转青蒿反义鲨烯合酶基因对烟草鲨烯合酶基因表达的影响

利用反义技术，通过根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导，将青蒿（Artemisia annua）的反义鲨烯合酶基因导入烟草（Nicotiana tabacum）株系W38中，存转基因烟草中，鲨烯合酶的表达成功地得到抑制，其mRNA的水平降低。对鲨烯合酶的下游产物之一胆同醇的检测显示，转基因烟草的胆固醇含量低于对照，同时以法呢基焦磷酸为前体的二萜支路产物之一的GA，含量得到提高。实验结果表明，反义抑制烟草鲨烯合酶可以降低植物甾醇的生物合成，并促进类异戊二烯途径中以法呢基焦磷酸为前体的其它代谢支路的生物合成。     

大豆叶绿体转化载体pJY系列的构建及其在烟草上的转化研究

为解决杂交大豆(Glycinemax)制种过程中不育系易与保持系混杂的问题,开展了大豆叶绿体转基因的研究。通过转基因方法在不育系的细胞质中植入筛选标记基因,以区分不育系和保持系。根据已发表的大豆叶绿体序列(GenBankX07675)设计引物,用PCR方法获得两段大豆叶绿体同源重组序列LHRR和RHRR,克隆到质粒pUC19中,并将来源于质粒pTF102的壮观霉素抗性基因aadA克隆到两段同源重组序列之间,以构建大豆叶绿体转化表达载体pJY01。aadA基因的启动子Prrn和终止子psbA基因3′序列,分别从烟草叶绿体基因组中扩增而来。在此基础上,将草丁膦抗性基因或绿色荧光蛋白与GUS的融合蛋白基因克隆到该载体上,得到pJY03与pJY04,并初步应用于烟草(Nicotianatobacum)的叶绿体转化,获得了具壮观霉素抗性的绿色愈伤和幼苗,PCR扩增出aadA基因的条带,并在激光共聚焦扫描下检测到GFP的表达。     

海藻糖合酶基因的克隆及转化甘蔗的研究

从提子菌灰树花的菌丝体中提取总ＲＮＡ,并纯化出ｍＲＮＡ,经ＲＴ－ＰＣＲ扩增得到一长约２．２ｋｂ的片段,经测序,其全长２１９９ｂｐ,包括起始密码和终止密码;随后将此片段插入植物表达载体ｐＢＩ１２１的３５Ｓ启动子和ＮＯＳ终止子之间,构建了一植物表达载体（ｐＢＴ）,又将此片段加上ｕｂｉ－Ｌ启动子和ＮＯＳ终止子构建了另一植物表达载体（ｐＵＢＴ）,然后通过基因枪法分别用植物表达载体ｐＢＴ和ｐＵＢＴ转化甘蔗,     

GFP叶绿体转化烟草茎叶降解对土壤微生物数量及土壤酶活性的影响

以GFP叶绿体转基因烟草及对照烟草（非转基因烟草）为材料,在实验室条件下研究了叶绿体转基因烟草及对照烟草（非转基因烟草）在茎叶降解过程中及完全降解后对土壤微生物主要类群（细菌、真菌、放线菌）的影响,并对相关的土壤酶活性进行了分析。结果表明,在烟草茎叶降解过程中及完全降解后：（1）叶绿体转基因烟草及对照烟草（非转基因烟草）对微生物的数量影响不显著;（2）土壤微生物总量相比为细菌〉放线菌〉真菌;（3）叶绿体转基因烟草茎叶降解对土壤酶活性没有显著影响;（4）GFP基因没有水平转移到土壤微生物基因组中。以上结果显示GFP叶绿体转化烟草茎叶降解对土壤微生物数量及土壤酶活性没有显著的影响。     

叶绿体转化及其应用于作物改良研究的最新进展

农杆菌介导的核基因转化技术已普遍应用于作物改良和分子育种方面,而其不可避免的转基因沉默现象和生物安全问题是科研工作者和广大民众关注的焦点,进而成为基因工程技术广泛应用的主要限制因素。叶绿体遗传转化技术因具有核转化不可比拟的独特优势,成为植物基因工程发展的新方向和科研工作者研究的热点之一,通过该技术有望培育出真正生物安全的转基因作物新品种。本文围绕叶绿体转化的原理、方法、筛选标记及其应用等方面进行阐述,着重介绍其在作物改良方面研究的最新进展,并对存在问题及应用前景进行了展望。     

