。笔者从REV的病原学、流行病学、致病机理与防控方面进行综述,为REV的基础研究及防控提供科学参考。     

应用PCR法检测禽源生物制品中禽网状内皮组织增生症病毒

为了快速、准确检测禽源生物制品中的禽网状内皮组织增生症病毒,根据GenBank中登录的REV参考毒株LTR基因序列,利用Primer Premier5.0软件设计合成了1对特异性引物,其扩增产物长度为314bp,建立了PCR法。经与间接免疫荧光法进行同步比较试验,发现结果吻合性较高,而且PCR法的结果更为直观,易于判断,样品保存方便,重检也方便,当日即可完成,显示出了较好的可行性。     

四川部分鸡场禽网状内皮组织增生症病毒感染情况调查

对四川部分鸡场禽网状内皮组织增生症病毒(REV)感染情况进行调查,为鸡群REV净化和防控提供依据。采用文献报道的PCR方法,分别对来自四川新津、温江、眉山、大邑、崇州和德阳等地6个肉种鸡群共160只外表健康鸡或生长发育不良、具有腺胃炎症状的鸡只样本进行PCR检测,同时将扩增片段克隆测序以确定其正确性。结果表明,6个鸡群REV群体阳性率均为100%(6/6),其中外表健康鸡REV检出率为65.8%(79/120),患腺胃炎病鸡REV检出率为82.5%(33/40);同一只鸡不同组织器官样本的检测结果显示,REV在骨髓和法氏囊中的检出率最高,分别为30%(36/120)和28.3%(34/120),提示骨髓和法氏囊是REV检测的主要靶器官;患腺胃炎鸡的腺胃中REV检出率达25%(10/40),而外表健康鸡腺胃样本REV阳性率仅0.8%(1/120),表明REV是导致鸡腺胃炎的重要病原之一。     

四川省禽白血病和网状内皮增殖症的流行病学调查及防治

采用自行建立的荧光定量PCR对四川省83个鸡场245份临床组织样本中网状内皮增殖症病毒(REV)和禽白血病病毒(ALV)进行了流行病学调查,结果显示REV和ALV的群体阳性率和个体阳性率分别为59.0%、71.0%、86.7%和50.8%,80日龄以下病鸡群REV和ALV的阳性率分别为95.9%和85.9%,REV和ALV的二重感染率为22.9%,表明四川省鸡群中RE和AL普遍存在,是鸡群病因复杂多样,损失严重的重要原因。采用免疫增强剂——黄芪多糖(APS)对部分确诊病例进行治疗和对污染场新引进鸡群进行预防试验,结果表明黄芪多糖对RE和AL有良好的防治效果。     

进口白羽肉种鸡禽白血病疫情鉴定

2018年以来,某进口品种肉种鸡发生疑似禽白血病病例,流行范围广,危害严重,为确定该次疫情的病原,本研究从辽宁、山东等地发病鸡场采集55份疑似禽白血病病料样品。病理组织切片观察显示,病料样品肝脏和脾脏均有髓细胞样肿瘤细胞增生。针对禽白血病病毒(ALV)、鸡马立克氏病病毒(MDV)和网状内皮组织增生症病毒(REV)的特异性PCR检测结果显示,55份病料样品中ALV阳性样品12份(21.8%),MDV阳性样品1份(1.82%),REV均为阴性。将12份ALV阳性病料样品经处理后接种DF-1细胞进行病毒分离,ELISA检测结果显示有8份ALV群特异性抗原阳性。ALV多重PCR检测结果表明,8个分离株均为J亚群ALV(ALV-J),测序结果显示,8个分离株之间核苷酸序列同源性为99.5%~100%,与A、B、C、D、E亚群ALV的同源性仅为56.5%~58.8%,与ALV-J的同源性为90.7%~96.6%,进一步表明所有分离株均为ALV-J。上述结果表明,引起该次进口白羽父母代肉种鸡发生禽白血病的病原主要以ALV-J为主,该研究结果为疫情的溯源和有效防控奠定了基础。     

禽白血病p27抗原检测阳性与病毒分离的相关性比较

本试验以80只300日龄的A品系蛋鸡为试验对象,分5个日龄段按翅号采集蛋清、泄殖腔棉拭子,无菌抗凝血和血清.用ALV p27抗原检测试剂盒检测蛋清和泄殖腔棉拭子.将无菌抗凝血分离血浆接种DF-1细胞,培养一周后用同样方法检测上清收集液,分析该群鸡只在不同日龄段泄殖腔棉拭子阳性、蛋清样本阳性和病毒分离阳性之间的相关性.用ALV-Ab抗体试剂盒检测各日龄段血清的抗体水平.此外,选取某一日龄段蛋清和泄殖腔拭子样本用4个不同厂家的ALV p27抗原检测试剂盒进行检测比较.结果表明,5个日龄段泄殖腔棉拭子平均阳性率为61％,蛋清样本平均阳性率为72.6％,病毒分离平均阳性率为48.8％.5个日龄段ALV的抗体阳性率一直为零;4个厂家的ELISA试剂盒对同一批样本的检测结果表明,IDEXX试剂盒的敏感度最高.本试验为外源性鸡白血病病毒检测及鸡白血病净化其方法的应用、试剂盒的选择、减少判定的误差、提高净化效果提供了一定的科学依据.     

