枸杞苯丙氨酸解氨酶基因的克隆与表达分析

为研究枸杞苯丙氨酸解氨酶基因LcPAL在干旱和盐逆境中的作用,采用RT-PCR和RACE方法克隆了LcPAL基因(Genbank No.KX781247)。该基因cDNA长度为2 544bp,含有2 163bp的完整开放阅读框,编码720个氨基酸。蛋白序列分析表明,其包含典型的PAL酶活性中心序列(GTITASGDLVPLSYIA),与其他植物的PAL蛋白有很高的同源性。系统进化树表明,枸杞LcPAL与茄科植物的PAL蛋白聚为一类,说明两者的亲缘关系较近。利用实时荧光定量PCR方法检测发现,LcPAL基因在枸杞的叶中表达量最高,果实中表达量最少。其在聚乙二醇(PEG)、氯化钠(NaCl)胁迫下诱导表达,但表达模式不同。研究结果推测从枸杞中克隆获得苯丙氨酸解氨酶(LcPAL),是典型的PAL家族成员,在枸杞各组织发育过程中具有重要功能,且在枸杞抗干旱和抗盐逆境过程也起一定作用。     

百香果苯丙氨酸解氨酶基因PePAL克隆及表达分析

为探讨百香果中苯丙氨酸解氨酶（PAL）编码基因的序列结构和蛋白质功能,以台农1号百香果（Passiflora edulis Sims）为材料,以cDNA为模板对PePAL基因进行同源克隆,同时对PePAL编码蛋白质的结构及功能进行预测。结果表明,PePAL基因cDNA全长2 499 bp,含有1个完整开放阅读框（2 124 bp）,编码707个氨基酸,蛋白质分子质量为173.43 ku。利用ProtParam、SignalP 4.1软件及TMHMM等软件对PePAL蛋白的结构预测显示,该蛋白质是一个亲水性的非分泌型蛋白,无跨膜结构域,无信号肽。PePAL主要定位于细胞核、叶绿体、细胞质、细胞膜、线粒体、液泡等部位,其二级结构由α螺旋、延伸链、β转角及无规则卷曲组成。PePAL在不同品种百香果的同一结果枝上的表达模式均呈现花中表达量最高,其次是茎,在成熟叶中表达量最低。     

荸荠苯丙氨酸解氨酶基因的克隆和表达

【目的】克隆荸荠Eleocharis tuberosa苯丙氨酸解氨酶基因(PAL),分析其序列特征及其在荸荠不同组织中和鲜切荸荠贮藏过程中的表达情况,为揭示鲜切荸荠黄化机理提供理论依据。【方法】通过RT-PCR和RACE技术从荸荠中克隆PAL基因的cDNA全长,采用生物信息学方法对其序列和所编码的蛋白进行预测分析,利用荧光定量PCR技术分析PAL基因在荸荠不同组织和鲜切荸荠贮藏过程中的表达情况。【结果】克隆得到荸荠PAL基因全长cDNA,将其命名为CwPAL,该序列长度为2 485 bp,含有1个2 142 bp的完整开放阅读框,共编码713个氨基酸。CwPAL蛋白分子式为C3437H5514N944O1058S34,相对分子质量为78 079,等电点为5.97,原子总数为10 987个。CwPAL包含PAL-HAL和PLN02457结构域及典型的PAL酶活性中心序列(GTITASGDLVPLSYIAG)。CwPAL的二级结构以α–螺旋为主,其三维结构模型呈典型的"海马状"结构。系统进化分析表明,CwPAL与菠萝Ananas comosus和海枣Phoenix dactylifera的PAL蛋白亲缘关系较近。荧光定量PCR分析表明,CwPAL基因在荸荠皮中的表达量最高,鲜切荸荠贮藏过程中CwPAL基因表达量快速上升,水杨酸处理显著抑制了CwPAL基因的表达。【结论】Cw PAL属于典型的苯丙氨酸解氨酶家族,该基因可能通过调控苯丙烷代谢从而影响鲜切荸荠的黄化。     

