离体梨花柱S-RNase对自体花粉管超微结构变化的影响

采用透射电子显微镜研究了离体条件下‘今村秋’、‘丰水’梨花柱S-RNase对‘今村秋’花粉管生长过程中花粉管超微结构的影响。‘丰水’花柱S-RNase处理的‘今村秋’花粉管(异体,亲和)和对照花粉管结构在生长过程中表现正常,即花粉管顶端生长区域充满细胞质和细胞器,结构完整,花粉管壁上没有胼胝质层分布。而‘今村秋’花柱S-RNase处理的‘今村秋’花粉管(自体,不亲和)超微结构随时间的延长出现衰退现象。处理3h时,自体花粉管内充满细胞质和细胞器,结构完整,但在花粉管的极顶端分泌小泡融合,并且此区域的细胞壁比后部的薄;处理8h后,细胞器出现一定程度的衰退现象,线粒体膨大,嵴减少或消失,内质网膨大并包围在液泡和其它细胞器周围,液泡融合并侵蚀周围的细胞质和细胞器;到24h时,自体花粉管内线粒体、内质网等细胞器消失,只有靠近花粉管前端有少量细胞质存在,细胞壁增厚,并且有一层厚厚的胼胝质层紧靠细胞壁。结果表明,花柱S-RNase能引起自体花粉管的衰退,从而抑制自体花粉管生长。     

梨花柱S糖蛋白对离体花粉萌发及花粉管生长的影响

应用CM和SP琼脂糖凝胶 (Sepharose)离子交换层析法从‘新水’梨花柱可溶性蛋白质中分离纯化出具有RNase活性的S糖蛋白 ,将其加入花粉培养基 3～ 12h ,新水花粉 (自交不亲和 )的萌发率及花粉管生长受到强烈抑制 ,当浓度为 1.2 5μg·μL- 1时 ,分别为对照的 6 5%和 38% ,低浓度 (0 .4 μg·μL- 1)抑制作用不明显 ;与新水杂交不亲和的‘幸水’花粉也出现同样的结果 ;而与其杂交亲和的‘长十郎’花粉萌发率不受影响 ,仅花粉管生长受到轻微的抑制 ,其长度为对照的 79%。不含S糖蛋白的花柱可溶性蛋白质对自花及异花的花粉萌发及花粉管生长均无影响。     

梨自交不亲和强度不同品种花柱S糖蛋白含量的差异

 提取梨( Pyrus) 自交不亲和强度不同品种花柱可溶性蛋白质, 应用等电聚焦电泳法在凝胶板上分离出S 糖蛋白, 用图像解析法进行定量。结果表明, 花柱总S 糖蛋白含量因品种而异, 自交不亲和强、弱及自交亲和的品种每1 􀀁g 花柱可溶性蛋白中含总S 糖蛋白分别为􀀂1. 3 ng 、0. 7 ~ 0. 9 ng、 0. 7 ng 。不同的S 基因所表达的S 糖蛋白量差异显著, 即使是同一S 基因所对应的S 糖蛋白量也因品种而异。     

梨不同花龄自花与异花授粉的花柱内花粉管生长及坐果率的比较

对自交不亲和强度不同的梨品种丰水和菊水的不同花龄花进行自花授粉和丰水×菊水异花授粉后,用荧光显微镜观察花粉萌发及生长特性。结果表明,开花当天及以后的自花和异花授粉花粉在柱头上均有较高的萌发率;自花和异花花粉管在花柱内的生长速度及停止生长的位置不同,丰水自花授粉后花粉管生长的短且慢,菊水自花花粉管生长的长且快,而异花授粉的花粉管生长最快。自花授粉后,不同花龄对花粉管生长影响表现为:开花4d前的蕾期授粉以及开花4d后的延迟授粉,花粉管生长长度显著的长。开花6d前的各种授粉组合,花粉管生长均较差。这与田间授粉坐果率的高低基本一致,即整体表现为各个花龄的授粉都以异花授粉坐果率最高,其次为菊水自花授粉,丰水自花授粉坐果率最低。另外,自花授粉中,蕾期授粉和延迟授粉(开花2d后除外)坐果率都有提高,而异花授粉中蕾期授粉和延迟授粉的坐果率却有所下降。     