种鸡场鸡白血病净化的研究(Ⅱ)——鸡白血病病毒ELISA检测抗体包被稳定剂的研究

本研究应用双抗体夹心酶联免疫吸附试验 (DAS- EL ISA) ,对吸附在酶标板上的抗体 (兔抗禽白血病病毒群特异性抗原的 Ig G)通过 4种稳定剂处理之后 ,置于 4～ 8℃、室温 (18～ 2 3℃ )、37℃条件下 ,存放 11天、19天 ,结果发现 :利用 DAS-EL ISA检测同一 AL V阳性蛋清样品 ,测定 OD值大小不同。选择合适的稳定剂处理酶标板 ,在 4～ 8℃条件下保存半年 ,对吸附在酶标板上抗体活性进行探讨 ,其中以山梨醇和 PVP为代表的两种稳定剂效果良好 ,和常规包被抗体 (4～ 8℃隔夜 )所测结果差异不明显     

进口白羽肉种鸡J亚群禽白血病病毒的全基因组序列分析

为研究引起我国部分地区进口白羽肉种鸡发生禽白血病疫情的病毒来源及其变异趋势,本研究对从进口白羽肉种鸡分离的8株J亚群禽白血病病毒(ALV-J)的全基因组序列进行测序分析。8株ALV-Jgp85氨基酸遗传演化分析显示,其与ALV-J肉鸡分离株(包括ALV-J原型病毒株HPRS-103、美国肉鸡ALV-J分离株、国内肉鸡分离株)及蛋鸡分离株氨基酸序列同源性均低于92.5%,而与国内2014年父母代白羽肉种鸡ALV-J分离株GD14J2同源性较高,为93.5%~95.1%,处于同一分支。8株ALV-J的3'非编码区(3'UTR)在rTM区缺失203bp,DR-1区缺失7bp,E元件位置缺失125bp,仅保留了22个碱基,这一缺失特征与GD14J2一致。8株ALV-J的3'LTRU3区序列与ALV-J肉鸡分离株及蛋鸡分离株的相应基因序列同源性均低于91.5%,而与GD14J2病毒株的同源性较高,为94.3%~96.3%。序列分析发现U3区存在连续11bp缺失和164位碱基突变(C/T),该突变形成2个新的转录调控元件AIBREP1、AIBREP2。综合gp85、3'UTR和U3区序列特征,推测引起本次进口白羽肉种鸡禽白血病的ALV-J与国内2014年父母代白羽肉种鸡ALV-J分离株GD14J2为同一来源。但本次分离到的ALV-J病毒株也有新的变异趋势,这些变异是否与ALV-J致病性相关,还需进一步研究。本研究为ALV-J有效防控和净化提供数据支持。     

商品代肉鸡J亚群禽白血病的病理及病毒分离鉴定

通过对山东某肉鸡养殖场发病的商品肉鸡组织病理学检查和将病料接种鸡胚成纤维细胞 (CEF) ,我们在国内首次从商品代肉鸡中分离到了 J亚群禽白血病病毒 (AL V- J)。从组织切片中可以看到肝脏、脾脏等器官的髓细胞瘤细胞 ,呈散在或成簇 ,髓细胞瘤细胞的细胞质内显现嗜酸性颗粒。用抗 AL V- J囊膜糖蛋白的单克隆抗体进行的 IFA中 ,病料接种 CEF后进行的 IFA呈现强阳性     

湖北省禽白血病自然病例的病理学诊断及p53和Bcl-2基因表达情况的观察

应用组织病理学和SABC免疫组织化学技术,对湖北省武汉市的2批14日龄和33日龄疑似禽白血病肉鸡进行了病理学诊断,并观察了病鸡肝肿瘤组织中p53基因和Bcl-2基因的表达情况。剖检可见病鸡肝、肾、脾均不同程度肿胀,组织病理学检查在肝、肾、心等脏器可见散在或聚集成团的骨髓瘤细胞,胞浆内充满球形的嗜酸性颗粒;在病鸡肝肿瘤组织中p53和Bcl-2基因均呈阳性表达,诊断为J亚群禽白血病（ALV-J）,提示p53基因和Bcl-2基因与肉鸡J亚群禽白血病有关。     