甘蔗苯丙氨酸解氨酶基因（PAL）的克隆和表达分析

【目的】克隆甘蔗的苯丙氨酸解氨酶基因（PAL）,分析其序列特征及其在不同组织和5种胁迫条件下的表达情况,为此基因在甘蔗抗逆育种中的应用提供理论支撑。【方法】利用串联飞行时间质谱仪对差异表达蛋白质进行质谱鉴定分析,通过RT-PCR和RACE技术从甘蔗品种新台糖22号（ROC22）中克隆PAL,以生物信息学方法对其序列进行预测分析,利用real-time PCR分析PAL在不同组织和不同胁迫条件下的表达特性。【结果】克隆获得甘蔗PAL,命名为ScPAL,GenBank登录号为KC172559。该cDNA全长2 590 bp,含有1个2 115 bp的完整开放阅读框（ORF）,编码704个氨基酸。序列分析表明,其包含典型的PAL酶活性中心序列（GTITASGDLVPLSYIA）,与其它植物的PAL蛋白有很高的相似性。系统进化树分析显示,甘蔗ScPAL与高粱的PAL蛋白亲缘关系较近。real-time PCR分析表明PAL为组成型表达,在根中的表达量最高,是叶中表达量的66倍。其在低温（4℃）、聚乙二醇（PEG）、NaCl和H2O2四种外源胁迫下均诱导表达,但表达模式不同。【结论】从甘蔗品种ROC22中克隆获得苯丙氨酸解氨酶基因（ScPAL）,是典型的PAL家族成员,推测其参与了甘蔗抗黑穗病过程,且在甘蔗抗寒、抗旱和抗盐胁迫过程也起到某种作用。     

拟南芥苯丙氨酸解氨酶基因的克隆与表达分析

苯丙烷途径是植物体内广泛存在的次生代谢途径,此代谢过程中的第1个关键酶为苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonia-1yase,PAL)。苯丙氨酸解氨酶通过对基因的起始转录、频率的控制和对外界诱导因子的响应来调控基因的表达,并且其表达水平对于下游黄酮类物质的合成起着非常重要的作用。在一定条件下,苯丙氨酸解氨酶可利用其特殊的酶学性质逆向催化生产L-苯丙氨酸。通过一系列的生物信息学分析,确定拟南芥中苯丙氨酸解氨酶的存在,并进行基因的克隆及表达分析,为L-苯丙氨酸的生产提供新的物种来源。     

红叶芥低温胁迫下苯丙氨酸解氨酶活性及其基因的克隆表达

用8℃低温处理红叶芥四叶期植株,在低温处理的52 h内分别取样6次,取样后分别提取叶片总RNA,再利用RT-PCR克隆得到红叶芥PAL基因开放阅读框内1908 bp片段,核苷酸序列分析显示,红叶芥PAL基因与芜青PAL基因的同源性达到99%.半定量RT-PCR结果显示,在8℃低温胁迫下,红叶芥PAL基因表达量呈现先降低后升高的趋势,在处理18 h后达到最低点,随后迅速升高,这与PAL活性变化一致.

Abstract：

The 4-leaf seedlings of red-leaf mustard(Brassica juncea var.garrhiza Tsen et Lee)were exposed to low temperature(8 ℃)for 52 h,during which period leaf samples were taken 6 times for total RNA extraction.The open reading frame fragment that was generated by RT-PCR using specific primers was 1 908 bp.The cDNA from the leaves of red-leaf mustard was used as the template.Nucleotide sequence analysis showed that red-leaf mustard PAL gene shared 99% identity to that of Brassica napus.In response to the low-temperature stress in this experiment,the expression of PAL first dropped and then increased rapidly,being the lowest 18 h after the start of the treatment,a similar trend to that of PAL activity.     

红叶芥低温胁迫下苯丙氨酸解氨酶活性及其基因的克隆表达

用8℃低温处理红叶芥四叶期植株,在低温处理的52 h内分别取样6次,取样后分别提取叶片总RNA,再利用RT-PCR克隆得到红叶芥PAL基因开放阅读框内1 908 bp片段,核苷酸序列分析显示,红叶芥PAL基因与芜青PAL基因的同源性达到99%.半定量RT-PCR结果显示,在8℃低温胁迫下,红叶芥PAL基因表达量呈现先降低后升高的趋势,在处理18 h后达到最低点,随后迅速升高,这与PAL活性变化一致.     

芥蓝(Brassica alboglabra)苯丙氨酸解氨酶基因BaPAL的克隆、表达与序列分析

根据NCBI数据库中拟南芥、甘蓝型油菜和菘蓝的苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonialyase,PAL)基因序列设计简并引物,从芥蓝叶片cDNA中克隆到1个PAL基因,定名为BaPAL.BaPAL编码区全长2 145 bp,编码714个氨基酸,在NCBI的登录号为FJ849059.半定量RT-PCR结果表明,BaPAL基因在茎、叶、花蕾、开放花朵和嫩角果中均有表达,而且以开放花朵的表达量最大,根中未能检测到.BaPAL与其他植物PAL序列比对的结果表明:芥蓝与甘蓝型油菜、白菜的关系最为接近,与同科的菘蓝和拟南芥的关系稍远,但它们都处于同一进化分支;跟蕨类植物的同源性最低,亲缘关系最远.     

