28SrDNA PCR-RFLP分析在侧耳属系统发育研究中的应用

对侧耳属18个种52个菌株及3个其它属的菌株的28S rDNA 5‘端进行PCR扩增，得到长度约为1．46kb的片段。对该片段分别用7种限制性内切酶AluⅠ、BamHⅠ、HaeⅢ、HhaⅠ、HinfⅠ、MspⅠ、TaqⅠ酶切，结果表明，MspⅠ酶切片段多态性最高，AluⅠ对侧耳属无酶切多态性。聚类分析结果表明，菌株间的相似系数为0．569－1．000，在92％相似水平可将侧耳分为5大类：Ⅰ、红平菇和桃红侧耳；Ⅱ、鲍鱼菇和囊盖侧耳；Ⅲ、具核侧耳；Ⅳ、金顶侧耳；Ⅴ、其它所有供试侧耳。     

贝盖侧耳的系统发育地位——基于nrDNA-LSU和ITS序列分析的研究

通过同时对细胞核编码的核糖体大亚基DNA（nrDNA-LSU）和内转录间隔区（ITS）两个片段序列进行测定，分析了贝盖侧耳的系统发育地位. 结果显示: 贝盖侧耳与幕盖菇属亲缘关系较远，而与侧耳属成员关系密切，担子果侧生和具有菌幕并不能作为与幕盖菇属同源的依据. 在侧耳属中，贝盖侧耳与同样能产生菌幕的栎侧耳和Pleurotus levis亲缘关系并不密切，而与不产生菌幕的红侧耳关系最近.      

侧耳属蕈菌的分子系统发育研究

侧耳属蕈菌是具有重要经济价值的食用大型真菌。侧耳属种类繁多,系统发育关系一直不甚明确,给科学研究和学术交流带来困难。可用于侧耳属蕈菌分子系统发育研究的基因片段很多,核糖体DNA(rDNA)的部分序列已成为国际公认的较为理想的系统发育标记。rDNA的内转录间隔区(Internal transcribed spacers,ITS)、大亚基(Large subunite rDNA,LSU rDNA)片段(即28S rDNA)等是在侧耳分子系统发育与分类研究中采用较多的序列,为侧耳属系统发育研究提供了可靠的标记手段。更深入的分子系统发育研究将为侧耳的分类工作奠定坚实的基础。     

利用rDNA的PCR-RFLP对伞滑刃属线虫群体的分子鉴别

应用对rDNA中ITS的PCR-RFLPs技术和方法对来自中国、日本和韩国的松树或木质包装箱中分离出来的伞滑刃属(Bursaphelenchus)6个线虫群体进行了分子鉴定.其中来自浙江镇海的松树和日本的木质包装箱中分离出的各一线虫群体被鉴定为松材线虫(B.xylophilus),而来自浙江富阳的松树和韩国、香港及日本的木质包装箱中的另一个群体等4群体被鉴定为拟松材线虫(B.mucronatus).本研究中选用的4种限制性内切酶(Hinf Ⅰ、Hae Ⅲ、MspⅠ、cfo Ⅰ)的特异性酶切位点均可以有效地鉴别松材线虫和拟松材线虫.     

隔指孢属rDNA TIS区间限制性片断长度多态性（RFLP）分析

利用PCR－RFLP方法对捕食线虫真菌隔指孢属进行了系统发育研究。以ITS1和ITS4为引物对该属8种8个菌株的核糖体DNA转录间区（ITS）进行了PCR扩增，4种内切酶（AluⅠ,HaeⅢ,HpaⅡ,TaqⅠ)酶切。结果表明，该属的ITS区长度没有明显差异，其分子长在564－595bp之间，酶切图谱能体现不同种间的多态性，根据4种内切酶酶切结果，利用UPGMA法构建的节丛孢属分子系统树，基本体现了属内不同种间的亲缘关系，从分子水平证明了隔指孢属形态分类上的合理性。     

