东北地区大豆根瘤菌遗传多样性与系统发育研究

为明确我国东北地区大豆根瘤菌的系统发育地位及主要类群的分布情况,采用BOX-PCR、IGS PCR-RFLP、16SrDNA PCR-RFLP和16S rDNA基因序列分析法对分离自我国东北地区14个地点18个大豆品种的312株大豆根瘤菌及部分参比菌株进行了遗传多样性和系统发育分析。结果表明:供试菌株均为大豆慢生根瘤菌,以Bradyrhizobiumjaponicum为优势种;在IGS PCR-RFLP 72%和16S rDNA PCR-RFLP 76%相似性水平上,供试菌株可分别被分为6和4个群;在BOX-PCR 90%相似性水平上,可将供试菌株分为31个群,表明东北地区慢生大豆根瘤菌具有丰富的遗传多样性。综合考察各种分析结果发现,供试菌株的遗传多样性与其地理来源有一定的相关性,而与大豆品种间相关性不明显。     

柱花草根际土著根瘤菌的丰度及其遗传多样性

为研究我国柱花草根际土著根瘤菌在不同生态环境土壤中的丰度及其遗传多样性,分别在海南、广西、广东、云南、四川等柱花草的主要分布区域采集土样及根瘤,通过MPN法测定得到各种土壤中土著根瘤菌的丰度,并从采集的根瘤中分离获得的55份根瘤菌菌株进行16SrDNA全序列分析,与相关参比菌株的16SrDNA序列进行比对及聚类。结果表明,我国柱花草主要种植区域土著根瘤菌含量差异较大,每克干土中含量为0.7×102～7.5×106个,海南儋州区域的含量最高,广东湛江南亚所区域的含量最低;所分离出的菌株都属慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium sp.),在系统发育树上聚合为8大类群,初步确定55株柱花草根瘤菌的亲缘关系及分类地位。     

花生根瘤菌遗传多样性及高效固氮菌株的筛选

为揭示花生根瘤菌遗传多样性并筛选高效固氮菌株,本研究从山东省花生研究所莱西试验站的5个样点采集新鲜花生根瘤进行根瘤菌分离,对菌株的16SrRNA基因、持家基因(recA、atpD、glnII)序列进行系统发育分析以确定根瘤菌的系统发育地位,同时对共生基因nifH序列进行系统发育分析,并通过温室盆栽接种实验筛选高效共生固氮根瘤菌菌株。从5个采样点共分离到106株花生根瘤菌菌株,通过持家基因recA序列分析选定7株代表菌株。对代表菌株的16SrRNA基因与持家基因MLSA系统发育分析表明,所分离到的菌株分布于Bradyrhizobium的B.liaoningense、B.yuanmingense、Bradyrhizobiumsp.种群。同时,固氮基因nifH的系统发育分析结果表明,固氮基因高度保守,在系统进化树上分别与B.arachidis CCBAU 051107T、B.yuanmingense CCBAU10071T聚为两支。温室盆栽实验表明7株花生根瘤菌代表菌株均能与花生有效结瘤,其中代表菌株YIC61059共生固氮能力最强。结果分析表明,山东省莱西市花生根瘤菌遗传多样性较为丰富,其中B.liaoningense为优势种群。该地区的花生根瘤菌具有较好的结瘤和共生固氮能力,其中代表菌株YIC61059促生效果比较突出,具有良好的应用前景。     

莺歌海盐场30%盐度晒盐池底泥中可培养芽胞杆菌资源遗传多样性研究

采用80℃水浴处理与稀释涂布法从莺歌海盐场30%盐度晒盐池底泥中分离获得215株芽胞杆菌。采用16S rDNA PCR-RFLP与16S rDNA序列分析技术,对分离的菌株进行遗传多样性分析。16S rDNA PCR-RFLP酶切图谱UPGMA聚类分析结果表明,在100%的相似性水平上,分离菌株归属到9种酶切类型。16S rDNA测序结果显示,这些菌株主要分布在Pontibacillus、Halobacillus、Oceanobacillus和Bacillus等4个属,其中Pontibacillus为优势属。有7株芽胞杆菌的16S rDNA序列与数据库中相应模式菌的最大相似性在97.4%~99.0%之间,有可能为芽胞杆菌新种资源。     

