海岛棉转录因子基因GbTCP27的克隆及表达特性分析

为探究转录因子GbTCP27在棉花纤维发育中的作用,使用RT-PCR技术从海岛棉‘新海21号’中克隆GbTCP27,并对其进行生物信息学和表达特性分析。结果表明,该基因有1个1 017 bp的开放阅读框,编码338个氨基酸,预测分子量约为35.37 ku,等电点为9.08,分子式为C_(1549)H_(2511)N_(439)O_(483)S_(11),序列中含有一个高度保守的TCP结构域;氨基酸序列对比表明,海岛棉GbTCP27基因在进化过程中是相当保守的,蛋白序列与其他植物中的TCP蛋白序列有较高的一致性;亚细胞定位结果显示,GbTCP27属于核定位基因,推测GbTCP27可能在复制和转录的过程中发挥作用;进化树分析表明,海岛棉GbTCP27基因与亚洲棉GaTCP9基因分布在同一分支上;实时荧光定量PCR表明,GbTCP27基因在开花当天的花瓣和开花当天的胚珠中表达量最高;综上所述,GbTCP27转录因子可能参与棉花纤维起始期胚珠表皮细胞的发育。     

海岛棉GbTCP5基因沉默和过量表达载体的构建及拟南芥转化

海岛棉具有优良的纤维品质,TCP蛋白参与细胞生长和增殖调控,本研究构建海岛棉GbTCP5基因沉默和过量表达植物表达载体。以GbTCP5基因pGEM-T Easy-GbTCP5质粒为模板进行PCR扩增,并将该基因构建到植物表达载体pCAMBIA3301中,利用冻融法转入农杆菌GV3101菌株,通过农杆菌浸染法转化拟南芥植株,初步证明已获得转化海岛棉GbTCP5基因的拟南芥。利用重叠PCR方法替换拟南芥AtMIR319的成熟链和互补链序列,构建含有amiRTCP5前体的植物表达载体amiRTCP5-pCAMBIA3301,为深入研究海岛棉GbTCP5基因的生物学功能奠定基础,为研究棉花纤维发育机制提供理论依据。     

海岛棉与陆地棉纤维C4H1基因克隆及表达分析

[目的]研究海岛棉与陆地棉纤维不同发育时期C4H1基因的表达和结构差异.[方法]分别从海岛棉和陆地棉纤维中克隆C4H1基因的cDNA全长,并利用DNAMAN、MEGA3.1等软件进行C4H1基因的生物信息学分析;采用半定量和实时荧光定量PCR方法,比较海岛棉和陆地棉不同发育时期的棉纤维中C4H1基因的表达水平.[结果]C4H1基因在海岛棉与陆地棉纤维发育不同时期表达具有差异,海岛棉中该基因的表达高峰期在20 DPA,而陆地棉中该基因的表达高峰期在15 DPA.该基因的核酸序列在两种棉花中存在差异,并导致其编码蛋白的氨基酸序列也存在差异,且海岛棉C4H1蛋白中Thr(苏氨酸)含量高于陆地棉,蛋白等电点也耍高于陆地棉.[结论]海岛棉中C4H1基因的表达高峰期晚于陆地棉,两个棉种C4H1蛋白氨基酸序列的差异可能导致其理化性质及生物学功能的改变,为发掘海岛棉纤维品质优异基因奠定了基础.     

海岛棉GbHCT基因的表达分析

通过海岛棉基因组数据库和GSDS 2.0在线生物信息学软件,分析GbHCT基因的结构,利用实时荧光定量PCR技术,检测GbHCT基因在海岛棉不同组织和棉纤维不同发育时间的表达量。结果表明,该基因DNA序列长度为1 953bp,开放阅读框长度为1 311bp,编码436个氨基酸,在海岛棉基因组中对应scaffold3453序列,含有1个内含子和2个外显子。GbHCT基因在不同组织和纤维发育不同时期中均有表达,在各个组织中,苞叶和花中表达量最高,在棉纤维不同发育时期开花后5d和25d表达量最强。该基因可能参与棉纤维发育伸长期和次生壁增厚期。为深入研究该基因的功能,构建植物表达载体pEGAD-GbHCT并转入根癌农杆菌,为下一步研究奠定试验基础。     

