日本鳗鲡谷胱甘肽过氧化物酶 1 和 4 的克隆、分析和组织表达分布

采用RACE技术,克隆了日本鳗鲡(Anguilla japonica)谷胱甘肽过氧化物酶1和4(GPx1、GPx4)基因的完整编码序列(Complete coding sequence,CDS)。GPx1基因全长993bp,5′非编码区(UTR)29bp,CDS573bp,3′UTR372bp,PolyA19bp;第803-898位碱基(位于3′UTR)形成1个硒半胱氨酸插入序列(Selenocysteine insertion sequence,SECIS),协助144-146位密码子TGA编码Sec。GPX4基因全长1048bp,5′UTR115bp,CDS561bp,3′UTR346bp,polyA26bp,第766-863位碱基(位于3′UTR)形成1个SECIS,协助299-301位密码子TGA编码Sec。GPx1包含190个氨基酸,分子量21.4kD,等电点8.04,第21位氨基酸具有1个潜在的N-糖基化位点。GPx4包含186个氨基酸,分子量21.4kD,等电点8.85,第68位和153位氨基酸具有2个潜在的N-糖基化位点。GPx1、GPx4均具有Sec、Trp、Gln和Asn构成的催化四联体。日本鳗鲡与其他脊椎动物相比,GPx1的核苷酸序列一致性为42.7%～60.2%,氨基酸序列一致性为56.4%～80.4%;GPx4的核苷酸序列一致性为46.5%～60.2%,氨基酸序列一致性为59.9%～81.2%。进化分析显示,脊椎动物的GPx1、GPx4分别占据进化树的不同分支。利用Swiss-Model预测了日本鳗鲡GPx1、GPx4单体的3D模型,序列分析显示,GPx1可以形成1个同源四聚体。本研究在克隆日本鳗鲡β-actin基因部分CDS序列的基础上,采用Real-timeRT-PCR方法,检测了日本鳗鲡GPx1、GPx4基因表达,比较了GPx1、GPx4在鳃、皮肤、肌肉、肝、脾、肾、肠组织中的表达变化,发现在鳗鲡的肠、肌肉、肝脏等组织中GPx1、GPx4明显表达,并且GPx1的表达量高于GPx4。     

军曹鱼MHC-Ⅰα基因全长cDNA的克隆及其组织表达分析

采用同源克隆和末端快速扩增（RACE）方法,得到1330bp的军曹鱼（Rachycentroncanadum）MHC-Ⅰα全长cDNA片段。该序列包括76bp的5’末端非编码区（UTR）,189bp的3’UTR及1065bp的开放阅读框（ORF）,编码354个氨基酸,预测其蛋白质分子量约40．10kDa,等电点5．70。构建MHC-Ⅰα氨基酸序列的系统进化树并进行氨基酸相似性比对,结果表明,军曹鱼和已知鱼类及人类（Homosapiens）MHC-Ⅰα氨基酸的同源性在27．9％～67．1％之间。所推测的蛋白序列具有一些重要特征,包括前导肽、α1、α2、α3区、CP／TM／CYT区和保守的半胱氨酸等。Real—timePCR检测结果显示,MHC-Ⅰα基因在各个正常军曹鱼组织中均表达,但表达量各有不同,其中较强的表达于头肾;中等程度表达于鳃、脾和肠;在心、脑和肌肉中表达较弱。     

大珠母贝（Pinctada maxima）金属硫蛋白cDNA克隆与序列特征分析

金属硫蛋白（Metallothionein,MT）是一类普遍存在于生物体内、分子量低、半胱氨酸含量丰富、能够与二价重金属离子结合的蛋白质。MT在清除自由基、解除重金属毒性、参与体内微量元素代谢、防止细胞癌变等方面具有重要作用。本研究通过构建大珠母贝外套膜全长cDNA文库,首次克隆得到大珠母贝金属硫蛋白（PmMT）全长cDNA序列。该序列全长599bp,5’UTR（Untranslated Region）为75bp,3’UTR为296bp,开放阅读框（Open Reading Frame,ORF）为228bp,编码75个氨基酸。编码的氨基酸中半胱氨酸含量丰富,达到29．3％;赖氨酸和甘氨酸含量也较高,均为9．3％;不含苯丙氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸等芳香族氨基酸;含有软体动物等无脊椎动物金属硫蛋白的特征序列。序列特征分析表明,该序列具备金属硫蛋白的典型特征,是金属硫蛋白家族成员。     