不同改良处理对梅州离子型稀土矿废弃地大豆根瘤菌多样性的影响

为评价梅州离子型稀土矿废弃地不同土壤改良措施对大豆根瘤菌多样性的影响,通过nif H-PCR-DGGE技术对不同土壤改良处理条件下大豆根瘤菌群落的多样性进行表征。结果表明:7种不同土壤改良处理的DGGE图谱条带数目不等,位置各异,说明梅州离子型稀土矿废弃地大豆的根瘤菌群落结构受改良措施的影响较大,具有较强的可塑造性。其中T4处理(有机肥+生物炭+钝化剂)的条带数最多,多样性指数最高,说明该处理对增加大豆根瘤菌的多样性效果最好,可作为以后土壤改良的参考依据。聚类分析结果显示:7个处理可分为4个类群,CK单独为一个类群,T1(有机肥)、T2(有机肥+生物炭)为一个类群,T4(有机肥+生物炭+钝化剂)和T5(有机肥+菌剂+蚯蚓)为一个类群,T3(有机肥+钝化剂)和T6(有机肥+菌剂+蚯蚓+生物炭+钝化剂)为一个类群。生物炭与钝化剂组合处理、菌剂与蚯蚓的组合处理对增加大豆根瘤内根瘤菌的多样性效果较显著。通过序列比对和系统发育树可以看出,在梅州黄畲地区稀土采矿迹地,大豆主要与慢生根瘤菌属菌株共生结瘤,也可与中华根瘤菌属菌株共生。大豆根瘤内根瘤菌的多样性与土壤镉含量之间为显著正相关关系,与土壤有机质、氮、磷等营养指标之间为负相关关系,说明根瘤菌可能在提高大豆耐镉方面具有重要作用。     

南繁区稻瘟病菌遗传多样性和群体遗传结构的AFLP分析

【目的】为了明确南繁区稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)的遗传分化情况,【方法】采用AFLP分子标记技术对南繁核心区(三亚、乐东和保亭)和非核心区(琼中、屯昌和定安)共60个稻瘟病菌菌株的遗传多样性和群体遗传结构进行了比较分析。【结果】聚类分析表明,几乎所有菌株都聚在同一个谱系里,并且该谱系没有明显的亚群;群体遗传结构分析表明,核心区群体的多态性位点百分率、Shannon信息指数和基因流分别为87.89%、0.2738和4.2897,高于非核心区群体的81.37%、0.2703和3.5892;然而,核心区群体的Nei基因多样性指数和基因分化系数分别为0.1657和0.1044,低于非核心区群体的0.1662和0.1223。【结论】这些结果表明核心区和非核心区菌株都存在丰富的遗传多样性,不同群体间均存在较多的基因交流,但遗传变异均主要来自群体内;相比之下,核心区菌株的遗传多样性和遗传分化程度较高。     

胡椒属（Piper L.）分子系统学和遗传多样性的研究进展

胡椒属(Piper L.)作为胡椒科(Piperaceae)中遍布于热带地区的重要作物,含有近2 000个植物种类,目前集中分布于南亚、南美洲和中美洲。胡椒属内极高的物种多样性在传统的木兰亚纲(Magnoliidae)中显得尤为独特,为基部被子植物(Basal angiosperms)分化速率加快的机理研究提供了一个很好的例子;同时,属内还含有众多具有重要经济价值的香料作物和民族植物种类,如胡椒(Piper nigrum)和蒌叶(P.betle)等。因其具有重要的学术研究价值和经济利用价值,许多研究者一直致力于揭示其属内分子系统关系、栽培品种的遗传相似性和指纹图谱、特有物种的遗传分布特征等。本文就过去几十年胡椒属的分子系统学和遗传多样性研究进行了系统总结。目前胡椒属在胡椒科中的系统地位已经确认;胡椒属内的分子分类学框架已经基本建立;一些重要栽培品种的遗传多样性和鉴定也已明确。但仍存在一些亟待解决的问题:(1)胡椒属内的分类系统仍显粗糙,需进一步细化研究;(2)胡椒种质资源的指纹图谱库尚未建立;(3)一些特有和珍稀种类的种群遗传特征研究未得到足够重视。     

