恒山黄芪毛状根遗传转化体系的建立及活性成分含量测定

以恒山黄芪叶片为试材，采用发根农杆菌侵染诱导产生毛状根的方法，研究了不同菌株对恒山黄芪叶片诱导毛状根的能力和恒山黄芪毛状根的遗传转化体系，包括恒山黄芪不同外植体、菌液浓度、共培养时间、抗生素类型和浓度、乙酰丁香酮浓度对毛状根诱导率的影响，并测定规模培养的毛状根中总黄酮和总皂苷的含量，建立稳定的恒山黄芪毛状根体系，以期为进一步建立积累活性成分的恒山黄芪毛状根液体培养体系提供参考依据。结果表明：以OD₆₀₀=0.6的发根农杆菌LBA9402为菌种，侵染恒山黄芪叶片30 min,转入含100μmol·L^-1乙酰丁香酮1/2MS培养基中共培养3 d,在含500 mg·L^-1头孢克肟的筛选培养基上对于恒山黄芪叶的诱导能力最好，毛状根诱导率达54.1%,经PCR扩增鉴定，发根农杆菌LBA9402的发根基因整合到了恒山黄芪叶的基因组中。恒山黄芪毛状根在液体培养扩增后，总黄酮和总皂苷含量均明显提高，分别是自然根中含量的1.72倍和2.31倍。     

龙葵毛状根诱导条件的研究

以发根农杆菌A4、C58C1和A1476为诱导菌株,探讨外植体类型、发根农杆菌种类、侵染时间、预培养时间、菌液浓度和共培养天数对龙葵毛状根诱导率的影响。结果表明:外植体以叶片诱导率最高;发根农杆菌A4、C58C1和A1476侵染龙葵叶片均能诱导出毛状根,C58C1诱导率较高;较佳侵染时间为5min;发根农杆菌浓度在OD600=0.6时诱导效果较好;预培养和共培养时间均为2d时诱导率较高。该试验为大量生产毛状根,并利用毛状根培养技术生产药物龙葵碱提供了试验基础。     

发根农杆菌诱导毛酸浆毛状根条件的优化

以4种发根农杆菌A4、C58C1、R1601、ATCC15834为诱导菌株侵染毛酸浆叶片、茎段,研究了发根农杆菌种类、外植体类型、不同预培养时间、不同侵染时间、不同共培养时间和乙酰丁香酮对毛酸浆毛状根诱导率的影响,并用PCR检测rolB基因。结果表明:4种发根农杆菌均能诱导毛酸浆外植体产生毛状根,ATCC15834的诱导率相对较高,叶片优于茎段;最佳侵染时间为6~8min;预培养和共培养时间均为2~3d时诱导率较高;乙酰丁香酮(AS)浓度为100μmol·L~(-1)有利于促进毛状根的产生,经PCR检测证明,rolB基因已整合到毛酸浆毛状根基因组中。     

发根农杆菌介导山定子遗传转化及发根再生植株

为了提高山定子的生根能力,用发根农杆菌转化山定子,诱导产生发根,并由发根诱导出再生植株。通过对不同发根农杆菌株系、培养基、共培养时间以及添加乙酰丁香酮（AS）的研究,优化了发根农杆菌转化体系。当用添加AS（100μmol﹒L-1）的菌液侵染植株切段30 min,共培养3 d,在无植物生长调节剂的固体1/4MS培养基上诱导产生发根时,发根诱导率最高,达到88.89%。将发根根段在MS+BA 2.0 mg﹒L-1 +IBA 0.1 mg﹒L-1+GA3 0.1 mg﹒L-1的再生培养基上,通过愈伤组织的诱导得到再生植株,再生率3%。     