团头鲂促甲状腺激素β亚基基因的克隆及序列分析

利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增法（RACE）克隆团头鲂（Megalobrama amblycephala）脑下垂体中促甲状腺激素β亚基（TSHβ）基因，并对其基因结构和系统进化进行分析。该基因cDNA序列全长614bp；5’端非翻译区100bp；3’端非翻译区61bp；开放阅读框架（ORF）453bp，共编码150个氨基酸。其编码的氨基酸序列与鳙鱼（Aristichthys nobili5）、鲤鱼（Cyprinus carpio）、金鱼（Carassius auratus）、斑马鱼（Daniorerio）、鲑鱼（Salmo salar）、虹鳟（Oncorhynchus mysiss）、欧洲鳗鲡（A．nnguilla）的相似性分别为：99．3％、92％、92％、82％、62．6％、62．6％和56％。核苷酸序列分析显示，团头鲂与鳙鱼相似性最高，为98．23％；与欧洲鳗鲡相似性最低，为48．7％。说明唧亚基在长期的进化中相当保守。在所比较的9种鱼类该基因ORF氨基酸序列中都含有定位相同的12个半胱氨酸残基，它们在成熟肽中形成6个二硫键，这对保证促甲状腺激素的空间结构，维持促甲状腺激素的生理功能起着重要的作用。该基因的成功克隆不仅为TSHβ的分子进化和相似性比较研究提供了新的资料，而且对进一步研究该基因的功能、表达具有重要的意义。     

奥利亚罗非鱼、尼罗罗非鱼MyoD1和MyoD2基因特征及差异

采用RT-PCR和RACE法,分离了奥利亚罗非鱼(Oreochromis aureus)、尼罗罗非鱼(O.niloticus)MyoD1和MyoD2基因全长cDNA。结果显示,2种罗非鱼MyoD1全长均为1090bp,包括5′非翻译区(UTR)137bp,3′UTR50bp,开放阅读框(ORF)903bp,编码300个氨基酸,其中第110～161个氨基酸为bHLH结构,第233～249个氨基酸为helixIII结构;MyoD2全长均为1478bp,包括5′UTR215bp,3′UTR471bp,ORF792bp,编码263个氨基酸,其中第91～142个氨基酸为bHLH结构,第212～228个氨基酸为helixIII结构。2种罗非鱼MyoD1与其他鱼类MyoD1的相似性为73%～92%;MyoD2与其他鱼类MyoD2的相似性为74%～79%。系统发育树显示,MyoD1和MyoD2分属两支,MyoD1所反映的不同鱼类间的亲缘关系符合传统分类。2种罗非鱼的MyoD1、MyoD2cDNA序列之间只存在个别碱基的差别,而氨基酸序列一致;奥利亚罗非鱼MyoD1的2个内含子均比尼罗罗非鱼的长。根据MyoD1内含子2的差异构建鉴别奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼基因混杂的标记,对形态上典型的15尾奥利亚罗非鱼、18尾尼罗罗非鱼及15尾奥尼罗非鱼[Oreochromis aureus(♂)×Oreochromis niloticus(♀)]进行鉴定。结果其中1尾奥利亚罗非鱼中在MyoD1位点混杂了尼罗罗非鱼的基因,尼罗罗非鱼和奥尼罗非鱼则与预期的一致。该研究为选择基因纯合的奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼提供了新的分子手段。     

表达序列标签数据库搜索克隆斑马鱼QM基因及其数字化差异显示分析

QM基因是一种与肿瘤抑制、细胞生长、分化、发育和凋亡等有关的重要基因,已在人类及许多物种中得到了克隆,但鱼类中尚无报道。我们利用表达序列标签数据库和电子克隆等技术,成功克隆了斑马鱼QM基因,并对该基因的结构进行了系统分析。结果显示,斑马鱼QM基因cDNA全长769bp,含648bp开放阅读框架,编码215个氨基酸,5’UTR 25 bp,3’UTR122 bp,所编码的QM多肽分子量24.6kDa,等电点（pI）10．6,含潜在的蛋白酶C磷酸化位点、N-酰基化位点和酰胺化位点。比较斑马鱼QM和人等13个物种QM的同源性,发现其氨基酸序列相似性为66％～92％。数字化差异显示分析结果表明,QM基因在斑马鱼胚胎及成体多种组织中均有广泛表达。研究结果为今后利用生物信息学快速克隆新的鱼类功能基因打下了方法学基础,也为进一步研究鱼类QM基因功能提供了依据。     