叶绿体转化及其用于疫苗表达研究的最新进展

随着植物转基因研究的不断深入,核基因组转化的转基因沉默现象严重影响了基因工程的应用效果.植物叶绿体遗传转化以叶绿体基因组为平台对植物进行遗传操作,外源基因定点整合及母性遗传特性能较好地解决＂顺式失活＂和＂位置效应＂等类的基因沉默问题和转基因逃逸等安全问题,成为植物基因工程发展的新方向,在工业、农业及医药生物领域发挥了重要作用,也为生产廉价、安全的植物疫苗提供了新思路.本文在简要介绍叶绿体转化的原理、转化方法与优势的基础上,重点综述了近年来通过该技术表达的一些重要的病毒抗原和细菌抗原.最后,对叶绿体转化技术在表达外源基因方面存在的问题进行分析.未来随着叶绿体基因表达、调控机制研究的逐渐深入及相关技术体系的日臻完善,叶绿体转化有望成为疫苗生产的生力军.     

苹果MxNas1基因正反义表达载体构建及转化烟草的研究

为研究笔者前期克隆的MxNas1基因功能,构建了苹果属植物小金海棠MxNas1基因正义和反义两种表达载体,并用农杆菌介导的叶盘转化法转化了烟草.对转基因烟草分别进行0和1μmol/L Fe处理14d后,转正义载体烟草在缺Fe情况下叶片没有黄化,表现出较强的抗缺Fe能力;转反义载体植株比对照烟草幼叶提前出现黄化现象,表现...     

Pt-mVirD2-GUS质体蛋白编码基因的合成及转化烟草的研究

将拟南芥冷调节基因AtCor15A的质体定位信号肽编码序列、丧失了核定位信号序列的根癌农杆菌VirD2基因突变序列mVirD2和GUS基因序列,拼接成pt-mVirD2-GUS嵌合基因,由CaMV 35S启动子和Tons终止子控制,并经根癌农杆菌介导,成功导入了烟草基因组.     

芪合酶基因转化小白菜的研究*

利用质粒pBin438构建了含有NPT Ⅱ基因和葡萄芪合酶(RS)基因的芪合酶组成型植物表达载体EHA105/pBinRS。用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法将RS基因导入纯合系小白菜(Brassica campestris ssp. chinensis)品种中，经Kan抗性筛选、PCR及RT-PCR检测，RS基因已整合到小白菜基因组中并得到了表达，共获得了7株转基因植株。     

PchsA驱动的烟草orf25基因表达载体构建及遗传转化

为研究orf25基因的功能及其与烟草雄性不育性的相关性,通过PCR方法从质粒p UC57-Pchs A中扩增了花特异性启动子Pchs A,并以其取代植物表达载体p BI121中的组成型启动子Ca MV35S,然后将orf25基因插入到Pchs A启动子下游,构建由Pchs A启动子驱动的orf25基因表达载体,测序结果显示植物表达载体p BI121-Pchs A-orf25构建成功。将该表达载体导入根癌农杆菌LBA4404中,采用根癌农杆菌介导法遗传转化雄性不育烟草MS革新3号,共获得76株转基因烟草植株,经PCR鉴定,转基因阳性植株为18株,转化率为23.7%。研究结果证明目的基因orf25已整合到烟草基因组中,为进一步探究该基因的功能及其与烟草雄性不育性的关系奠定了基础。     

在烟草中表达拟南芥GAI基因获得矮化的烟草植株

赤霉素（GA）能控制植物茎的伸长，从而决定植物的高度（Schomburg et al．，2003）。一些植物的矮化突变体是由于体内GA缺陷、GA不敏感引起的（Ross et al.，1997）。因此，改变植物体内GA的浓度和对GA的敏感性都可能改变植物的高度，获得矮化植株。GAI是一个在拟南芥中发现的GA应答的负调控因子，过量表达引起植株矮化（Peng et al．,1997．Fu et al．，2001）。本研究克隆了拟南芥GAI基因，在烟草中表达获得了矮化的烟草植株。     