根癌农杆菌介导寒富苹果转化体系的建立

以寒富苹果组培苗叶片为外植体,利用植物表达载体上含潮霉素抗性基因的根癌农杆菌EHA105(pCAMBI-A1301)和含卡那霉素抗性基因的根癌农杆菌EHA105(pCAMBIA2301)对影响寒富遗传转化效率的因素进行系统研究。结果表明,寒富叶片对潮霉素反应敏感,在附加潮霉素的培养基上寒富叶片褐化较为严重。潮霉素和卡那霉素适宜的筛选质量浓度分别为4 mg.L-1和25 mg.L-1。农杆菌介导寒富苹果转化体系的建立以MS+TDZ 2.0 mg.L-1+NAA 0.5 mg.L-1培养基为叶片离体再生芽培养基。适宜的转化条件为:菌液浓度D 600nm=0.5、叶片外植体在菌液浸泡8 min、共培养时间为3～4 d、推迟4 d进行筛选培养。抗性基因对转化效率具有明显的影响,EHA105(pCAMBIA2301)的平均抗性芽再生率(0.96%)比EHA105(pCAMBIA1301)的平均抗性芽再生率(0.58%)高出几乎50%,EHA105(pCAMBIA2301)的抗性芽再生率最高达1.87%。GUS组织化学染色和PCR鉴定结果表明本研究获得了寒富苹果转基因植株。     

发根农杆菌介导的荔枝LcMYB1转化烟草叶片的研究

利用荔枝果皮花青苷生物合成的关键调节基因LcMYB1为标记,构建植物表达载体pBA002-LcMYB1,电转法转入发根农杆菌A4菌株,通过叶盘法转化烟草K326。结果表明,烟草叶片侵染一周后长出白色的毛状根,约3周后部分毛状根逐渐变成红色,毛状根诱导率为100%,红色毛状根诱导率为19.9%。当筛选培养基中添加5 mg ? L-1 Basta,毛状根诱导率降低为33.3%,但红色毛状根诱导率提高到75%。高效液相色谱分析表明,红色毛状根中积累矢车菊素–3–葡萄糖苷和矢车菊素–3–芸香糖苷,PCR检测证实红色毛状根是由LcMYB1的转入引起的。实时荧光定量PCR表明转LcMYB1可以诱导烟草毛状根中花青苷生物合成相关的结构基因和调节基因表达。     

长寿花组培快繁体系的建立

以长寿花愈伤组织为外植体,研究了不同激素(6-BA和IBA)浓度配比对长寿花丛生芽诱导以及添加不同浓度NAA对其生根培养的影响。结果表明:长寿花丛生芽诱导增殖的最适培养基为MS+6-BA 1.0mg·L-1+IBA 0.4mg·L-1,诱导率为288.7%;最适生根诱导培养基为1/2MS+NAA 0.3mg·L-1,生根率为63.3%;长寿花生根组培苗成活率较高为97%。     

魔芋组培快繁的影响因素

以万源花魔芋顶芽、球茎为外植体,比较不同激素浓度配比对外植体培养的影响,并进一步诱导试管微型芋。结果表明：顶芽是魔芋组培快繁的最佳外植体,腋芽产生频率高、速度快,较球茎分化不定芽的时间提早60 d左右|腋芽分化适宜培养基是MS + BA 2.4 mg?L-1 + NAA 0.1 mg?L-1,腋芽分化率90%|在增殖培养基中腋芽增殖系数达3.58|腋芽在MS + BA 0.5 mg?L-1 + NAA 0.01 mg?L-1 + 蔗糖50 g?L-1培养基中诱导形成微型芋,培养60 d的诱导率达90.9%。     