基于 COX III 基因的侧耳属真菌遗传多样性分析

侧耳属真菌是具有重要经济价值的食药用真菌, 对该属真菌的准确鉴定对菌种的分离纯化和提高 菌株生产潜力有重要意义。 其种类繁多, 种群复杂, 形态差异大, 且常会受到环境的影响, 分类鉴定不易, 常 会引起争议。 首次将 COXIII 基因用于真菌的遗传多样性分析, 侧耳属菌种经 PCR 扩增和测序后得到 13 种侧 耳属真菌的 COXIII 部分序列, 并使用粒子群算法得到 DNA 序列的二维聚类图, 用 PHYLIP 软件构建其系统演 化树, 探讨侧耳属真菌的系统亲缘关系。 结果表明： 金顶侧耳、 桃红侧耳和鲍鱼菇彼此之间以及与其他侧耳属 菌种的亲缘关系较远; 阿魏蘑和白阿魏蘑之间的关系十分密切; 糙皮侧耳、 阿魏蘑、 杏鲍菇关系较近。 结合其 他学者的研究和形态学证据, 说明 COXIII 基因可以很好地对侧耳属进行遗传多样性分析。     

IBDV超强毒株、强毒株及疫苗株的快速鉴别诊断

【目的】利用限制性酶切位点的特异性,鉴别IBDV超强毒株、强毒株及疫苗株。【方法】根据IBDVVP2基因的共保守序列设计1对引物,分别以IBDV超强毒株GX8/99、陕西分离株、强毒株(XZ-1、ZZ-1、JL、GX-2、JS-2、SD-1、SD-3、HeN-4、ZJ-1、JX-2、JS-30)和疫苗株(B87、NF8)的VP2保守序列为模板,采用RT-PCR方法扩增VP2基因的共保守序列,并构建IBDV不同毒株的重组质粒。用AhaⅠ/StuⅠ和BamHⅠ/NspⅠ2组限制性内切酶分别对超强毒株、强毒株及疫苗株的重组质粒进行酶切鉴定。【结果】扩增出了IBDVVP2基因中的共保守序列,其长度为802 bp。超强毒株能被AhaⅠ/StuⅠ切出327 bp的片段,而强毒株及疫苗株则能被BamHⅠ/NspⅠ切出270 bp的片段。【结论】此种RT-PCR结合限制性内切酶酶切的鉴别方法能够很好的区分IBDV超强毒株与强毒株和疫苗株。     

菊属部分植物的AFLP分析

利用AFLP技术,对菊属植物12个分类群进行分析.选择EcoRI/ MseI 这一酶切组合,5个E+3/M+2引物组合及1个E+3/M+3引物组合进行选择性扩增.共得到287条条带,其中多态性条带占85.7%.利用UPGMA方法对扩增数据进行分析,结果表明:所选的两个栽培品种‘滁菊'和‘亳菊'可归并为一个品种,该品种与毛华菊、野菊、甘菊亲缘关系相对较近,紫花野菊次之,小红菊相对最远.各野生种间,野菊、甘菊和菊花脑间的亲缘关系极近,且同一分布区内的不用种间有比较频繁的种质渗入.研究表明AFLP技术是进行菊属植物亲缘关系研究极为有效的工具.     

两种鲷属鱼类线粒体COI基因片段序列的比较

利用通用引物成功扩增了黄鳍鲷和黑鲷的线粒体细胞色素氧化酶Ⅰ亚基（COI）基因序列。通过序列测定,得到581bp的基因片段,碱基A、T、G、C平均含量分别为25．8％、32．6％、18．0％和23．6％,序列中的A＋T含量明显高于G＋C含量,与其他鱼类的C01基因片段研究结果相一致。通过序列分析发现黄鳍鲷和黑鲷两序列共存在14处碱基变异,其中在第19～139bp之间检测到13个变异位点,是变异频率较高的区段,可以考虑作为鲷属或者种群鉴别的分子标记。与黄鲷、真鲷、三长棘真鲷等鱼类比较,无插入和缺失位点,转换明显高于颠换。序列差异比较结果显示,真鲷与黄鳍鲷的序列差异在这5种鱼类中最大,达到了18．2％,黄鳍鲷和黑鲷的筹异最小（2．4％）。两个序列已提交到GenBank数据库中．序列臀录号为DQ185608和DQ185609.     