8个中国梨品种S基因型的分子鉴定

为鉴定8个中国梨品种的S基因型,使用梨自交不亲和基因(S-RNase)特异引物"FTQQYQ"和"anti-ⅡWP-NV",对8个梨品种的基因组DNA进行特异扩增,并对扩增片段进行回收、克隆、测序。使用生物信息学软件对各序列分析和经同源性搜索分析后,确定了各品种的S基因型。结果分别是:兰州花长把为S19S22,青面为S1S18,黄面为S1S12,早蜜为S19S29,大面黄为S1S19,无子黄为S28S16,大青皮为S34S19及金锤子为S16S19。     

八月酥等14个梨品种自交不亲和基因(S基因)型的鉴定

多数梨品种自花授粉不结实,生产上要合理配置授粉品种才能获得应有的产量。鉴定梨品种的S基因型,能为梨园合理配置授粉品种提供依据。以我国育成的梨品种为试材,利用特异引物PCR产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离及DNA序列分析,鉴定出了14个梨品种的自交不亲和基因型(S基因型),并通过统计部分品种的田间人工授粉的坐果率以及应用荧光显微镜观察异花授粉后花柱内的花粉管生长情况来验证鉴定出的梨品种S基因型的可靠性。这些品种的S基因型为:八月酥S3S16、绿云S3S29、谢花甜S29S34、香茌S1S21、脆绿S3S4、新雅S4S34、雅青S4S34、伊犁红句句S22S28、猪嘴酥S19S22、假直把子S5S19、青魁S1S3、德胜香S3S29、张掖长把S3S29、金坠梨S21S34。     

梨20个品种S基因型的鉴定及新S-RNases基因克隆

 为了鉴定我国梨品种和一些野生类型个体的S基因型,应用S-RNase特异PCR扩增、克隆和测序,对其S-RNases基因核苷酸序列进行分析,鉴定了20个梨品种和野生类型个体的S基因型。起源于我国的'奥连'(S_pS₃₂)、'吊蛋'(S_dS_e)、'沙疙瘩'（S₃₆S_d）品种和杏叶梨的一个类型（S₂₂S_c）个体中存在西洋梨的S-RNase基因,证明S-RNase基因分化是在东方梨种群和西方梨种群的各个种形成之前。在秋子梨的'麦梨'、'内蒙古山梨'中发现了2个新S-RNases基因,命名为S₄₀-、S₄₁-RNase（DQ903313、DQ988687）。S₄₀-和S₄₁-RNase基因推导的部分氨基酸序列分别与苹果属S₁₁-和S₆-RNase的同源性为100%和94.4%,这表明S-RNase的存在可能在梨属和苹果属形成之前。     

日本梨活体花柱内花粉RNA的降解

 用³² P标记的花粉进行自花与异花授粉后, 提取含有花粉³² P-RNA的授粉花柱RNA测定放射性活度, 并将授粉花柱RNA样品进行非变性琼脂糖电泳。结果表明, 授粉后12～48 h, 自花授粉花柱RNA 中花粉³² P-RNA只占异花授粉花柱RNA中的40.7%～25.3% , 自花授粉花柱中花粉完整RNA的量特异性地减少, 表明自花花粉RNA在花柱中被特异性地降解。     

12个梨品种S基因型的鉴定

应用PCR扩增技术, 根据目的S基因与GenBank中已知S 基因同源性100%原理鉴定了我国育成的12个梨品种的S基因型, 分别是: ‘红酥脆’为S₄S₃₆ , ‘新梨7号’为S₂₈S_d , ‘金水3号’为S₅S₂₉ , ‘八月酥’为S₃S₁₆ , ‘金水1号’为S₃S₂₉ , ‘龙泉酥’为S₃S₂₂ , ‘雪花’为S₄S₁₆ , ‘雪芳’为S₄S₁₆ ,‘雅青’为S₄S₃₄ , ‘新雅’为S₄S₃₄ , ‘德胜香’为S₃S₂₉ , ‘富源黄’为S₁₆S₃₃。通过对S基因的DNA序列分析, 确认S₁₆、S₃₁为同一S基因。本研究结果丰富了我国梨品种的S基因型信息, 为田间合理配置授粉品种提供了依据。     

Li~+、肌醇与Ca~(2+)对苹果、梨、山楂花粉萌发和花粉管生长的影响

观测了苹果（金冠）、梨（鸭梨）、山植（面值）的花粉萌发和花粉管生长情况,结果表明,Li2SO4的浓度越高、处理时间越早,花粉萌发和花粉管生长的抑制程度越大,Ca2+和肌醇可不同程度地逆转上述效应。因此认为,细胞内一定量的肌醇和Ca2+是果树花粉萌发和花粉管生长所必需的,并对维持正常的肌醇磷脂代谢是至关重要的。     

