CRISPR/Cas9基因编辑技术在大型真菌研究中的应用现状

大型真菌与人类生活密切相关,但大部分大型真菌缺乏高效的遗传操作系统,极大地影响了功能基因功能分析及遗传改良研究。近年来CRISPR/Cas9基因编辑技术发展迅速,已经成为生命科学研究领域不可或缺的技术之一。笔者概述了CRISPR/Cas系统的结构类型及CRISPR/Cas9系统作用机理,介绍了CRISPR/Cas9基因编辑技术在大型真菌研究中的应用现状,并针对Cas9和sgRNA的表达、遗传转化策略、靶位点选择等影响编辑效率的关键问题进行了分析讨论,旨在为该技术在大型真菌研究中的应用提供参考。     

高效的西瓜CRISPR/cas9基因敲除技术

<正>目的与意义:基因编辑技术在植物基因功能鉴定以及重要农艺性状突变获得方面具有重要应用价值。CRISPR/Cas9基因编辑技术已应用于许多植物物种,成功实现了靶点突变。然而,目前在西瓜上还没有CRISPR/Cas9基因编辑技术相关的研究报道,该技术能否成功应用于西瓜研究及育种仍未可知。以西瓜的ClPDS基因(编码八氢番茄红素脱     

CRISPR/Cas9基因编辑技术在果树作物中的应用研究进展北大核心CSCD

成簇规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(Cas9)已成为一种有价值的基因组编辑工具,能够在特定选择的位点改变DNA序列,可以在作物基因组的靶点位置精确地实现删除、替换或插入特定序列,引入理想的目标性状。该工具具有简单、高效、成本低以及功能强大等特性,在柑橘、葡萄、香蕉和草莓等果树中已实现多种类型的应用,包含产生白化表型、调控童期和花期、调控果实品质以及创造矮化和抗病虫害品种等。综述了CRISPR/Cas9系统及其作用过程,介绍了新开发的精准编辑技术,包括单碱基编辑器、引导编辑及CRISPR/Cpf1多基因编辑系统,并详细阐述了CRISPR/Cas9系统在果树基因组编辑中的应用进展,包括果树种类、目标基因及目标性状等,归纳了CRISPR/Cas9系统实现高效编辑所遇到的遗传转化和再生体系、脱靶效应和启动子选择问题,最后提出了不断优化遗传转化和再生体系、合理选择靶位点和设计sgRNA、植物内源启动子及新编辑技术的解决策略。     

研究人员将用基因编辑技术唤醒番茄的辣味基因

来自巴西和爱尔兰的研究人员称,他们正在使用CRISPR/Cas9基因编辑技术制造辣味番茄,这些番茄可以用来制作辣椒喷雾、麻醉剂和减肥药等。巴西维索萨联邦大学的阿古斯丁·泽斯哥恩和他的团队在近期出版的《植物科学趋势》中表示,像CRISPR/Cas9这样的基因编辑技术可以“唤醒”番茄中休眠的辣味基因。他们在努力进行制造辣味番茄的工作,希望在2019年年底之前有一些好消息。     

利用西瓜愈伤组织快速检测CRISPR/Cas9基因编辑效率

西瓜作为重要的园艺经济作物,其CRISPR/Cas9基因编辑效率的快速检测方法仍十分匮乏。以愈伤组织再生能力强的野生西瓜种质ZTC为试验材料,针对西瓜ClPDS基因构建CRISPR/Cas9双靶点敲除载体,利用农杆菌侵染西瓜幼嫩子叶,在含1.0 mg·L-12,4-二氯苯氧乙酸生长素的MS培养基中诱导愈伤组织形成,通过绿色荧光蛋白标记筛选阳性愈伤组织,检测其编辑效率。结果表明,2个靶点均发生基因编辑,靶点1处的编辑效率为42.95%,靶点2处的编辑效率为29.92%。在愈伤组织中建立了西瓜生长发育早期有效基因编辑效率检测体系,为后续编辑株系的确定节约了大量时间,为基因编辑技术应用于西瓜重要农艺性状改良及优异种质创制提供了技术支撑。     