Hg~(2+)胁迫对小麦幼苗中蔗糖酶和苯丙氨酸解氨酶活性的影响

为了研究汞对小麦幼苗叶片、根和萌发种胚的蔗糖酶(Inv)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的影响,采用水培法,用不同浓度的Hg2+对小麦进行浸种处理,测定小麦在不同时间和不同器官的Inv和PAL活性,结果表明,随着Hg2+浓度的递增,小麦幼苗叶片、根和萌发种胚中,酸性和中/碱性Inv的活性都呈先上升而后下降的趋势,小麦幼苗叶片、根和萌发种胚的PAL的活性也呈先上升而后下降的趋势。不同器官的两种酶活性相比,快速生长的叶片和根部的酶活性都比萌发种胚的高。低浓度Hg2+(≤0.100 mmol/L)对小麦幼苗的Inv和PAL活性有短暂的促进作用,高浓度Hg2+(≥0.200 mmol/L)对Inv和PAL活性有显著的抑制作用。当Hg2+浓度为0.100 mmol/L时,各种Inv和PAL活性达到最大,由此推断,此浓度是影响小麦幼苗生长的阈值浓度。     

油松苯丙氨酸解氨酶基因的克隆与序列分析

利用同源克隆的方法,从油松(Pinus tabulae ormis)中克隆得到苯丙氨酸解氨酶(PAL)基因的cDNA和DNA序列,cDNA序列全长2 157 bp,编码718个氨基酸,包含有完整的ORF,命名为TaPAL(GenBank登录号:JX280460).通过核苷酸序列多重比较表明,TaPAL基因与其他植物PAL基因高度同源,预测的蛋白序列包含与水稻、玉米PAL相同的脱氨基位点和催化活性位点.PAL系统进化树显示,TaPAL与松科类植物PAL聚类关系最近.另外,对比发现TaPAL基因组DNA序列与cDNA序列完全一样,表明该基因无内含子.     

尾叶桉苯丙氨酸解氨酶基因的克隆、表达与单核苷酸多态性分析

【目的】通过获得尾叶桉Eucalyptus urophylla苯丙氨酸解氨酶(PAL)基因序列,分析其在不同水肥处理下的表达模式及在尾叶桉群体中的单核苷酸多态性(SNP),为研究该基因与尾叶桉抗逆性的相关性提供基础。【方法】根据巨桉E.grandis的PAL基因序列设计引物,通过基因克隆、测序获得尾叶桉PAL基因序列;采用逆转录定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)分析该基因在不同水肥处理下的表达模式。【结果】PAL基因组全长4 507 bp,包括166 bp的5′非编码区、411 bp的3′非编码区、2 172 bp的氨基酸编码序列(由2个外显子组成,分别为422和1 750 bp)和1 759 bp的内含子区域。PAL基因在AT4处理中表达量最高,在AT5处理中表达量最低。尾叶桉PAL基因与巨桉具有高度相似性。尾叶桉PAL基因的SNP位点主要集中在内含子区域,可见尾叶桉PAL基因在长期进化过程中保持着稳定的遗传。【结论】获得尾叶桉PAL基因全长4 507 bp,该基因具有遗传稳定性,且可能在尾叶桉抗逆性中起重要作用。     

大麦苗期抗旱性鉴定及评价

为了了解20份大麦(Hordeum vulgare L.)种质材料抗旱性差异,采用温室模拟干旱胁迫-复水法,对其苗期的相对含水量、相对电导率、叶绿素含量、丙二醛含量、超氧化物歧化酶和株高等8个抗旱指标进行测定,利用相关分析、聚类分析研究了各项指标与种质材料抗旱性关系,综合评价其抗旱性。结果显示：叶片相对含水量与株高呈显著正相关,其余各指标间没有显著的相关性;以采用欧式距离法综合分析结果为依据,可将20份种质材料划分为3个抗旱等级,相对抗旱包括陇麦1号、新引D5、Z126V004W、新引D9、PREJTGE、SCARLETT、Z02751407、韭崎12号、Z127U016V、MAURITIA,中等抗旱包括 J13-80、新引D7、PASADENA、NCF-TIPPLE、甘啤6号,相对敏感包括黑引瑞、Z200V017W、新啤12号、BEATRIX、Z204V021W。     