油点花的组织培养与快速繁殖

以油点花Ledebouria socialis(Baker)Jessop的叶片、叶柄和假鳞茎为外植体,经表面消毒处理,接种于不同激素配比的MS培养基中,探讨油点花外植体诱导愈伤组织、丛生芽、不定根培养的最适培养基和培养条件,以获得大量种苗,为其人工种植及商业化水平发展提供参考依据。结果表明:不同外植体均能诱导愈伤组织的产生,且叶片外植体最易诱导;适合油点花愈伤组织诱导的最适培养基为MS+6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1,诱导率为96.3%~98.8%;而MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1适宜于芽诱导培养,诱导率为91.1%;培养基MS+NAA 0.2 mg·L-1适宜生根及壮苗培养,生根率89.5%;练苗移栽,其平均成活率达86.7%以上。     

大丽花‘费罗加’组织培养和块根诱导

以大丽花品种‘费罗加’为试材,茎段作为外植体,探讨了不同基本培养基、激素组合、蔗糖浓度、光照时间等对诱导愈伤组织、不定芽、不定根和块根的影响,以期缩短块根生产周期。结果表明:初代培养在MS+6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+琼脂6 g·L-1上愈伤组织诱导率为54.9%,褐化率为44.8%,污染率为26.6%,成活率达69.6%。继代增殖培养最佳培养基为MS+6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.01 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+琼脂6 g·L-1,增殖系数为7.8,愈伤组织诱导率22.9%。生根最佳培养基为WPM+NAA 1.0 mg·L-1+6-BA 0.1 mg·L-1+蔗糖60 g·L-1+琼脂6 g·L-1+炭粉2 g·L-1,最适宜光照时间为6 h,生根率为98.5%,根系密集健壮。块根诱导最适材料为带根瓶苗,出现初步形态的块根,形成块根率达56.8%。     

华东葡萄白河-35-1器官离体再生体系建立的研究

以华东葡萄株系白河-35-1(Vitis pseudoreticulata clone Baihe-35-1)的茎段和叶片为材料,通过器官发生途径研究了不同激素及浓度处理组合对华东葡萄白河-35-1无菌苗茎段和叶片诱导不定芽的影响。结果表明,通过调整不同的激素浓度组合和选择不同的外植体可以成功诱导出不定芽。较低的激素浓度组合有利于外植体不定芽的再生。所选用的外植体中,茎段比叶片更易诱导出不定芽。诱导出不定芽的最适激素组合为TDZ1mg·L-1+NAA0.05mg·L-1,其中茎段不定芽诱导率为12.8%,叶片不定芽的诱导率为3.3%。将不定芽置于MS基本培养基+0.2mg·L-1IBA培养基上培养,获得了完整植株。     

黄瓜‘中国龙’毛状根诱导体系的建立

黄瓜是全球范围内重要的经济作物。建立黄瓜基因组测序品种‘中国龙’的毛状根诱导体系,可为今后分析黄瓜基因功能、挖掘黄瓜优良基因提供技术支撑。本文以‘中国龙’为材料,从种子表面灭菌方法、发根农杆菌的侵染浓度和共培养时间3方面,研究发根农杆菌菌株K599对‘中国龙’毛状根诱导的情况。结果表明,75%(φ)的乙醇先处理种子30 s,再用5%的次氯酸钠灭菌5~10 min的种子消毒方法,农杆菌菌液OD_(600)值在1.2左右时进行侵染,共培养2天,是获得‘中国龙’毛状根的适宜组合方法。PCR扩增结果证实,经这样诱导出的黄瓜毛状根中,发根农杆菌Ri质粒的rol C基因已在黄瓜毛状根基因组中整合并得到表达。试验探索出了一套适合‘中国龙’毛状根诱导的方法。     

''''翠妃''''苦瓜子叶不定芽诱导研究

以'翠妃'苦瓜的子叶作为外植体,研究了子叶苗龄、子叶的部位、暗培养、硝酸银浓度等影响子叶不定芽诱导的主要因素.结果表明:以9 d左右的苗龄诱导不定芽效果最好,适合不定芽诱导培养基是MS BA 1.0 mg·L-1 NAA 0.2 mg·L-1;子叶不同部位不定芽的再生率差异显著,在子叶基端外植体临近下胚轴的部位诱导效果最好,不定芽诱导率为54.21%;暗培养对子叶不定芽诱导有显著的促进效果,暗培养7 d可将不定芽再生率提高到77.44%;AgNO3对不定芽再生有明显的抑制作用,当浓度达到6 mg·L-1以上时,子叶块上就没有不定芽再生,只长有少量的根;不定芽在MS BA 0.5 mg·L-1 NAA0.1 mg·L-1上增值效果较好,增值倍数为5.40.     