利用CRISPR/Cas9敲除葡萄VviPDS1基因的研究

选择葡萄八氢番茄红素脱氢酶(Phytoene desaturase)基因VviPDS1为靶标,利用CRISPR/Cas9系统构建基因敲除载体,瞬时转化葡萄叶片原生质体,检测到不同类型的突变。通过农杆菌介导转化‘无核白’葡萄胚性愈伤组织,筛选获得卡那霉素抗性植株71株。经PCR鉴定,其中53株为阳性植株,阳性率为74.64%。测序结果表明,共有20株在靶点发生不同类型的突变,编辑效率为37.74%;其中9株产生了双等位基因突变。对其进行氨基酸序列预测,在第202位氨基酸之后发生了不同程度的变异。利用CRISPR/Cas9系统敲除VviPDS1获得的突变体植株呈现整体矮化,其叶片出现不同程度白化。表明CRISPR/Cas9系统可以通过细胞中的瞬时或稳定表达进行基因编辑,可以实现在葡萄编辑植株中产生纯合敲除。     

梨愈伤组织双靶点CRISPR/Cas9基因编辑系统的建立

为了在梨愈伤组织中建立CRISPR/Cas9基因编辑体系,将proDAM3:GUS转入‘茄梨’愈伤组织,通过构建双靶点的CRISPR/Cas9基因编辑载体,利用农杆菌介导的遗传转化法侵染proD AM3:GUS转基因梨愈伤组织,通过测序及GUS染色的方法检验敲除效果,分析靶基因突变类型。结果表明,共有4个转基因株系在靶位点处发生了基因突变,编辑效率为66.7%。对所有基因编辑株系的有效克隆进行分析,结果显示sgRNA1在靶位点GUST1的突变频率达到71.4%,高于sgRNA2在靶位点GUST2突变频率的46.4%,说明sgRNA1可以更有效地与靶位点结合。测序结果表明,4个基因编辑株系中GUS基因均被敲除,基因突变的类型包含碱基缺失、插入及两个靶点之间大片段的缺失,不存在碱基替换。GUS染色结果显示,基因敲除后的GUS转基因愈伤完全呈白色,说明利用CRISPR/Cas9多靶点基因编辑系统可以在梨愈伤组织中实现高效的基因敲除。     

CRISPR/Cas9技术在天目地黄RcPDS1基因编辑中的应用

为了研究CRISPR/Cas9技术在天目地黄基因编辑中的应用，克隆了天目地黄（Rehmannia chingii）的八氢番茄红素脱氢酶基因（Rc PDS1），利用PCR方法扩增其c DNA序列和基因组DNA序列。通过构建单靶点CRISPR/Cas9载体，利用根癌农杆菌介导的遗传转化方法侵染天目地黄无菌苗叶盘，通过TA克隆测序法分析基因编辑的类型。结果显示，克隆获得了1个天目地黄Rc PDS1的全长c DNA序列，其具有1个长度为1 743 bp的开放阅读框，编码580个氨基酸残基，基因组DNA序列长度8 041 bp，包含14个内含子和15个外显子。通过遗传转化共获得57个转基因再生株系，其中具明显白化表型的株系有20个（35.09%）。TA克隆测序结果显示，Rc PDS1靶位点突变类型主要包括碱基缺失、替换和插入。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在天目地黄中成功实现了对Rc PDS1基因的靶向敲除。     

利用发根农杆菌体系检测西瓜CRISPR/Cas9系统的靶位点

西瓜遗传转化技术周期长,过程复杂,CRISPR/Cas9基因编辑系统又存在着一定的脱靶效应,为了保障所选择的靶位点的可行性,本研究选择西瓜ClSPO11-1基因(ID:Cla003301)为靶标,利用CRISPR/Cas9基因编辑系统构建双靶点的基因敲除载体,利用发根农杆菌Ar. Qual菌株侵染西瓜子叶外植体,通过简单的组培过程,使西瓜外植体长出不定根,在不定根中检测到了在靶位点1处发生了不同程度的碱基缺失,经过与野生型氨基酸序列比对分析后发现均造成了翻译提前终止和氨基酸的突变,成功实现了对西瓜不定根的基因编辑,该方法周期短,操作简便,实现了快速鉴定在西瓜中选择的靶位点的靶向效率,为研究西瓜基因功能和遗传改良提供了保障。     

