TAIL-PCR和 Tn5 转座子质粒拯救法快速分离水稻条斑病菌致病相关基因

构建植物病原菌突变体库是进行新基因发掘和功能基因组学研究的有效途径之一。为了快速准确地确定Tn5的插入位点和相应的功能基因,本研究采用TAIL-PCR和Tn5转座子质粒拯救两种技术对本实验室在筛选Tn5转座子插入水稻条斑病菌的突变体库过程中获得的8个在水稻上毒性减弱的突变体进行了鉴别。结果显示,TAIL-PCR和Tn5质粒拯救相互结合使用,可有效鉴别Tn5的插入位点和相应的功能基因。TAIL-PCR明确的5株突变体是Tn5分别插入在gspF、cAMP-regulatory protein、Integral membrane protease subunit、S-adenosylmethionine decarboxylase proenzyme和gpsJ 基因上从而导致水稻条斑病菌的毒性发生了改变;Tn5质粒拯救法明确的3株突变体是Tn5分别插入在pathogencity protein、conserved hypothetical protein和flagellum-specific ATP synthase 基因上。同源分析发现,8株突变体Tn5插入的基因与已基因组测序的BLS256菌株中的基因同源性达100%。这表明,TAIL-PCR和Tn5质粒拯救技术可有效应用于植物病原菌Tn5突变体库的鉴别和目标基因的分离。     

转座子诱变甘蓝黑腐病黄单胞菌所获胞外多糖突变体的验证

利用转座子Ｔｎ５ｇｕｓＡ５上的抗性基因,通过“鸟枪法”克隆到用这种转座子诱变甘蓝黑腐病黄单胞菌所获得的三个胞外多糖突变体菌株Ｔ１０６、Ｔ１１３和Ｔ１１７中的转座子及其相邻序列的ＤＮＡ片段,并利用含有这些片段的重组质粒,通过标记置换构建了突变体。通过检测标记置换突变体的胞外多糖产量及Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交,证实了胞外多糖突变株Ｔ１０６、Ｔ１１３和Ｔ１１７不仅确系转座子插入所致,而且转座子插入的位点分布在染色体的不同区域。从而证实了我们所报道的诱变体系是可行的     

家蚕胞质肌动蛋白基因启动子的克隆及piggyBac转座子表达载体的构建

摘要: 利用PCR方法从家蚕（Bombyx mori）总DNA中克隆到细胞质肌动蛋白基因（cytoplasmic actin）启动子片段，序列分析表明，该片段中含有典型的组成型表达的细胞质肌动蛋白基因A3（BmA3）调控序列：SRE元件（serum response element）和ActE1元件(active element 1)。该序列的核苷酸序列与来自欧洲的一个家蚕品种的序列同源性为94%。通过多次重组，将A3启动子片段(不含信号肽序列)与转座子 piggyBac的转座酶编码区融合构建成辅助质粒；将其(含信号肽序列和部分编码区)与报告基因多管水母绿色荧光蛋白基因gfp融合，插入到人工合成的转座子piggyBac两反向重复末端序列之间，进而构建成基于转座子piggyBac的转基因载体。研究中构建的转座子转基因载体仅6.4 kb，并在两反向重复末端序列之间设计了1个多克隆位点区，便于目的基因的插入。     