棉铃虫核型多角体病毒ORF44基因的序列分析及原核表达

棉铃虫核型多角体病毒(HearNPV)ORF44是一个功能未知的基因,研究对HearNPV ORF44基因的序列及原核表达进行了初步研究。结果表明,HearNPV ORF44基因全长1 137 nt,编码378aa,预测编码蛋白分子量为42.7 ku。序列分析显示,ORF44具有双相启动子特征序列,同时兼有杆状病毒早期和晚期基因转录启动子特征序列。ORF44的推导氨基酸序列中含有1个强跨膜螺旋区域,32个磷酸化位点和4个糖基化位点。除HzNPVORF45外,未发现与ORF44氨基酸同源性高于30%的基因。构建了pET-44表达载体,并在大肠杆菌BL21中得到了高效表达,表达的融合蛋白分子量为44 ku,与预测编码蛋白分子量大小相符。序列分析结果表明,ORF44是He-arNPV的一个特有基因,ORF44融合蛋白的成功表达为深入研究HearNPV ORF44奠定了基础。     

海岛棉H268 PPR蛋白家族基因鉴定及SNP/InDel分析

[目的]通过对海岛棉不育系H276A及其育性恢复材料H268进行三角状五肽重复蛋白(PPR)家族基因鉴定及比对分析,获得序列存在差异的PPR基因,为后续育性恢复基因(Rf)的发掘提供理论基础.[方法]通过生物信息学分析海岛棉PPR基因,并对其进行亚细胞定位预测与功能注释分析;采用Illumina HiSeq 4000高通量测序技术对海岛棉H276A及H268对PPR蛋白家族基因进行转录组测序,将筛选获得的PPR蛋白与其他植物具有育性恢复的PPR蛋白进行氨基酸序列同源比对并构建系统发育进化树.[结果]鉴定获得912个PPR基因,其中有846个在海岛棉H276A和H268间存在序列差异,且分别存在7226个SNP差异位点和301个InDel差异位点,其中作用于线粒体的PPR基因有2143个SNP差异位点和134个InDel差异位点.转录组测序结果显示,共检测到表达基因数量为68197个,其中已知基因56311个、新基因11886个,可满足后续数据分析.GO功能注释结果显示,PPR基因主要富集于生物学过程,富集于分子功能的PPR基因最少.50.0%PPR蛋白定位于线粒体,29.0%PPR蛋白定位于叶绿体,0.9%PPR蛋白定位于细胞核,20.0%PPR蛋白定位于胞外,0.1%PPR蛋白定位于细胞质膜.xp_016708712(LOC107923023)和xp_016710013(LOC107924193)与多个具有育性恢复功能的PPR蛋白氨基酸序列相似性达33%,说明二者亲缘关系较近,且亚细胞定位于线粒体.[结论]xp_016708712和xp_0167100132个PPR蛋白可能与海岛棉不育系H276A育性恢复相关,可用于发掘海岛棉CMS的Rf基因.     

油桐种子FADX基因的克隆和序列分析

[目的]克隆油桐种子FADX基因全长cDNA。对该基因作生物信息学分析,为进一步研究该基因的功能提供参考。[方法]以未成熟的油桐种子为材料,利用改良TRIzoL法提取总RNA,并根据GenBank中已经登录的α桐酸合成酶基因FADX的序列,设计特异性引物;采用RTPCR方法,克隆得到FADX基因全长cDNA,应用Antheprot软件和InterProScan对该基因进行了生物信息学分析。[结果]该序列5'端和3'端非编码区序列长度分别为13、47 bp,含有1个开放阅读框(14～1 174 bp),编码386个氨基酸,含有典型的脂肪酸脱氢酶结构域;相对分子量是44 343.0,理论等电点为8.33。二级结构预测表明,该蛋白α螺旋含量占29%,β折叠占32%,转角占6%。[结论]该蛋白属于脂肪酸脱氢酶。     

海岛棉GbMYB25基因的克隆及表达分析

根据陆地棉GhMYB25的序列,设计1对引物,通过RT-PCR技术从海岛棉品种新海21号中克隆了1个同源基因,命名为GbMYB25。GbMYB25基因具有1个930bp的开放阅读框,编码309个氨基酸,预测分子量约为34.762ku,等电点为8.08,推测的氨基酸序列中含有2个高度保守的SANT结构域。GbMYB25基因序列包含2个内含子。氨基酸序列比对表明,该蛋白和其他高等植物的MYB蛋白有较高的同源性。进化树分析表明,GbMYB25基因和陆地棉GhMYB25基因处在同一进化树分支。亚细胞定位表明GbMYB25基因在细胞核中表达,实时荧光定量PCR结果表明GbMYB25基因在胚珠(0doa)、纤维(5dpa)和叶片中的表达量较高。以上结果表明,GbMYB25转录因子可能参与棉花纤维发育。     