两种鲷属鱼类线粒体COI基因片段序列的比较

利用通用引物成功扩增了黄鳍鲷和黑鲷的线粒体细胞色素氧化酶Ⅰ亚基（COI）基因序列。通过序列测定，得到581bp的基因片段，碱基A、T、G、C平均含量分别为25．8％、32．6％、18．0％和23．6％，序列中的A＋T含量明显高于G＋C含量，与其他鱼类的C01基因片段研究结果相一致。通过序列分析发现黄鳍鲷和黑鲷两序列共存在14处碱基变异，其中在第19～139bp之间检测到13个变异位点，是变异频率较高的区段，可以考虑作为鲷属或者种群鉴别的分子标记。与黄鲷、真鲷、三长棘真鲷等鱼类比较，无插入和缺失位点，转换明显高于颠换。序列差异比较结果显示，真鲷与黄鳍鲷的序列差异在这5种鱼类中最大，达到了18．2％，黄鳍鲷和黑鲷的筹异最小（2．4％）。两个序列已提交到GenBank数据库中．序列臀录号为DQ185608和DQ185609.     

西班牙根结线虫rDNA特性及其检测方法

通过对rDNA的ITS区和IGS2区进行PCR扩增并对产物测序,比较分析了西班牙根结线虫与中国4种常见的南方根结线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫和北方根结线虫群体rDNA的ITS区和IGS2区的序列差异,选择限制性内切酶TaqⅠ对IGS2区的PCR扩增产物进行酶切,获得了西班牙根结线虫的554 bp的特异性条带.表明用此方法可以明显将西班牙根结线虫与其他4种常见的根结线虫群体区分开,其灵敏度可达到单条根结线虫二龄幼虫.     

基于线粒体16S rDNA序列的蝽总科系统发育研究(异翅亚目:蝽次目)

以线粒体16S rDNA基因作为分子标记,对蝽总科8个科23种昆虫进行了系统发育的分析,并采用最大简约法、最大似然法和邻接法构建了分子系统树。结果表明:利用16S rDNA分子研究蝽总科的系统发育关系是适合的,能够重建蝽总科的单系性;土蝽科的位置不稳定,在蝽总科各科进化过程中处于中间位置;龟蝽科与蝽科在MP树和ML树中都形成姊妹群关系,在NJ树中2个科的亲缘关系也比较近;异蝽科是最早分支出来的,表明异蝽科是所研究类群中最为原始的类群。本研究从分子水平上支持了将荔蝽亚科、盾蝽亚科和兜蝽亚科从蝽科中分立出来提升为科的观点。     

我国部分区域链格孢属 rDNA ITS区序列分析

[目的]对我国部分区域链格孢属rDNA ITS序列进行分析,从而在分子水平上对其进行鉴定。[方法]使用通用引物ITS4和ITS5对分离自我国部分区域不同寄主链格孢属（AlternariaNees）34个菌株进行ITS基因（ITS1-5.8S-ITS2）的PCR扩增和测序。[结果]序列分析结果表明：5.8S rDNA全长为159 bp,保守程度高,参试的34株菌均一致;ITS区变化相对较大。与A.tenuissima或A.alternata100%同源的分离菌株均表现出对地域和基质的广适性;菌株在5.8S/ITS存在的差异,说明寄主本犀科的丁香叶、蔷薇科、茄科等部分植物的链格孢具有一定的多样性。但同时也发现ITS序列标记在链格孢属部分种间应用有一定的局限性;基于序列ITS1-5.8S-ITS2聚类关系与其地理来源和寄主相关性不大。[结论]ITS序列分析法可为链格孢属的分子鉴定提供理论依据。     

大型艾美耳球虫18S rDNA部分序列测定与系统发育分析

从河北某兔场分离大型艾美耳球虫卵囊,CTAB法提取基因组DNA。利用艾美耳属球虫18S rDNA保守引物,PCR扩增大型艾美耳球虫18S rDNA片段,产物纯化后测序。将测得的序列用DNAStar软件分析并与GenBank中公布的11种兔球虫的相应序列进行同源性比较,绘制系统进化树。结果表明,扩增出大小约为1522bp的18S rDNA片段,序列分析显示河北株大型艾美耳球虫18S rDNA与GenBank公布的大型艾美耳球虫18S rDNA比对,同源性达99.6%;与国外的11种兔球虫相应序列同源性在92.4%～99.6%之间。     

