板栗基因组AFLP银染反应体系的建立

为了建立准确、高效、实用的板栗品种鉴别体系和方法,采用改进的CTAB—DNA提取方法,从板栗的嫩叶和老叶中提取获得总DNA。所得DNA样品的D260nm/D280nm值为1.7～1.9,琼脂糖凝胶上主带清晰、较少降解、样品纯度高、蛋白去除干净且获得率高。该体系使用操作简便、快捷、高效,适合于板栗DNA提取,所提取的DNA样品不含PCR反应抑制剂及其他酶反应抑制剂,可被限制性内切酶MseI和EcoRI完全酶切,适合AFLP-PCR反应应用,得到清晰的指纹式样,适宜用作板栗品种鉴别的有效方法。     

加工番茄PCR-SSCP分子标记体系的建立与优化

以加工番茄为试验材料,采用PCR-SSCP分子标记技术,对DNA提取方法、PCR反应程序、聚合酶链式反应-单链构象多态性分子标记体系的电泳条件、变性剂等诸多因素进行了研究,筛选和建立了多态性检出率高、带型清晰、重复性好的PCR-SSCP反应体系和反应程序。结果表明:采用CTAB法提取番茄叶片DNA时,在CTAB缓冲液中加入5mol/L NaCl,第一次抽提离心速度和离心时间分别为8 000r/min和15min,可以获得高质量的DNA,PCR扩增程序为94℃5min,94℃1min,52℃30s,72℃1min,72℃10min,29个循环,退火温度52℃,引物大小100~300bp、98℃变性10min,非变性聚丙烯酰胺凝胶浓度8%,电泳1.5~2.5h,聚丙烯酰胺凝胶中不添加甘油为加工番茄PCR-SSCP分子标记体系最佳的条件组合。     

香菇银染mRNA差异显示体系的建立及条件优化

为建立适用于研究香菇(Lentinula edodes)分化中基因表达差异的银染差异显示方法,以香菇突变株fbd1及其出发菌株98411的菌丝体和子实体为材料,采用Trizol法提取总RNA,优化了反转录和PCR扩增中5项反应参数,再经6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离和银染显示差异条带.试验结果表明,适宜分析香菇mRNA差异的反转录体系中RNA投入量为0.5～1 μg、dNTP浓度为20 μmol/L,PCR扩增反应MgCl2、dNTP和Taq酶分别为2 mmol/L、200 μmol/L和1.0 U,此条件下,目标条带清晰且重复性好.     

茄子微卫星标记(SSR)反应体系的优化研究

以茄子品种"哈农杂茄4号"DNA为试材,利用单因素试验方法,研究了茄子SSR技术中PCR体系的主要成分对SSR扩增结果的影响,并比较了聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖电泳检测扩增产物多态性的差异。结果表明:反应体系中,模板DNA的适宜浓度为20~40ng,适宜的引物浓度为0.3μmol/L,dNTP的适宜浓度为200μmol/L,Mg2+的最适浓度范围为2.0~2.5mmol/L,Taq聚合酶在20μL反应体系中宜加入1U。茄子SSR的最佳反应程序为94℃预变性5min;94℃变性1min,52~56℃复性1min,72℃延伸2min,35个循环;最后72℃延伸8min。PCR产物检测时6%的聚丙烯酰胺凝胶的分辨率显著高于1.8%的琼脂糖电泳。