海岛棉GbPR10基因的克隆及其抗枯萎病表达分析

【目的】为棉花抗枯萎病分子育种的基因来源提供依据。【方法】根据前期转录组测序和抗病表达数据,从棉花EST数据库中筛选出抗枯萎病有关的基因(登录号为CD486053)序列,在NCBI搜索与该基因同源性为94%的海岛棉抗病相关PR10基因(登录号为AY588276)并设计引物,从枯萎病接菌的抗病海岛棉材料“06-146”克隆一个海岛棉同源基因,命名为GbPR10基因。进行生物信息学和在枯萎病菌、乙烯、水杨酸处理下基因表达量分析。【结果】GbPR10基因有480 bp的ORF序列,编码159个氨基酸。该蛋白序列中具有PR10蛋白特有的Bet-v1结构域和改变的甘氨酸环P-Loop(GXGGXG)。蛋白质序列同源比对表明该蛋白与其他生物PR10蛋白有较高的一致性。亚细胞定位预测表明GbPR10分布于细胞质。qRT-PCR表达分析表明,GbPR10基因在不同抗病海岛棉品种的不同组织上表达量不均匀而较高于感病海岛棉品种;在乙烯和水杨酸处理的1对抗/感海岛棉根系中,抗病品种出现先上调后下调趋势,感病材料后期诱导表达,抗病品种的表达量几乎高于感病品种。【结论】GbPR10基因在海岛棉抗枯萎病信号途径中起重要作用。     

家蚕新基因Bmsop2结构及近端启动子的生物信息学分析

利用网络生物信息学资源对获得的家蚕新基因Bmsop2的结构和5'端非翻译区进行分析和预测,结果表明,该基因是大小为4.6 kb,含有2个内含子和3个外显子的结构,通过cDNA的序列推测该基因编码蛋白的一级结构,二级结构和三级结构,并且预测该基因5'上游启动子调控元件及蛋白结合位点等信息,为进一步解读该基因的功能奠定基础.     

兰州百合和有斑百合的核型研究

【目的】研究兰州百合及有斑百合的染色体核型。【方法】利用染色体常规压片的方法,对兰州百合和有斑百合的染色体数目及核型进行了研究和分析。【结果】兰州百合的核型公式为2n=2x=24=2m+2sm+6st+14t,相对长度为6.35%～12.07%,核型不对称系数为83.25%,染色体相对差异较大。有斑百合的核型公式为2n=2x=24=4m+12st+8t,相对长度为6.11%～12.90%,核型不对称系数为80.11%。【结论】兰州百合的核型类型属于3A型,有斑百合的核型类型为3B型,以有斑百合核型的进化较高,可见不同居群的百合间核型存在差异。     

二色胡枝子黄酮体外抗氧化活性

通过二色胡枝子黄酮(Lespedeza bicolor flavonoids ,LBF)清除羟自由基、超氧阴离子的效果及抑制猪油、菜油和亚油酸的自氧化来研究其体外抗氧化作用.结果表明:二色胡枝子黄酮对清除自由基有显著作用,且清除率随黄酮浓度的增加而增大;能够明显地抑制猪油、菜油、亚油酸的自氧化,抑制作用随浓度的增大而增强.作为天然的抗氧化剂,二色胡枝子黄酮具有一定开发利用价值.     

沙门菌、巴氏杆菌和大肠埃希菌多重PCR检测方法的建立

旨在建立一种可以应用于临床样本同时检测沙门菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌感染的多重PCR方法。根据NCBI上已收录的沙门菌hut基因、多杀性巴氏杆菌 kmt1基因和大肠埃希菌23SrRNA基因的全基因序列,设计并合成3对特异性引物,通过优化多重PCR反应条件,建立能够同时检测3种细菌混合感染的多重PCR诊断方法。特异性分析表明,应用该方法可以从沙门菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌以及3种细菌的混合物中扩增出3条大小分别为286 bp、457 bp和652 bp的特异性条带,其他对照组检测结果均为阴性;敏感性分析表明,该方法对沙门菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌的最低检出量分别为1.77×10　、1.99×10　、2.01×10　 CFU/mL;人工模拟感染样本检测表明,该方法能从混合感染的病料中检测出3种病原菌。可见：所建立的多重PCR方法具有特异性强,敏感度高,稳定性好的特点,可以有效检测沙门菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌的混合感染。     