基于ITS序列对3个侧耳菌种的分子鉴定

对实验室长期保存的3个侧耳（Pfeurottts）菌种核糖体DNA的ITS（intemal transcribed space）序列进行了PCR扩增,克隆测序后,与从GenBank中获得的相关序列一起构建了侧耳属系统发育树。结果显示,Pleurotus djamor CBS665．97与肺形侧耳（Pleurotus pulmonarus）的距离最近。Pleurotus ostreatus CBS596．96与红侧耳（Pleurotus djamor）的距离最近,Pleurotus dryinus ACCC51152与盖囊侧耳（Pleurotus cystidiosus）的距离最近。因此得出这三个菌种为命名错误．Pleurotus djamor CBS665．97应为Pleurotus pulmonarus CBS665.97,Pleurotus ostreatus CBS596．96应为Pkurotus djamor CBS596.96,Pleurotus dryinus ACCC51152应为Pleurotus cystidiosus ACCC51152。     

浙江地区不同寄主来源的炭疽菌ITS序列PCR-RFLP多态性分析

应用核糖体DNA (ribo-somal DNA,rDNA)的ITS( internal transcribed spacer,ITS)区的RFLP序列的多态性,分析32个不同寄主来源的炭疽菌株的遗传多样性.利用ITS1及ITS4通用引物对扩增各菌株的rDNA的内转录间隔区(ITS1-5.8S-ITS2)获得长约600 bp片段.ITS-RFLP共迁带UPGMA聚类分析的结果表明所有来自不同寄主的炭疽菌菌株(含福建及云南菌株)都以较高的相似系数(＞0.60)聚为一类,具有较近的 亲缘关系;同时试验中所有酶切位点的综合Gst系数达到0.82,说明不同菌株间的ITS具有丰富的多态性.     

辽宁营口地区锦鸡儿与树锦鸡儿根瘤菌遗传多样性研究

对锦鸡儿与树锦鸡儿根瘤菌进行研究,以了解其系统发育地位及遗传多样性。通过分离、纯化、回接结瘤测定共获得了31株待测菌,并采用16S rDNA PCR RFLP及BOX-PCR等方法对这些菌进行了研究。结果表明,31株待测菌的系统发育地位全部源于中间根瘤菌属（Mesorhizobium spp.）,并产生5种不同的rDNA图谱组合。BOX-PCR研究中,待测菌株呈现出较高的多样性,在80%相似性水平上,将待测菌归于17个不同的类型当中。     

16种平菇遗传关系的SRAP分析

为了确定不同来源的平菇遗传差异,利用相关序列扩增多态性(sequence-related amplified polymorphism,SRAP)分子标记技术,对安徽地区的16个平菇品种的遗传多样性进行了分析。筛选出24对随机引物组合,获得了627条清晰条带,平均每对引物产生26.1条。多态性条带共189条,占总条带数的30.1%,平均每对引物组合得到7.88条多态性条带。依据SRAP标记聚类,在遗传相似系数0.65的水平上,供试的16个平菇品种分为2个大类:Ⅰ和Ⅱ。Ⅰ类分为2个亚类:A类和B类,Ⅱ类也分为2个亚类:C类和D类。其中A类和D类各包括4个品种,B类中有3个品种,C类中有5个品种,从而在DNA水平上证明了所研究的平菇种质资源的遗传多样性。     

几种槭属植物亲缘关系的ITS序列分析

为了选择适宜挪威槭"皇家红"嫁接的砧木,笔者对槭属植物的8个种(含变种)核糖体DNA内转录间隔区(ITS)序列进行了PCR扩增和序列分析,扩增出约750bp左右的的序列(包含完整的ITS1、5.8S和ITS2序列及部分18S和26S rRNA基因片段.各样品的ITS1长度为221～236bp,ITS2为231～237bp,含有多个特异性信息位点.并利用ITS序列为依据对8种槭属植物系统发育进行分析,从分子水平上阐明了8种槭属植物的亲缘关系,为挪威槭"皇家红"嫁接生产中适宜砧木的选择提供了理论依据.     

Optimization of ITS rDNA Amplification for Fungi from Black Soil in North China

In order to optimize polymerase chain reaction(PCR) amplification of the internal transcribed spacer(ITS) rDNA region from fungi found in black soil in North China,an orthogonal experimental design [L16(45)] was used to evaluate five factors(template,Mg2+,dNTP,Taq DNA polymerase,and primer) from four levels.Subsequently,the optimal annealing temperature,annealing time,extension time and cycle numbers were evaluated.The results showed that the optimized PCR solution for amplification of ITS region comprised ...