奥利亚罗非鱼雌激素β受体两种亚型cDNA的克隆、组织分布及雌激素对其表达的影响

采用RT-PCR和RACE技术,克隆了奥利亚罗非鱼β雌激素受体基因(estrogen receptorβ,ERβ)两种亚型的cDNA全序列(ERβ1和ERβ2)。荧光定量PCR分析雌雄奥利亚罗非鱼两种亚型的组织分布,并观察注射外源雌激素对雄性奥利亚罗非鱼下丘脑-垂体-性腺轴雌激素受体ERα和β(β1/β2)基因表达的影响。序列分析表明,ERβ1cDNA全长为4262bp,其中包含239bp5′非编码区,2349bp3′非编码区和1674bp的开放阅读框,共编码557个氨基酸。ERβ2 cDNA全长为2506bp,包含5′非编码区393bp,3′非编码区109bp,阅读框为2004bp,共编码667个氨基酸。氨基酸序列同源性分析显示奥利亚罗非鱼ERβ1与尼罗罗非鱼的相似性高达99.1%,而与鲈形目其它鱼类的相似性为82.6%～94.2%。ERβ2氨基酸序列与尼罗罗非鱼的相似性为98.7%,与大口黑鲈、虹鳟、底鳉及斑马鱼的相似性分别为81.8%、76.3%、64.7%和55.0%。在系统进化树上奥利亚罗非鱼的ERβ1和ERβ2分别与尼罗罗非鱼的相应受体聚类。奥利亚罗非鱼ERβ1/β2基因在所检测的10种组织中均有...     

大鳍鳠 IL-1β基因cDNA克隆及表达分析

白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)作为炎症反应的关键介导物,通过开启基因的表达来调控免疫反应。为了丰富鱼类该基因的研究,实验采用RT-PCR和RACE-PCR技术,首次从鲇形目鱼类大鳍鳠中获得IL-1β基因cDNA的全序列。大鳍鳠IL-1β基因cDNA全长1 194 bp,包括3’非编码区域(UTR)为224 bp,5’UTR为82 bp,开放阅读框(ORF)为888 bp,编码296个氨基酸。预测的蛋白质分子量为33.843 43 ku,等电点为5.00。与斑点叉尾等其他8种脊椎动物进行同源性分析发现,大鳍鳠IL-1β氨基酸序列与斑点叉尾相似性最高,为79.0%,与原鸡的相似性最低,为22.0%。进化树分析表明,大鳍鳠IL-1β与斑点叉尾聚为一支。半定量PCR显示,大鳍鳠IL-1β基因在肌肉、脑、脾脏、头肾、体肾、胃、皮肤、肝脏及肠等组织中都有不同程度的表达;经嗜水气单胞菌刺激后大鳍鳠IL-1β基因在头肾和脾脏的转录表达显示,1 d后该基因在头肾与脾脏中的表达量都达到最大,15 d后恢复到刺激前的水平。研究显示,大鳍鳠IL-1β在抵御病原感染过程中发挥重要作用。     

黄鳝β－肌动蛋白基因的克隆及序列分析

采用RT—PCR和RACE法，从黄鳝(Monopterus albus Zuieuw)肝脏中分离和克隆黄鳝β-肌动蛋白(actin)基因。该基因cDNA全长l765bp[不包括poly(A)]，5’端非翻译区12bp，3’端非翻译区有625bp[不包含poly(A)]，阅读框(Open reading frame，ORF)1128bp，翻译成375个氨基酸，蛋白质分子量41．77kD。将所得序列与各科鱼、蛙、鸡、牛、鼠、人等的β-肌动蛋白基因序列同源性分析显示，核苷酸序列具有68％～95％的相似性，氨基酸序列具有97％～100％相似性，显示该基因在生物进化过程中的保守；系统发育分析表明黄鳝β-肌动蛋白基因与罗非鱼的亲缘关系最近。     

真蛸热休克蛋白90基因(HSP90)的克隆及表达

为深入了解真蛸热应激响应机制,实验以真蛸的应激蛋白为研究对象,借助同源扩增和cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术获得真蛸热休克蛋白90(HSP90)的cDNA全序列(2 709 bp),它包含119 bp的5’非编码区(untranslated regions,UTR)、454 bp的3’UTR和2 136 bp的开放阅读框(opening reading frame,ORF),ORF共编码711个氨基酸,推算其分子量为81.5 ku,理论等电点为5.09。同源分析显示,所推导的氨基酸序列高度保守,并且含有HSP90家族特有的5个保守信号序列区域。实时荧光定量PCR分析表明,该基因在所有选取的组织中均有表达,肝组织中表达量最高。     