一种生物刺激素对大豆根际土壤微生物群落的影响

为研究生物刺激素(二苯基脲磺酸钙)对大豆根际土壤微生物群落的影响,采用中华费氏根瘤菌或不同浓度的生物刺激素对汾豆78进行浸种,田间条件下播种后在大豆花期时采集大豆根际土壤,并通过对比改良SDS法、TSAI法、生工试剂盒法和Mobile试剂盒法,选取效果最佳的Mobile试剂盒法进行土壤细菌DNA提取,对目的片段16S V3区进行特异性扩增,扩增产物用于后续高通量测序分析。结果表明:5个试验组与CK组相比,试验组Shannon数值下降。处理S2、S3、S4和S5与CK相比,变形菌门、放线菌门和拟杆菌门相对含量增加;酸杆菌门和硬壁菌门相对含量减少。试验还发现在属的水平上,一些对大豆生长有益和促进固氮的功能菌种有增加趋势。生物刺激素使大豆根际土壤微生物多样性下降;可以促进根瘤菌的生长,增加根际土壤微生物中根瘤菌的含量;同时生物刺激素还可以促进根际土壤微生物中功能菌属的数量,不仅促进大豆固氮,还促进大豆生长发育。     

海南芒果蒂腐病可可球二孢抗药性及遗传多样性分析

探索海南芒果蒂腐可可球二孢(Botryodiplodia theobromae)的抗药性、培养特性及遗传多样性的关系。以区分剂量法检测30个菌株对10种杀菌剂的敏感性,采用RAPD技术对菌株的遗传多样性进行分析。研究表明,芒果可可球二孢菌株对多菌灵、甲基硫菌灵、醚菌酯、嘧菌酯、吡唑醚菌酯、苯醚甲环唑和咪鲜胺锰盐7种杀菌剂产生了抗药性,抗性菌株比率(MR和HR)分别为66.67%、70.00%、90.00%、76.67%、53.33%、20.00%和16.67%。供试菌株的培养特性存在明显差异。应用6个随机引物对共扩增出64条带,DNA多态率高达90.6%,遗传距离在0.58~0.86,芒果蒂腐病菌遗传分化较大。在遗传距离为0.65时,可分为两个群,群Ⅰ分成3个类群,共有26个菌株,群Ⅱ分成2个类群。聚合类型与菌株的抗药性表现一致。菌株的致死温度与聚合类型、抗药性有一定的关联。     

水稻纹枯病菌拮抗芽孢杆菌的筛选及鉴定

为充分发掘利用水稻田已有的有益微生物资源,获得水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)的拮抗芽孢杆菌菌株,从四川农业大学水稻试验田中采集根际土样,采用稀释平板法在LB培养基上分离得到96株芽孢杆菌菌株。采用平板对峙法,将水稻纹枯病菌标准菌株R.solani AG1 IA与待测芽孢杆菌菌株共培养,得到1株对R.solani AG1 IA具有强拮抗作用的芽孢杆菌菌株Q9-0-1,并以形态学特征、生理生化特性为基础,结合gyr B基因序列分析,将其鉴定为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)。     

不同产区青稞根部可培养内生固氮菌的多样性研究

为认识青稞内生固氮菌群落组成,丰富内生固氮菌资源,明确产地对青稞内生固氮菌多样性的影响,本研究利用纯培养技术分别对在拉萨、林芝、日喀则栽培的藏青2000根部内生固氮菌进行分离、纯化,并测定各菌株的固氮酶活性及高固氮酶活性菌株的溶磷、溶钾及产IAA特性,最后,通过16SrDNA基因测序和构建系统发育树研究了高固氮酶活性菌株的分类学地位。结果显示,通过Ashby培养基分离、纯化得到内生固氮菌37株,其中,具有高固氮酶活性的11株,占总分离菌株27%,有6株菌株具有分泌IAA的能力,2株具有溶钾能力,1株具有溶磷能力。16S rDNA测序结果表明,11株高固氮酶活性的菌中,有5株菌属于Bacillus,为优势菌属,其余菌株分别属于Gemmatimonas、Sphingomonas、Devosia、Agrobacterium、Mesorhizobium和Burkholderia。     

16S rDNA序列分析法对香蕉根部内生细菌种群多样性初析

采用16S rDNA序列分析法对香蕉根部内生细菌种群多样性进行初步研究,随机选择12个阳性克隆测序。结果表明,该序列与未培养及可培养的芽孢杆菌、雷尔氏菌、伯克氏菌、戴尔福特菌、肠杆菌等细菌的序列同源性在97%～100%之间,说明香蕉根部存在大量未培养及可培养的内生细菌。     