山葡萄C4H基因的克隆表达及遗传转化分析

通过生物学技术来研究C4H基因在山葡萄着色过程中的作用,进而揭示山葡萄果皮着色的分子机理;利用RT-PCR技术克隆了山葡萄C4H基因的全长cDNA序列,并对该蛋白进行生物信息学分析,预测其功能;利用实时荧光定量PCR检测C4H基因在山葡萄8个不同转色时期的表达量,将克隆获得的山葡萄C4H基因完整的ORF连接到原核表达载体pET28a上,转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3),并通过不同浓度的IPTG诱导表达, SDS-PAGE检测表达产物.为了验证山葡萄C4H基因的功能,构建了表达载体pC C4H并转化农杆菌GV3101.用菌液浸泡花序法对拟南芥进行遗传转化,在含50 mg/L Kan的培养基上对T_0代种子进行筛选.克隆获得的山葡萄C4H cDNA全长1 735 bp,开放阅读框1 518 bp,编码505个氨基酸,该基因表达产物分子质量为57.70 KDa,等电点值9.06.C4H基因在山葡萄果皮转色各个时期均存在表达;该基因原核表达产物与预期大小一致,表明原核表达成功,拟南芥遗传转化先后得到3个阳性幼苗.对移栽成活的2株抗性植株进行PCR检测为阳性, 2株叶片颜色均变成紫红色;经花色素苷质量浓度的测定表明其质量浓度比对照组植株高出3倍.在拟南芥中花色素苷质量浓度虽然较低,但还是能少量合成,说明其花色素苷生物合成途径是开通的,只是积累的量较少.     

加州新小绥螨对截形叶螨的捕食作用

为明确加州新小绥螨Neoseiulus californicus(McGregor)对截形叶螨Tetranychus truncate(Ehara)的捕食潜力,采用捕食者功能反应方程及参数研究加州新小绥螨对截形叶螨各螨态捕食作用。结果表明,加州新小绥螨对雌成螨、若螨、卵的选择性捕食系数分别为0.365、1.276和1.390。在不同温度条件下,加州新小绥螨对截形叶螨的功能反应均属于HollingⅡ型;对猎物卵和幼若螨的控制能力最强。在试验温度范围内,加州新小绥螨的捕食能力随温度升高呈先增后减趋势,28℃时最强,对截形叶螨雌成螨、若螨和卵的攻击系数(a)最大,分别为0.639、0.730和0.842;处理时间最短,分别为0.126、0.075和0.039d;最大日捕食量分别为7.943头、13.405头和25.575粒。加州新小绥螨的捕食作用存在较强的种内干扰反应,随着捕食者密度的增大,平均捕食量逐渐减少,捕食作用率也相应降低,捕食作用率与其自身密度的关系为E=0.423P-0.747。     

美洲棘蓟马体内共生菌Wolbachia的wsp基因分子检测及系统发育分析

【目的】对美洲棘蓟马体内共生菌Wolbachia进行分子生物学鉴定,确定该蓟马体内Wolbachia的进化位置,为进一步探讨Wolbachia对其生殖作用的调控机制提供理论依据。【方法】以wsp基因为目的基因,对美洲棘蓟马体内的共生菌Wolbachia进行特异性扩增和测序,使用Clustal X 1.83软件对所得DNA序列进行比对;在MEGA 4.0软件中采用邻接法对Wolbachia的系统发育关系进行分析。【结果】利用wsp基因的特异性引物从美洲棘蓟马体内扩增出了632 bp的Wolbachia的wsp基因片段(GenBank登录号为JN315668),580 bp的Wolbachia A群的wsp基因片段和405 bp的Mel亚群的wsp基因片段。系统发育分析结果表明,美洲棘蓟马体内的Wolbachia与黑腹果蝇亲缘关系较近。【结论】美洲棘蓟马体内感染的Wolbachia属于A群Mel亚群。     

甘蓝型油菜与黑芥双倍体减数分裂的原位杂交分析

【目的】探明植物杂种后代减数分裂异常与花粉败育之间的关系。【方法】通过甘蓝型油菜与黑芥种间杂交和基因组加倍,获得芸薹属三基因组双倍体,采用基因组原位杂交方法,观察三基因组双倍体花粉母细胞的减数分裂规律。【结果】与单倍体相比,双倍体花粉育性得到一定恢复,但可育花粉的比例较低,只有10%~20%。基因组原位杂交结果显示,双倍体花粉母细胞减数分裂终变期染色体以形成同源二价体为主,但也有部分染色体形成四价体或六价体。四价体有3种形式:B基因组染色体形成的四价体、AC基因组染色体形成的四价体及B与AC基因组之间形成的异配四价体。减数分裂后期Ⅰ染色体均等分离的细胞占总数的70%左右,在第2次减数分裂期也观察到非正常分裂如非四分孢子、微核等现象。【结论】减数分裂过程中的染色体异常行为可能是导致花粉育性不高的重要原因;虽然不正常的减数分裂导致花粉育性下降,但双亲染色体的异源联会可为双亲遗传物质的交换提供条件。     