枸杞查耳酮异构酶LcCHI1基因的克隆与表达分析

为探究枸杞查耳酮异构酶CHI1基因在不同组织中的表达模式和功能,利用同源克隆的方法获得1个枸杞（Lycium chinense）LcCHI1基因（Genbank No. OR026273）,通过生物信息学方法分析其理化性质、结构及进化关系,利用荧光定量PCR（qRT-PCR）技术对其组织表达的特异性进行分析,并进行原核表达分析。结果表明：1）枸杞查耳酮异构酶LcCHI1基因的cDNA序列全长695 bp,开放阅读框为633 bp,编码210个氨基酸,含有１个保守的Chalcone_3 family结构域。2）氨基酸序列比对显示,LcCHI1蛋白符合Chalcone蛋白结构特征且与其他物种Chalcone蛋白具有高度的相似性。聚类分析表明,LcCHI1蛋白与茄科的CHI蛋白单独聚成一支。3）LcCHI1在枸杞花、嫩叶与嫩枝中表达量较高,在根中表达量较低。随着枸杞果实的发育,LcCHI1表达呈先升高后降低趋势,在变色果中表达量最高。4）在原核表达载体中构建LcCHI1重组蛋白,经SDS-PAGE电泳分析在63 ku处出现表达蛋白。综上,LcCHI1基因在枸杞花和变色果中表达较高,并能进行原核蛋白表达,研究结果为枸杞类黄酮合成途径中CHI基因的功能验证奠定基础。     

草鱼JAK2基因片段序列的克隆及其组织表达分析

通过实时荧光定量PCR(RT-PCR)法从草鱼肝脏中首次克隆获得草鱼JAK2基因的片段序列。该片段序列长671 bp,编码223个氨基酸,氨基酸序列分析表明草鱼JAK2基因片段与其他物种的相似性在70%～91%之间;系统进化树显示,鱼类的JAK2独立聚成一支,草鱼与斑马鱼聚成一支,与鳜鱼和墨绿凹鼻鲀聚成的一支再聚成一支。实时荧光定量PCR分析表明,草鱼JAK2基因在肝脏、肌肉、脑、心脏、脾脏和肠系膜脂肪组织中均有表达,其中在肝脏组织中表达量最高,显著高于其他组织(P<0.05),其次是肌肉、脑、脾脏和肠系膜脂肪组织,在心脏组织中表达量最低,且显著低于其他组织(P<0.05)。本研究为进一步研究草鱼JAK2基因的结构和功能奠定了基础。研究亮点:JAK2基因在鱼类上的研究报道甚少。本研究首次克隆了草鱼JAK2基因片段序列;且发现JAK2基因在肝脏组织中表达量最高,心脏组织中表达量最低,为草鱼JAK2基因的结构及其信号转导等生理功能的深入研究奠定了基础。     

银中杨DREB基因的克隆及表达

【目的】克隆银中杨抗逆转录因子DREB基因,为其功能的深入研究奠定基础。【方法】根据DREB AP2/EREBP保守区设计1对简并引物,采用PCR方法对银中杨（Populus albaxp）转录因子DREB基因中间片段进行克隆;再利用反向PCR方法对该基因的旁侧序列进行克隆,最终将两侧序列与中间片段拼接得到基因全长;同时,根据基因序-列设计1对特异引物,利用荧光定量PCR分析银中杨DREB基因在不同逆境胁迫中的表达情况。【结果】成功地从银中杨中克隆到1个DREB基因,命名为PaDREB（注册号：EF582843）。该基因序列长935 bp,ORF为819 bp,编码272个氨基酸;同源性比较与系统发育分析证实,银中杨DREB属于DREB转录因子家族,并与月季DREB2C具有较高的同源性;荧光定量PCR检测结果显示,盐、低温、干旱及ABA均能诱导DREB基因的表达。【结论】首次从银中杨中分离并克隆了DREB基因,并证实其参与了银中杨对盐、低温、干旱及ABA的应答。     