小水榕茎部内生菌的分离及鉴定

采用稀释涂板法,对小水榕茎部的内生菌进行分离、纯化及16S rDNA鉴定,通过同源性比对构建系统发育树。结果表明：分离到的24株内生菌分别属于5个类群(Alphaproteobacteria、Gammaproteobacteria、Firmicutes、Bacteroidetes、Filimonas)的11个属(Phenylobacterium、Rhizobium、Caulobacter、Sphingobium、Paenibacillus、Staphylococcus、Bacillus、Pseudomona、Chitinophaga sancti、Filimonas、Agrobacterium),其中Alphaproteobacteria、Firmicutes为优势种群,占总数的45.8%;所有菌株与其同源菌株的相似性均在98% 以上。本研究有助于揭示小水榕茎部内生菌的多样性,为发掘其应用潜力提供参考资料。     

甘蔗茎部内生细菌的分离及分子鉴定

采用稀释涂板法对广东省广州市白云区国家农业科技园区内的甘蔗茎部内生菌进行分离,同时进行16S rDNA扩增检测及同源性分析。结果表明：共分离获得20株不同的内生菌,所获得的内生菌分属于6个类群（Actinobacteria、Alphaproteobacteria、Gammaproteobacteria、Betaproteobacteria、Firmicutes、Acidobacteriales）、16个属（Staphyococcus,Leifsonia、Kineococcus、Frondihabitans、Curtobacterium、Microbacterium、Amnibacterium、Methylobacterium、Rhizobium、Terriglobus、Sphingomonas、Acidisoma、Stenotrophomonas、Enterobacter、Burholderia、Variovorax）,其中,Actinobacteria和Alphaproteobacteria类群占总数的65％。除SC-4、SC-11与其同源细菌相似性分别为97％、96％外,其余分离菌与同源菌相似性均在98％以上。本研究结果在一定程度上反映了甘蔗茎部内生菌具有较高的多样性。     

甘蔗内生菌分离鉴定及功能多样性研究

为探究甘蔗内生菌多样性组成及相关特性,本研究采用稀释涂板法分离并结合形态观察和分子标记(gyrB,rpoB, ITS, 16S rDNA)进行鉴定。结果表明,从12个栽培品种(系)和5个野生种无性系的根、茎、叶组织中共分离到细菌589株、放线菌34株和真菌46株;细菌中固氮菌有41株,溶磷菌有98株,解钾菌有52株,对黄曲霉和禾谷镰刀菌具有拮抗作用分别有44株和35株。内生细菌分属21个属,其中芽孢杆菌属、伯克氏菌属、肠杆菌属和泛菌属为优势属;内生真菌分属于枝顶孢属、链格孢属、曲霉属、镰刀菌属、枝孢属等17个属,而放线菌仅为链霉菌属。具有潜在植物益生功能的菌株主要集中在芽孢杆菌属、伯克氏菌属、肠杆菌属、假单胞菌属、不动杆菌属、类芽孢杆菌属及泛菌属。本研究显示甘蔗栽培品种(系)和野生种无性系均含有丰富的内生菌资源,且栽培品种(系)所含内生菌在数量和多样性上均高于野生种无性系;12个栽培品种(系)间所分离到的内生细菌大部分相同,但也存在差异。通过初步的功能鉴定,筛选出一些具有应用潜力的益生微生物,为开发相应功能的生物菌剂奠定基础。     

油菜内生细菌多样性分析及菌株CanL-30生防潜力评估

为筛选防病促生的内生性细菌菌株，提高油菜的抗病性，对武汉地区甘蓝型冬油菜内生细菌进行了分离鉴定和多样性分析，同时对分离的内生细菌进行了拮抗菌株和促生菌株的筛选。结果表明：从采集到的油菜样本中共分离得到134株内生细菌，基于16S rDNA序列分析，发现这些菌株属于18个细菌属中的33个种，其中芽孢杆菌属、假单胞菌属和寡养单胞菌属占优势，分别占分离物总数的46.27%、15.67%和11.94%。油菜根、茎和叶内生细菌分离物的香农多样性指数分别为2.847、2.808和2.356，辛普森指数分别为0.956、0.939和0.907。经过平板筛选、离体叶片筛选以及活体油菜接种筛选，发现枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）菌株CanL-30对灰葡萄孢（Botrytis cinerea）、立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）和油菜黑胫病菌（Leptosphaeeria biglobosa）有拮抗作用，还具有稳定的抑制核盘菌的效果。进一步试验表明，菌株CanL-30主要通过产生抗真菌物质抑制核盘菌生长。研究还发现CanL-30能促进拟南芥和油菜生长。上述结果说明冬油菜存在丰富的内生细菌资源，从中可以筛选得到防病促生的细菌菌株。     