细胞核rDNA序列用于罗非鱼及其杂交种鉴别的初步研究

罗非鱼种间,尤其是尼罗罗非鱼与杂种尼奥罗非鱼之间,很难区分。本文对尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼、莫桑比克罗非鱼和杂交种尼奥罗非鱼（尼罗罗非鱼♀×奥利亚罗非鱼♂）和红罗非鱼的核糖体DNA内部转录间隔子1（ITS1）序列及其两侧的18S和5．8s部分序列特征进行分析,以筛选种间鉴别标记。PCR扩增产物大小约700bp,测序结果表明,（去除引物后）18S长146bp,5．8S长66bp,不同种类之间无差异;ITS1长383-483bp,因种类不同而异,其GC含量大于AT含量,达到67．1％。序列比对分析结果表明,18S和5．8s片段高度保守,但各有3个变异位点可以把上述几个种和杂种相互区分开;18S序列上有一个UnbI限制性酶切位点,可作为尼罗和尼奥罗非鱼的鉴别标记。ITS1序列种间变异大,系统发育分析表明,所研究的5个种聚成2个类群,尼罗与尼奥罗非鱼为一组,莫桑比克-红罗非鱼-奥利亚罗非鱼为另一组。组内种间遗传距离较小,尼罗和尼奥罗非鱼的种间遗传距离为0．006;莫桑比克、奥利亚和红罗非鱼的种间遗传距离在0．007-0．009之间;两组罗非鱼之间的遗传距离较大,在0．030-0．035之间,表明罗非鱼ITS1序列多态性较高,适合于种类区分。结合部分18S和5．8S序列,细胞核rDNA具有鉴别罗非鱼及其杂种的潜力。     

企鹅珍珠贝组织蛋白酶D的cDNA克隆、序列特征分析和应激表达研究

笔者初步研究了企鹅珍珠贝（Pteria penguin）组织蛋白酶D（cathepsin D,CTSD）的基因克隆和功能,通过同源克隆方法和cDNA末端快速扩增技术（RACE）获得了企鹅珍珠贝组织蛋白酶D基因（命名为pgCTSD）。该基因cDNA全长1 767 bp,其中5＇UTR为38 bp,3＇UTR为553 bp,ORF为1 176 bp,编码392个氨基酸,包括信号肽（Met1-Ala18）、前体域（Leu19-Lys47）和成熟域（Tyr48-Ser392）三部分,分子量为42.3 kDa,等电点为8.04。pgCTSD氨基酸序列与大珠母贝（Pinctada maxima）pmCTSD的相似性最高（79%）,与其他物种的相似性为59%～75%。荧光定量分析表明,空白对照组中pgCTSD mRNA在闭壳肌、性腺、肝胰脏、外套膜和鳃组织中都有表达,且在闭壳肌中表达量最少,肝胰脏中最高。与试验对照组相比,脂多糖（LPS）刺激6 h后性腺和肝胰脏显著下降,闭壳肌的表达量虽不大但增加显著,外套膜和鳃组织变化不显著;哈维弧菌（Vibrio harveyi）刺激6 h后肝胰腺和外套膜显著下降,闭壳肌和鳃显著上升,性腺无显著变化。肝胰腺中pgCTSD对LPS和弧菌刺激的应答反应表明pgCTSD可能参与了免疫反应。     

太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)类FUT2基因的克隆与组织表达

通过同源克隆的方法获得太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)类FUT2基因的c DNA序列,分析其在牡蛎中的组织表达差异。研究结果表明,太平洋牡蛎类FUT2基因c DNA全长为1941 bp,包含180 bp的5'非翻译区、1086 bp的编码361个氨基酸的开放阅读框及675 bp的3'非翻译区。分子进化聚类分析结果显示,太平洋牡蛎类FUT2基因与家鼠(Mus musculus)等哺乳动物的FUT2基因聚为1个分支。此外,类FUT2基因m RNA在太平洋牡蛎成贝的肝胰脏、闭壳肌、外套膜、唇瓣、鳃等5个组织中均有分布,其中在唇瓣中的表达量最低,在其余4个组织中的表达量差异不显著。本研究表明,牡蛎中类A型组织血型抗原HBGA很可能存在与人A型HBGA相似的合成途径,可为进一步探索牡蛎特异性富集诺如病毒No V的分子机制奠定研究基础。     