转柽柳金属硫蛋白基因（MT1）烟草的获得及对重金属镉的抗性分析

将柽柳（Tamarix. sp）金属硫蛋白基因（MT1）插入到植物表达载体pBI121，利用农杆菌（Agrobactrium tumefaciens）介导法将MT1导入烟草基因组。对转基因T1植株的卡那霉素抗性分析表明，多数转基因植株后代表现为3:1的分离比例，只有少数转基因植株的抗性分离表现为15:1或不符合孟德尔遗传的分离比例。说明整合到烟草基因组的外源基因多为单拷贝基因，也有少数为多拷贝基因。对具有卡那霉素抗性的转基因植株进行PCR-Southern检测和Northern杂交分析表明，外源MT1基因已整合到烟草基因组，并且得到了正确表达。转基因植株对重金属镉的抗性比对照显著提高，表现为转基因植株的株高和鲜重均明显优于非转基因株系。     

抗青枯病转群体感应猝灭基因烟草的培育

利用具有猝灭青枯菌群体感应信号分子功能的aac基因构建高效植物表达载体,通过农杆菌介导的方法转化烟草,获得了卡那霉素抗性植株57株。经PCR及RT-PCR检测,筛选得到30株阳性转基因再生苗,并证实了目的基因已经整合到烟草基因组中,且在转录水平上得到表达。转基因植株苗期抗青枯病试验表明,16天后转基因烟草较对照植株病情指数降低了51,相对病情指数为56.5％。     

烟草染色体倍性快速鉴定方法

摘要: 对两个杂交组合(G28 × NC2326和K326 × Coker176) F1烟草 (Nicotiana tabacum) 花药培养诱导出763个不同倍性植株。基于植株的花和种子结实率常规鉴定倍性水平比较，用气孔保卫细胞叶绿体数目预测植株倍性准确率达93.52%。表明采用气孔保卫细胞叶绿体计数法可以在苗期快速、准确地确定植株染色体倍性。同时, 在移栽前间接地鉴定、筛选出叶绿体数<14的单倍体苗，作进一步秋水仙碱加倍处理，以减少对单倍体材料的浪费，加快DH群体构建速度。     

苹果sMdCAX1基因超表达载体的构建及遗传转化

为使sMdCAX1基因能在苹果中高效表达,改善苹果对Ca~(2+)吸收转运的能力,本研究构建了sMdCAX1植物超表达载体并将其通过农杆菌介导法转入长富6号苹果中。根据MdCAX1基因序列设计引物,从长富6号中克隆MdCAX1基因,通过PCR方法截除编码MdCAX1基因的N末端序列,获得sMdCAX1片段。利用重叠PCR方法将sMdCAX1序列中的SacI位点进行定点突变,并在序列两端分别添加BamHI和SacI酶切位点,获得长度为1272bp的突变序列sMd1+2Mu。利用BamHI和SacI双酶切sMd1+2Mu和植物表达载体pYH4215,目的片段经回收、连接、转化和筛选,获得植物双元表达载体pYH4215-sMd1,并将该载体转化农杆菌菌株EHA105。以长富6号无菌试管苗叶片为受体,进行遗传转化获得了转基因植株,经鉴定,有6个株系呈GUS染色阳性,其中2个株系呈PCR阳性。进一步对PCR鉴定阳性的株系进行RT-PCR分析,表明sMdCAX1基因在这2个株系中得到表达。本试验结果为进一步研究苹果MdCAX1基因的功能和通过转基因方法提高苹果果实钙含量奠定了基础。     

根癌农杆菌介导的转录因子DREB1A基因在地被菊花中的遗传转化

以地被菊花（Dendranthema grandiflomm cv．White Snow）无菌苗叶片为外植体，在附加不同浓度植物生长调节剂的MS基础培养基上诱导培养，通过器官直接发生途径获得再生植株。结果表明，2．0mg/L 6-BA和0．2mg/L NAA组合可获得93．8％的再生芽。将含拟南芥（Arabidopsis thaliana）逆境诱导转录因子DREB1A基因的植物表达载体pBI-DREB1A导入根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）LBA4404，农杆菌介导法遗传转化地被菊花White Snow叶盘，经PCR和PCR—Southem检测，DREB1A基因已整合到转化植株的基因组中。遗传转化过程中，预培养2d后，将OD600=0．5～0．7的根癌农杆菌稀释30倍后侵染叶盘10min，再共培养2d，有利于获得最高遗传转化效率。