细粒棘球蚴重组St-Eg 95-Eg.ferritin疫苗构建及生物学特性检测

构建表达细粒棘球蚴Eg95-Eg.ferritin融合蛋白的重组口服减毒鼠伤寒沙门菌活载体疫苗株并评价其生物学特性。将细粒棘球蚴Eg95-Eg.ferritin融合基因插入到表达载体pYA3341中,构建重组质粒pYA3341-Eg95-Eg.ferritin,将重组质粒分别电转入减毒鼠伤寒沙门菌X3770和X4550,获得重组疫苗菌株St-Eg95-Eg.ferritin,对重组菌的稳定性、生长状态及安全性进行分析。结果表明,经PCR和酶切鉴定成功构建重组质粒pYA3341-Eg95-Eg.ferritin,Western blot检测Eg95-Eg.ferritin蛋白在重组菌中获得表达;生物学特性研究结果表明,重组质粒可稳定存在,且不影响重组菌的生长状态,小鼠口服试验证实,重组菌安全无毒性。成功构建能稳定表达细粒棘球蚴Eg95-Eg.ferritin融合蛋白的口服减毒鼠伤寒沙门菌活载体疫苗株,将为研究包虫病口服基因工程疫苗奠定基础。     

神经毒素基因RjAa17f在Sf9细胞中的表达及活性分析

【目的】在昆虫草地贪夜蛾细胞(Sf9)中表达一种能专一阻断昆虫钠、钾离子通道的神经毒素基因RjAa17f。【方法】运用杆状病毒真核表达系统表达RjAa17f毒蛋白,并用蛋白质印迹对其进行检测;测定RjAa17f毒蛋白引起健康棉铃虫中肠膜电位的变化,并对其毒力进行测定。【结果】通过重组杆状病毒质粒的转染和Western blot检测验证,神经毒素基因RjAa17f的重组Bacmid已经成功转染到Sf9细胞中,且在Sf9中表达出与预测大小一致的RjAa17f目的蛋白;此毒蛋白作用于棉铃虫中肠3~12h后,中肠膜电位与CK相比差异显著,且随着作用时间的延长,棉铃虫中肠膜电位呈逐步升高的趋势,作用9h以后,升高的幅度逐渐降低,趋于平缓。RjAa17f毒蛋白对棉铃虫的LD50为108.12μg/g。【结论】在Sf9细胞内表达出了有活性的RjAa17f毒蛋白,且该毒蛋白对棉铃虫中肠膜电位有显著改变。     

黄芽白与红菜薹杂种后代的细胞遗传学特征

将白菜型油菜不同栽培种‘红菜薹’和‘黄芽白’进行正反交获得杂种一代,再经过多代自交获得高世代杂种。观察杂种后代形态学特征(叶型、株高、分枝数等）、育性特征（花粉育性、自交结实率）和花粉母细胞减数分裂染色体行为特征。结果表明经过多代自交,杂种后代各性状趋于稳定,正反交杂种形态有较大差异,而高世代杂种与杂种一代相比,形态没有明显变化。杂种后代花粉育性和自交结实率都比较高,花粉可育率均达到90%以上,但与双亲相比仍然稍差。杂种后代花粉母细胞减数分裂比较正常,但仍有少数细胞出现异常染色体行为。杂种后代减数分裂终变期染色体联会主要以形成环状和棒状的二价体为主,但也形成四价体等其他染色体构型。杂种后代中平均形成二价体的数目在6.7～8.2,最多全部20条染色体形成10个二价体,其中形成环状二价体和棒状二价体的比例相差不大。除了形成二价体外,部分花粉母细胞还形成少数四价体。与亲本相比,杂种后代染色体联会出现较多的非同源联会,平均每个细胞形成二价体的数目比亲本少,而形成四价体的数目比亲本多。在减数分裂后期Ⅰ,同源染色体分开并移向细胞两极,减数分裂后期Ⅱ,染色单体分开最终形成四分体。在此过程中,绝大多细胞染色体行为正常,但有个别细胞出现后期Ⅰ染色体不均等分离,有些细胞同源染色体分开时形成染色体桥;有些细胞在减数分裂Ⅱ中期和后期出现落后染色体。此杂种后代减数分裂过程较正常,探明杂种后代的减数分裂特征可为白菜型油菜杂交育种提供理论依据。