罗非鱼催乳素Ⅰ基因的组织分布及盐胁迫对其表达的影响

采用同源克隆方法从橙色莫桑比克罗非鱼（Oreochromis mossambicus）、荷那龙罗非鱼（O.hornorum）及其正反交子代垂体中克隆了催乳素Ⅰ基因（PRLⅠ）,并对其核苷酸序列和推导的氨基酸序列进行了比对分析。结果显示,4种罗非鱼的PRLⅠ基因序列长度均为798 bp,ORF长639 bp,共编码212个氨基酸;橙色莫桑比克罗非鱼和荷那龙罗非鱼仅在31号位点存在一个氨基酸残基差异。用q PCR方法分析橙色莫桑比克罗非鱼和荷那龙罗非鱼PRLⅠ基因在不同组织或器官中的表达,结果表明罗非鱼PRLⅠ基因在垂体中的表达量最高,在其他组织中的表达量较低;盐胁迫后4种罗非鱼垂体中的PRLⅠmRNA水平均显著降低,而在其他组织中的表达变化不大。由此可知PRLⅠ基因主要在垂体表达,参与罗非鱼的渗透压调节。     

草鱼ghrelin基因的分子克隆与组织分布及其摄食调控作用分析

ghrelin是一种在脊椎动物摄食调节过程中起重要作用的脑肠肽,具有明显的摄食促进作用。实验利用同源克隆技术获得了草鱼ghrelin基因的cDNA序列和DNA序列,其中cDNA序列全长506 bp,包括90 bp的5′端非编码区(5′-untranslated region,5′UTR),312 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),以及104 bp的3′端非编码区(3′-untranslated region,3′UTR)。开放阅读框编码的103个氨基酸的ghrelin前体肽,经剪切加工后形成含有19个氨基酸的成熟肽。氨基酸序列分析结果显示,草鱼ghrelin与硬骨鱼类ghrelin相似度最高,而与其他脊椎动物相似度较低,同时草鱼ghrelin成熟肽N端的"活性中心"(active core)为鲤科鱼类中常见的GTSF形式。与大多数硬骨鱼类的ghrelin基因结构相同,草鱼ghrelin基因也包括4个外显子和3个内含子。荧光定量PCR检测到ghrelin mRNA大量分布于草鱼的前肠和脾,脑、肾、肝、肌肉、皮和鳔等组织也有ghrelin mRNA分布。草鱼脑和肠中的ghrelin表达水平在摄食后下降,随着饥饿时间的延长表达水平逐步升高,最后维持在较高水平,表明ghrelin作为摄食启动信号对草鱼的摄食活动起到了促进作用。     

吉富罗非鱼家系构建及抗病力检测

文章以吉富罗非鱼（GIFTstrainOreochromisniloticus）为研究对象,按照1雄配1雌原则进行家系配对,待家系鱼生长至50～60g·尾“时人工感染无乳链球菌（Streptococcusagalactiae）（菌株GD001）。通过对GD001菌株半数致死浓度测定及各家系感染死亡率的统计,研究了GD001无乳链球菌感染对各家系吉富罗非鱼抗病力的影响。结果表明,1）配对成功家系67个,经繁殖性能筛选后留种53个,家系留种率为79．1％;2）GD001菌株的半数致死浓度为4×108cfu·mL－1,感染后2～6d为死亡高峰期;3）GD001菌感染53个家系后有11个家系的成活率在90％以上,15个家系的成活率在70％～89％,19个家系的成活率在30％～69％,8个家系的成活率低于30％,表明不同家系对GD001菌株的抗病力存在着显著的差异（P〈0．05）。     

加州鲈肌肉生长抑制素(MSTN)cDNA的克隆和序列分析

肌肉生长抑制素是抑制肌肉生长和发育的生长调控因子。对运用RT-PCR和RACE技术从加州鲈成鱼肌肉总RNA中扩增得到的MSTN cDNA全序列进行了序列分析。结果表明,加州鲈MSTN cDNA全长为1626bp,其开放阅读框为1 134bp,共编码377个氨基酸,前面的22个氨基酸为信号肽,中间有四个氨基酸(RARR)为蛋白水解加工位点;该基因总共有13个半胱氨酸残基,后面9个在蛋白水解加工位点之后的C端生物活性区,与其它脊椎动物比较,它们的位置完全一致,对该基因的结构和功能非常重要。与GenBank中已知的条纹狼鲈、金鲷、斑马鱼、虹鳟、斑点叉尾鮰、人、猪、鸡、鸽MSTN的ORF相比较,核苷酸序列同源性为63%~94.4%,氨基酸同源性为61.4%~96%,特别是在C端生物活性区氨基酸同源性为88.1%~100%,高度的保守性反映了该基因受到了高度的进化限制以及功能的重要性。加州鲈MSTN基因的克隆为研究该基因打靶和鱼类肌肉发育调控机理奠定了基础。