J亚群禽白血病毒gp85基因克隆表达与初步应用

在本实验室分离鉴定J亚群禽白血病病毒的基础上,用PCR方法扩增gp85基因,长度为921 bp的DNA片段,与J亚群禽白血病标准毒株序列比对同源率为96.4%。将该片段连接到pET28a表达载体上,构建了重组表达质粒pET28a-S1-Jgp85,对质粒测序后分析后,转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达,经SDS-PAGE分析,表达出约为40 kD的融合蛋白。Western blot结果表明,表达产物可以与ALV-J阳性血清发生特异性反应。以纯化的His-Jgp85重组蛋白为包被抗原,建立间接ELISA方法,用于J亚群禽白血病的临床诊断。本研究对抗原包被浓度,待检血清稀释浓度,酶标抗体浓度,特异性试验及临界值等条件进行优化,对优化后的ELISA检测方法进行了临床应用试验。本研究建立了能特异性检测J亚群禽白血病血清抗体的ELISA方法。     

2009年我国部分地区禽白血病分子流行病学调查

为了解自2009年年初以来国内一些地区禽白血病流行情况及流行毒株的分子特征,我们从湖北、黑龙江、山东、辽宁、吉林、广东、宁夏、安徽8个省区39个鸡场采集疑似禽白血病病料样品178份,用ALV-A、ALV-B和ALV-J特异性引物,通过PCR方法进行检测。结果表明,8个省的35个鸡场的124份病料中检出了ALV-J(69.7%);25份病料中检出了ALV-A(13.9%);7份病料中检出了ALV-B(3.9%)。14个分离毒株env基因氨基酸同源性为84.3%～99%;与J亚群原型毒株HPRS-103的氨基酸序列同源性为87.3%～98.2%;与其它J亚群env基因氨基酸序列同源性为83%～97.4%。遗传进化分析表明,14个ALV-J分离株分别分属于不同的分支。其中,LJL09DH02分离株与其它分离株及参考毒株的的亲缘关系最远,与HPRS-103的氨基酸同源性仅为87.3%。另外4个分离株的env基因与HPRS-103的氨基酸同源性低于93%,其余9株与HPRS-103的同源性较高(96.6%以上)。该调查结果表明,我国目前ALV的感染主要以J亚群为主,ALV-A和B同时存在。     

地方品种HR土鸡不同亚型禽白血病病毒的共感染

为研究HR土鸡中存在的不同亚型禽白血病病毒(ALV)共感染的情况,本实验分别采集46只HR土公鸡的泄殖腔棉拭子和455枚鸡蛋卵白样品,采用ELISA试剂盒检测p27抗原;并采用相应的ELISA试剂盒分别检测卵黄中J亚型ALV(ALV-J)和AB亚型ALV(ALV-AB)抗体。结果表明:HR土公鸡泄殖腔棉拭子样品中p27检出阳性率为87%(40/46),卵白检出率为74.7%(340/455);而卵黄中ALV-J和ALV-AB抗体阳性率分别为0(0/30)和80%(24/30)。无菌采集初步筛选p27抗原检测为阳性的5只HR土公鸡的抗凝血接种CEF,采用抗ALV-J和ALV-A的单克隆抗体进行IFA检测,结果显示5份样品中ALV-A和ALV-J的阳性率均为100%(5/5)。同时选取HR土鸡分离株HR332进行PCR扩增鉴定,结果表明分离株HR332存在ALV-J(HR332J)和ALV-A(HR332A)。其中,HR332J与11株ALV-J国内外参考株的同源性为92.4%～97.9%;HR332A与ALV-A参考株RSA-A、MQNCSU的同源性分别为90.1%和89.7%,与国内分离株SDAU09E2的同源性为99.0%。本研究显示,地方品种HR土鸡存在不同亚型ALV共感染,同时ALV-A和ALV-J共感染同一个鸡的现象已经存在。     

上海地区商品代蛋鸡J亚群禽白血病的病理学观察

对上海地区2个规模化商品蛋鸡场疑似禽白血病病例进行了组织病理学观察和ELISA检测，发现发病鸡群中血管瘤占50％，纤维肉瘤占37．5％，髓细胞瘤占12．59／5，J亚群禽白血病的血清抗体阳性率分别达25％和15％。血管瘤主要见于脚部和翅膀，组织病理学观察表明为海绵状血管瘤，纤维肉瘤主要见于肌肉组织内，对弥漫性肝、脾肿大的病例观察表明肿瘤组织为髓细胞瘤。证实该鸡群感染了J亚群禽白血病病毒，并表现为以髓细胞瘤、血管瘤和纤维肉瘤为主的多种肿瘤性传染病。