果梅花粉原位萌发及花粉管生长特性的研究

以软条红梅为试材,分别于白花授粉和异花授粉后的1、3、6、12、24、48、72、96、120 h切取花柱,用FAA固定液处理、荧光染色后压片观察,结果表明:异花和自花花粉都能在柱头上萌发,但在授粉后的48 h之内异花花粉的萌发率显著高于自花花粉的萌发率,如在授粉6 h后,异花花粉萌发率高达58％,而自花花粉的萌发率仅为23％。花柱内异花花粉管生长速度明显比自花的快,在授粉后花粉管到达花柱上部、中部及基部的数目均是异花高于白花。如授粉24 h后异花花粉管平均有30余根穿过花柱上部,约有14根到达中部,有2根到达基部;而自花授粉的花粉管分别仅有18、7和0根,且白花授粉时在72 h内均未见有花粉管到达花柱基部,主要在花柱中部前后停止生长。结果表明软条红梅自花授粉的花粉管主要是在花柱中部被抑制而停止生长,从而不能完成受精,表现出典型的配子体型自交不亲和性。     

不同保存温度对几个梨品种花粉生活力的影响

对5个梨品种的花粉进行了不同温度条件下的保存试验.结果表明:保存前花粉发芽率较高,随着室温保存时间的延长,花粉的发芽率迅速下降.60 d后,各品种梨的花粉发芽率降低到10%以下.红酥脆、满天红、黄金梨、奥冠红梨和台湾雪梨分别降为3.8%、3.7%、4.6%、5.8%、5.1%.因此,室温长期保存花粉效果较差.但若进行短时间(5～10 d)贮藏,其保存效果还是比较理想的.低温保存条件下,随着保存时间的延长,各品种梨花粉的生活力下降不太明显,4 ℃下和-20℃下保存60 d后,花粉的生活力仍然在74%和78%以上,而-20℃下保存的花粉生活力较4℃稍强,因此,在-20℃下较长时间保存梨花粉效果更为理想.     

苹果自花授粉的花粉管结构变化及S-RNase定位

 苹果‘红星’品种授粉处理24 h后, 自花授粉比异花授粉的花粉管生长缓慢。授粉处理48 h后, 可观察到自花授粉花柱通道组织的花粉管内有二裂粒子增加、管壁破裂和管内物质溢出、外层管壁增厚等现象。苹果气球状花期未授粉的花柱及自花和异花授粉24 h后且无花粉管存在的花柱切片显示, S-RNase位于花柱通道组织的细胞内。自花和异花授粉48 h后有花粉管通过的花柱切片显示, S-RNase位于花柱通道组织的细胞间隙和花粉管内。     

梨试管苗的生根

采用三种不同生根法,成功地诱导梨砧木BP10030试管苗生根.试管生根法最适的吲哚丁酸(IBA)浓度为2mg·1~(-1),生根率、平均根数和根长度分别为95%、7.4和3.4cm.用2—8mg·l~(-1)的低浓度IBA浸枝处理,生根率均在90%以上,其中以4mg·l~(-1)的IBA促根效果最佳.用10—500mg·l~(-1)的高浓度IBA浸枝处理,生根较差.尽管试管生根法容易诱导试管苗形成不定根,但是不定根形成部位产生大量愈伤组织,试管苗移栽成活率低,初期生长缓慢.采用低浓度IBA浸枝生根法,不定根形成部位不产生愈伤组织,移栽成活率高,试管苗初期生长快.     

京白梨等品种S 基因型鉴定及新基因S28 和S30 的核苷酸序列分析

 根据梨S基因高度保守区C1和C3区, 设计1对引物P1和P2, 对梨品种的基因组DNA进行S基因特异扩增、克隆、测序, 并在GenBank中BLAST比较, 确定S 基因特异性片段, 对京白梨等6个供试自交不亲和品种的S基因型比对结果为: 白梨中的‘库尔勒香梨’为S₂₁ S₂₈ , ‘苹果梨’为S₁₇S₁₉ ; 砂梨中的‘台湾蜜梨’为S₁₁ S₂₂ ; 西洋梨中的‘葫芦梨’为S_a S_b; 秋子梨中的‘京白’为S₁₆ S₃₀ , ‘早梨18’为S₄ S₂₈。其中S₂₈和S₃₀为首次登录的新S 基因, 在GenBank的登录号分别为AY562394 (库尔勒香梨) 和AY876945 (京白) 。