安氏隐孢子虫ABC2基因的克隆表达与营养物质转运

为探究安氏隐孢子虫(Cryptosporidium andersoni)ATP结合盒转运蛋白基因(CaABC2)对营养物质的转运功能,以安氏隐孢子虫基因组作为模板,设计合成CaABC2基因特异性引物,进行PCR扩增,获得CaABC2基因。将克隆的重组质粒CaABC2基因与真核表达质粒pEGFP-C1双酶切后再连接,构建重组真核质粒载体pEGFP-C1-CaABC2;再采用脂质体转染法将重组质粒pEGFP-C1-CaABC2转入小鼠肠上皮细胞(Intestinal epithelial cells,IEC),检测不同组IEC细胞对总胆固醇、还原型谷胱甘肽、葡萄糖和碱性磷酸酶的转运效果。结果表明:扩增出778bp的CaABC2基因,测序分析与预期片段大小一致;重组真核质粒载体pEGFP-C1-CaABC2转染小鼠IEC细胞后,观察到转染后的对照组和转染组IEC有绿色荧光;检测到在细胞内液中,转染组、对照组和空白组的总胆固醇浓度分别为15.99±0.12、11.80±0.35和12.43±0.16 mmol/L;还原型谷胱甘肽浓度分别为15.24±0.44、10.48±0.35和11.04±0.75mmol/L;在细胞外液中,转染组、对照组和空白组的总胆固醇浓度分别10.67±0.17、14.82±0.06和15.84±0.17 mmol/L;还原型谷胱甘肽浓度分别为10.20±0.79、14.60±0.45和15.60±2.50mmol/L。转染组总胆固醇、还原型谷胱甘肽浓度均显著大于空白组和对照组(P0.05),而在细胞外液中,转染组总胆固醇、还原型谷胱甘肽的浓度均显著小于空白组和对照组(P0.05)。在细胞内液和外液中,空白组与对照组总胆固醇、还原型谷胱甘肽的浓度之间均未见显著性差异(P0.05);转染组、对照组和空白组之间的葡萄糖和碱性磷酸酶浓度均没有统计学差异(P0.05)。CaABC2基因具有协助转运总胆固醇、还原型谷胱甘肽、葡萄糖和碱性磷酸酶的作用,其中转运总胆固醇效果最为明显。     

胡杨PeXTH基因的克隆及其转基因烟草的抗镉性分析

【目的】克隆胡杨木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因PeXTH,并研究该基因和植物抗Cd2+性之间的关系。【方法】利用RT-PCR方法从胡杨中克隆一个木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因PeXTH,将该基因的全长cDNA克隆到植物表达载体pGreen0029上,然后通过农杆菌介导法,将重组表达载体转入烟草,并对转基因烟草的抗Cd2+能力进行初步分析。【结果】PeXTH基因的开放阅读框(ORF)长867bp,含ATG起始密码子和TAG终止密码子,编码由288个氨基酸组成的蛋白;多重氨基酸序列比对结果显示,PeXTH蛋白含有木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶(XTHs)的保守催化活性域DEIDFEFLG和N-糖基化位点NLSG;Real-Time PCR检测结果表明,PeXTH基因已经成功在2个转基因株系(L6和L14)中过表达;Cd2+胁迫后,转基因烟草根组织中积累的Cd2+含量显著高于野生型,而叶组织中积累的Cd2+含量明显低于野生型;Cd2+胁迫下,转基因烟草叶片的相对电导率显著低于野生型,但抗氧化酶活性、营养元素含量、叶片净光合速率和蒸腾速率等生理指标都要明显高于野生型。【结论】PeXTH基因的过表达提高了烟草对Cd2+的抗性,为进一步深入研究PeXTH基因在植物抗Cd2+机制中的作用奠定了良好基础。     

青稞酸性磷酸酶基因HvnACP2克隆和亚细胞定位研究

为了探索青稞酸性磷酸酶基因 HvnACP2的基因和蛋白结构特点,为青稞磷吸收利用机制研究提供基础。以青稞‘肚里黄’叶片为材料,根据植物基因组数据库Gramene中的大麦 HvACP2基因和启动子区域序列设计引物,通过PCR获得青稞 HvnACP2基因和启动子区域序列。采用生物信息学软件对 HvnACP2基因启动子区域元件以及蛋白理化性质、跨膜结构、磷酸化位点、信号肽、二级、三级结构进行分析。结果表明： HvnACP2有2个外显子和1个内含子,启动子区域有与分生组织、光响应、厌氧、茉莉酸和脱落酸相关的顺式作用元件。HvnACP2蛋白由454个氨基酸组成,分子质量为51 285.15 u,总原子数为7 058,亲水系数为-0.451,理论等电点为6.17,不稳定指数34.54,脂溶性指数为67.05。具有12个磷酸化位点和信号肽,不具有跨膜结构。 HvnACP2中α螺旋、延长链、β转角、无规则卷曲所占比例分别为18.72%、53.96%、23.57%、3.74%。 HvnACP2和其他物种的同源蛋白都有紫色酸性磷酸酶N末端结构域和金属酸性磷酸酶结构域,将 HvnACP2与其他植物的氨基酸序...