萝卜遗传转化体系的建立

系统研究了影响根癌农杆菌介导的萝卜(Raphanus sativus L.)遗传转化的若干因素,建立了萝卜遗传转化体系:即切取萝卜带柄子叶外植体,先进行2 d预培养,用OD600为0.3~0.5的EHA105农杆菌菌液侵染5~7 min后,再进行5 d共培养,然后将外植体转接到MS+6-BA 6 mg.L-1+NAA 0.05 mg.L-1+Cef 500 mg.L-1的培养基上进行7 d延迟筛选,再将外植体转接到MS+6-BA 6 mg.L-1+NAA 0.05 mg.L-1+Cef 500 mg.L-1+Hyg 5 mg.L-1的培养基上进行10 d的抗性筛选。结果共获得126个抗性芽,其中8个抗性芽经PCR检测扩增出目的基因的启动子BcA9,约850bp,阳性率为6.3%,初步验证目的基因已经转入萝卜再生芽中。     

金樱子(Rosa laevigata Michx.)叶片直接再生不定芽体系的建立

以金樱子组培苗的划伤叶片为外植体,研究了不同植物生长调节剂配比组合、暗培养时间、添加物L-脯氨酸、叶片不同部位对不定芽直接再生的影响。结果表明:当TDZ浓度为1.5 mg·L^-1、NAA浓度为0.000 5 mg·L^-1时,不定芽直接发生率最高,为9.5%;不同暗培养时间对不定芽直接诱导具有一定影响,暗培养时间为10 d时不定芽的直接发生率最高,为10.5%;添加了不同浓度的L-脯氨酸后不定芽的诱导率不增反降,所以以不添加L-脯氨酸为宜;叶片不同部位的再生率比较中,仅带叶叶柄可直接诱导出不定芽。综上所述,叶片直接再生不定芽的诱导方法是,以金樱子带叶叶柄为外植体,在直接诱导培养基上1/2MS+TDA 1.5 mg·L^-1+NAA 0.000 5 mg·L^-1+CH 100 mg·L^-1+AgNO3 10 mg·L^-1+蔗糖30 g·L^-1+琼脂7.5 g·L^-1,暗培养10 d后,转至正常光周期下培养3周左右,不定芽诱导率最高,为10.5%。所得不定芽在增殖培养基MS+NAA 0.1 mg·L^-1+6-BA 1.0 mg·L^-1生长3周后,增殖系数可达到3.5左右;将丛生芽切割成单芽后转入不含任何激素的MS培养基壮苗3周,幼苗可长高至3~5 cm;再转入MS+NAA 0.1 mg·L^-1培养基中生根,1个月后生根率达95%。     

组织培养结合秋水仙素诱导南瓜多倍体

以‘红栗2号’南瓜子叶为外植体,探讨外植体消毒时间、激素组合和培养基中秋水仙素浓度对芽诱导率的影响,对所得植株的倍性进行鉴定。结果表明:外植体在3%(w)Na Cl O溶液中消毒15 min,污染率为0且外植体活力较高;MS+6-BA 3.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+秋水仙素40 mg·L-1是诱导‘红栗2号’南瓜产生四倍体的最适培养基,诱导率达到25.71%;组培苗形态及根尖染色体有四倍体存在。     