碱基编辑技术及其在作物遗传改良中的应用综述

碱基编辑技术是以CRISPR/Cas系统为基础开发的一种能够对基因组进行定点精准编辑的新技术,包括胞嘧啶碱基编辑系统(cytosine base editor,CBE),腺嘌呤碱基编辑系统(adenine base editor,ABE)以及引导编辑系统(primeediting,PE)。胞嘧啶碱基编辑系统可以将基因组靶位点处的C/G转换为T/A,腺嘌呤碱基编辑系统可以将靶位点处的A/T转变为G/C,而引导编辑系统则可以实现所有12种类型(C-T、G-A、A-G、T-C、C-A、C-G、G-C、G-T、A-C、A-T、T-A、T-G)碱基的任意替换以及碱基的插入和删除。本文中系统介绍了这3种碱基编辑系统的原理、开发过程、各自的优缺点以及在作物遗传改良中的应用和发展,并展望了碱基编辑技术在农作物育种中的应用前景。     

利用CRISPR/Cas9系统敲除葡萄中VviEDR2提高对白粉病的抗性

利用CRISPR/Cas9系统定点编辑葡萄白粉病感病基因VviEDR2(Enhanced disease resistance2),在VviEDR2的DUF1336结构域设计靶位点VviEDR2-T1,构建CRISPR/Cas9敲除载体,通过农杆菌介导法转化‘无核白’葡萄胚性愈伤组织。对PCR阳性植株进行靶位点扩增测序,结果表明,共有8个转基因植株在靶位点处发生不同类型的双等位基因突变,编辑效率为32%;突变体植株生长势较弱,叶片较小,茎秆丛生、细弱。进一步对突变体植株进行抗病检测,结果表明,接种葡萄白粉菌(Erysiphe necator Schw.)5d后,突变体植株叶片上白粉菌孢子仅能萌发出少量较短初级菌丝,表皮细胞产生大量明显的H2O2,而野生型叶片中白粉菌萌发出大量初级菌丝、次级菌丝和吸器,无明显H2O2产生。这些结果表明,可以利用CRISPR/Cas9技术编辑葡萄感病基因VviEDR2,提高葡萄白粉菌抗性。     

利用CRISPR/Ca9技术靶向编辑芥蓝BoaZDS

以芥蓝(Brassicaoleraceavar.alboglabra)为材料,以ζ–胡萝卜素脱氢酶(ζ-Carotene desaturase,ZDS)基因为目标基因,建立其CRISPR/Cas9基因组编辑体系。在BoaZDS的编码区近5′端选择靶位点,构建了CRISPR/Cas9表达载体,通过农杆菌介导的遗传转化方法获得了19个芥蓝转基因阳性植株,Sanger测序分析发现其中13株成功突变,CRISPR/Cas9载体在芥蓝上的突变效率为68.42%,且所有突变植株均表现出明显的白化表型。     

A simple and efficient CRISPR/Cas9 platform for induction of single and multiple,heritable mutations in barley (<Emphasis Type="Italic">Hordeum vulgare</Emphasis> L.)

Background

Genome editing of monocot plants can be accomplished by using the components of the CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR associated Cas9) technology specifically optimized for these types of plants. Here, we present the development of RNA-guided Cas9 system for simplex and multiplex genome editing in barley.