拮抗大豆疫霉菌植物内生细菌的筛选与鉴定

大豆疫霉根腐病是世界范围内危害严重的毁灭性大豆病害,筛选内生菌进行生物防治是未来该病害防治的重要发展方向。以大豆根系为材料筛选得到67株内生细菌,采用平板对峙生长实验,发现其中18株对大豆疫霉菌的菌丝生长具有抑制作用,其中以A2、A4、A7和B8效果最佳,抑制率分别达到72.8%、55.5%、76.0%和87.1%。利用无菌发酵滤液与大豆疫霉孢子共培养发现,A2和A4对孢子萌发具有明显抑制效果,抑制率达75.4%和85.8%。盆栽实验表明,A2和A4无菌发酵滤液能使经大豆疫霉孢子侵染后的大豆种子萌发率由63.1%分别提高到80.0%和80.3%,健康幼苗率由31.4%提高到45.7%和50.9%。根据16S rDNA序列系统发育分析,初步确定A2为假单胞菌(Pseudomonas sp.),A4、A7和B8皆为芽孢杆菌(Bacillus sp.)。     

桐花树内生细菌动态及拮抗植物病原菌菌株筛选鉴定

以荧光显微计数法和平板分离法分别对桐花树根茎叶内生细菌总量和可培养细菌数量进行周年动态初步测定,并对拮抗植物病原菌的可培养细菌菌株进行筛选鉴定。结果表明:桐花树根茎叶内均含有大量的内生细菌,其中根部内生细菌总量为0.88×107~49.67×107ind./g FW,7月份最大,叶部细菌总量为1.07×107~65.07×107ind./g FW,也以7月份最大,茎部细菌总量为1.1×107~19.73×107ind./g FW,以5月份最大;而根茎叶可培养细菌含量分别为1.02×103~13.18×103、0.13×103~11.24×103、0.31×103~10.36×103CFU/g FW,均以3月份数量最大,周年不同月份之间细菌总量和可培养细菌数量均差异显著。用平板对峙生长法,从86株可培养内生细菌中筛选获得1株对香蕉叶鞘腐败病菌、香蕉枯萎病菌、马拉巴栗茎腐病等植物病原菌均有较强拮抗作用的Aec23菌株,经形态、生理生化测试及16S rDNA序列比较分析,Aec23菌株初步鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。     

北部湾海绵（Siphonochalina flexa）共附生细菌多样性及抑甘蔗鞭黑粉菌活性研究

分离纯化广西怪石滩海域海绵可培养共附生细菌,分析其多样性并研究共附生细菌发酵产物对甘蔗鞭黑粉菌的抑制活性,为研发新型生物农药提供参考依据。采用8种培养基分离纯化海绵共附生细菌,运用16S rDNA测序方法进行菌种鉴定及多样性分析,采用牛津杯法测试细菌发酵产物对甘蔗鞭黑粉菌的抑制效果。经形态学分析及16S rDNA比对,海绵中共获得34株共附生细菌,隶属于18科24属。活性检测结果表示,存在14株对甘蔗鞭黑粉菌有抑制效果的菌株。海绵中可培养共附生细菌物种多样性丰富,部分菌株的发酵产物对甘蔗鞭黑粉菌具有较强的抑制效果,有成为新型生物农药的潜力。     

两株银杏内生拮抗细菌菌株的鉴定及生防功能基因研究

从表面消毒的银杏叶片中获得两株具有广谱拮抗活性的内生细菌菌株Zy25和Hy7；应用绿色荧光蛋白GFP基因标记该拮抗菌株,培养的菌液摩擦接种银杏叶片,分离结果表明两个菌株可在银杏叶片内稳定定殖；通过形态观察、生理生化指标测定及16S rDNA和DNA gyrase B subunit(gyrB)基因序列同源性分析,鉴定两个菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)；利用特异引物对菌株的生防功能基因进行扩增,结果表明:bmyB、fenD、ituC、srfAA、srfAB、bioA、yngG和yndJ基因簇的片段在两个菌株中均存在,表明生防菌株Zy25和Hy7可能具有合成脂肽类物质的能力.