东北百里香组培再生体系的建立

 以中国特有地被植物东北百里香为试材,研究了植物生长调节剂组合对腋芽萌发和茎段、叶片外植体愈伤诱导和不定芽分化的影响。结果表明：百里香茎段腋芽可直接诱导萌发,在MS + 6-BA 0.5 mg · L-1 + NAA 0.1 mg · L-1培养基上萌发率最高,达74%,在MS + 6-BA 0.5 mg · L-1 + NAA 0.1 mg · L-1的培养基上增殖倍数为36.43。由茎段萌发的组培苗在1/2MS + IBA 0.5 mg · L-1的培养基中20 d后生根率100%,移栽成活率76.7%。继代培养中叶片外植体可以诱导出愈伤组织,但是不能进一步分化成苗。茎段愈伤诱导的最适培养基为MS + 6-BA 0.5 mg · L-1 + 2,4-D 1.0 mg · L-1,再分化培养基为MS + 6-BA（0.1 ~ 1.0）mg · L-1 + GA3（0.1 ~ 0.5）mg · L-1,分化率为33.3%。     

乌桕毛状根培养与次生代谢产物累积研究

利用发根农杆菌ATCC 15834诱导获得乌桕毛状根,研究了不同培养条件对乌桕毛状根生长及次生代谢产物累积的影响.结果表明:乌桕毛状根生产量随培养时间的增加而增加,在第6周时达到最大产量(0.6668 g/瓶,DW);1～4周内暗培养更利于毛状根的生长,其后则光照培养更好;在相同培养时间内,毛状根在B5和1/2MS基本培养基上产量大于1/4MS、1/8MS及WP培养基;HPLC测定结果表明,1/4MS较其它培养基更利于多酚类代谢产物的累积.     

蒙古黄芪植株再生及增殖体系建立

以蒙古黄芪种子繁育而来的无菌苗获得的外植体(根、叶片、胚轴)为试材,通过设定不同浓度的生长调控激素6-BA、2,4-D、NAA,研究不同外植体在不同浓度激素的培养条件下对其愈伤组织诱导率、试管苗增殖及生根情况的影响,以期为蒙古黄芪不同组织外植体的愈伤组织诱导、植株分化及增殖培养条件提供参考依据。结果表明：以根、胚轴、叶片为外植体材料均可诱导愈伤组织产生,其中以胚轴为外植体为最优选择,愈伤组织诱导率最高达97.92%,最佳培养基为MS+2,4-D 1.0 mg·L^-1+6-BA 0.5 mg·L^-1+NAA 0.5 mg·L^-1+蔗糖3.0%;试管苗增殖的最佳培养基为1/2MS+6-BA 1.0 mg·L^-1+KT 0.5 mg·L^-1+蔗糖3.0%,再生植株平均分化率最高为92.67%;生根培养时,最适宜的培养基为1/2MS+NAA 0.5 mg·L^-1+白砂糖3.0%。该试验建立了蒙古黄芪植株再生及增殖体系,在黄芪生产实践中具有重要推广价值。     

多花蔷薇假珠芽诱导、体细胞胚发生及植株高效再生

 以多花蔷薇‘无刺3号’成熟种子为外植体,探讨了假珠芽诱导、体细胞胚发生及植株高效再生的方法。结果表明,种子的子叶在添加2, 4-D 0.5～2 mg·L-1的1/2 MS培养基上暗培养30 d后所产生的愈伤组织,接种到添加TDZ 5～20 mg·L-1的1/2 MS培养基上光培养20 d产生初级假珠芽。假珠芽在添加TDZ 10 mg·L-1和GA3 0.1 mg·L-1的诱导培养基上暗培养20 d后,在含麦芽糖的无激素培养基上光培养产生少量次级假珠芽和胚性愈伤组织。假珠芽保存在诱导培养基上。胚性愈伤组织可发育成大量正常体细胞胚,继而再生正常植物。假珠芽可通过上述方法不断诱导体细胞胚和假珠芽,通过这种方法假珠芽已经保存了2年。