Results

We developed a set of customizable RNA-guided Cas9 binary vectors and sgRNA modules for simplex and multiplex editing in barley. To facilitate the design of RNA-guided Cas9 constructs, the pBract derived binary vectors were adapted to Gateway cloning and only one restriction enzyme was required for construction of the sgRNA. We designed a synthetic, codon optimized Cas9 gene containing the N terminal SV40 nuclear localization signal and the UBQ10 Arabidopsis 1st intron. Two different sgRNAs were constructed for simplex editing and one polycistronic tRNA-gRNA construct (PTG) for multiplex editing using an endogenous tRNA processing system. The RNA-guided Cas9 constructs were validated in transgenic barley plants produced by Agrobacterium-mediated transformation. The highest mutation rate was observed in simplex editing of the cytokinin oxidase/dehydrogenase HvCKX1 gene, where mutations at the hvckx1 locus were detected in 88% of the screened T₀ plants. We also proved the efficacy of the PTG construct in the multiplex editing of two CKX genes by obtaining 9 plants (21% of all edited plants) with mutations induced in both HvCKX1 and HvCKX3. Analysis of the T₁ lines revealed that mutations in the HvCKX1 gene were transmitted to the next generation of plants. Among 220 screened T₁ plants we identified 85 heterozygous and 28 homozygous mutants, most of them bearing frameshift mutations in the HvCKX1 gene. We also observed independent segregation of mutations and the Cas9-sgRNA T-DNA insert in several T₁ plants. Moreover, the knockout mutations of the Nud gene generated phenotype mutants with naked grains, and the phenotypic changes were identifiable in T₀ plants.

Conclusions

We demonstrated the effectiveness of an optimized RNA-guided Cas9 system that can be used for generating homozygous knockout mutants in the progeny of transgenic barely plants. This is also the first report of successful multiplex editing in barley using a tRNA processing system.

     

番茄基因编辑研究进展和前景

介绍了基因编辑技术的发展和现状,并对该技术在番茄耐贮性和成熟调控、营养成分和果色、雄性不育和单性结实、逆境响应、株形、花形及野生种重新驯化等方面的研究进展进行了概述,梳理了基于CRISPR/Cas技术的单碱基编辑、DNA-free编辑及提高同源重组效率的技术创新及在番茄遗传改良和品种培育方面的应用前景和面临的挑战.     

基因瞬时表达技术在园艺植物上的应用研究进展

 基因瞬时表达技术是近年来发展形成的一种快速高效的基因功能分析方法,应用广泛。本文综述了基因瞬时表达技术的原理、影响因素及其在园艺植物上的应用,指出该技术在当前应用中存在的不足并提出建议及展望。     

应用CRISPR/Cas9体系对番茄PSY 1基因的定点编辑

基于NCBI数据库提供的番茄八氢番茄红素合成酶基因(PSY 1)全长,并根据基因序列中PAM(proto adjacent motif)的位置设计特异性sg RNA,构建CRISPR/Cas9 Level 1、Level 2载体;将设计好的载体转化农杆菌,继而转染番茄子叶,利用PCR产物测序法检测sg RNA在番茄基因组中的敲除效率。结果表明,36个转基因植株中有22个PSY 1基因目标区出现不同数目的碱基缺失、增加或互换,初步估计基因敲除效率为61%。本试验在番茄中初步建立了CRISPR/Cas9介导的基因敲除技术,该技术能够稳定的在番茄中实现基因敲除。     

CRISPR/Cas9介导柑橘CsLOB1基因启动子的多位点编辑

为了获得CsLOB1启动子较大片段删除的突变体,利用CRISPR/Cas9技术对CsLOB1启动子进行多位点编辑。通过在CsLOB1启动子的EBEPthA4区域及其上、下游设计不同的靶标位点,构建了2个植物表达载体pCas9CsLOB1:2sites和pCas9CsLOB1:3sites,分别对CsLOB1启动子同时进行2个位点和3个位点的编辑。测序结果表明pCas9CsLOB1:2sites和pCas9CsLOB1:3sites的基因编辑效率分别为64.7%和80.0%,突变体植株在2个sgRNA之间发生了DNA片段的删除。进一步的分析发现,不同的sgRNA具有不同的突变效率,其差异是由于不同的sgRNA对CsLOB1-识别和结合能力的差异造成的。本结果表明对CsLOB1启动子进行多位点编辑可以获得删除较大DNA片段的突变体。