热不对称PCR(TAIL-PCR)和Tn5转座子质粒拯救法快速分离水稻条斑病菌致病相关基因

构建植物病原菌突变体库是进行新基因发掘和功能基因组学研究的有效途径之一.为快速准确地鉴定Tn5的插入位点和相应的功能基因,研究采用热不对称PCR(TAIL-PCR)和Tn5转座子质粒拯救两种技术,鉴别了在筛选水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)Tn5插入突变体库过程中获得的8个在水稻(Oryza sativa)上毒性减弱的突变体.结果显示,TAIL-PCR和Tn5质粒拯救结合使用,可有效地鉴别Tn5的插入位点和相应的功能基因.TAIL-PCR鉴别的5株突变体是Tn5分别插入在分泌系统结构蛋白F基因(gspF)、cAMP调控蛋白、膜镶嵌蛋白酶酶原、S-蛋硫氨酸脱羧酶亚基和gspJ基因上;Tn5质粒拯救法鉴别的3株突变体是Tn5分别插入在致病性蛋白、功能未知的保守蛋白和鞭毛特异性ATP合酶基因上.序列同源性分析发现,8株突变体Tn5插入的基因与基因组测序的BLS256菌株中的对应基因同一性达100%.这表明,TAIL-PCR和Tn5质粒拯救技术可有效地应用于植物病原菌Tn5突变体库的鉴别和目标基因的分离.     

十字花科黑腐病菌中一个与黄色素合成相关基因的鉴定

十字花科黑腐病菌（Xanthomonas campestris pv.campestris,简称Xcc）能够产生大量的胞外多糖。胞外多糖商品名又称为黄原胶,具有广泛用途,在食品生产中可作为添加剂使用。为了得到不含黄色素的黄原胶,我们采用转座子EZ-Tn5随机插入诱变的方法对8004菌株进行突变,获得了一株不产黄色素的突变体。通过对突变体的转座子EZ-Tn5插入位点进行分析,发现该突变体是由于编号为XC_4097的基因被插入突变后衍生而来。同源性分析表明XC_4097编码一种脂质酰基转移酶,它与脂质的合成有关。采用同源双交换方法构建XC_4097基因的缺失突变体。通过对野生菌、突变体以及功能回补体的表型分析进一步证实了XC_4097基因功能的丧失只影响黑腐病菌黄色素的合成,而不影响细菌生长以及胞外多糖的合成。这为工业上生产无黄色素的黄原胶提供了应用基础。     

青枯雷尔氏菌Tn5转座子无致病力突变株构建及其生物学特性

青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)是植物细菌性青枯病的病原菌,为研制植物疫苗菌剂提供遗传稳定且突变位点明确的青枯雷尔氏菌无致病力菌株,本研究利用EZ-Tn5转座子随机插入青枯雷尔氏菌(Rs91)构建青枯雷尔氏菌无致病力突变体库,通过电击转化,筛选获得13株具有无致病力菌株形态的突变株。研究了其中5株突变株的插入位点和生物学特性,结果表明,其插入位点分别位于phcA和pchS基因,其生长速率和相对胞外多糖含量显著低于Rs91,而最适pH值和温度未改变。其发酵液经分光光度计扫描,结果显示,突变株在同一波长下的光吸收值均大于Rs91,经聚类分析,显示它们与Rs91可聚为不同的3类,即Rs91为第Ⅰ类,phcA基因突变株为第Ⅱ类,phcS基因突变株为第Ⅲ类。经番茄(Lycopersicon esculentum)盆栽苗致病力检测,15d后均未发病,确定为无致病力青枯雷尔氏菌。本研究为研制防治青枯病的植物疫苗菌剂提供了基础资料。     

中慢生型天山根瘤菌胞外多糖相关基因exo5及其在根毛吸附和生物膜形成中作用的研究

用质粒pKGL 3上的转座子随机插入失活的方法得到两个中慢生型天山根瘤菌胞外多糖缺失菌株,并通过随机引物PCR的方法确定了转座子插入的基因位点,该基因与豌豆根瘤菌的UDP-葡萄糖脱氢酶基因有高度的同源性.根毛吸附实验发现该基因缺失,导致胞外多糖缺失突变菌株在其宿主植物甘草上的根毛吸附量大大降低,同时生物膜的形成实验发现中慢生型天山根瘤菌的exo5-菌株不能像野生型菌株一样形成丰富的生物膜,也从侧面证明了根毛吸附实验的结果,初步推测胞外多糖可能通过影响中慢生型天山根瘤菌的根毛吸附过程来影响其与豆科植物的共生固氮.     

水稻受稻瘟病菌诱导的转座类似蛋白新基因RIM2的分离与鉴定

以近等基因系H7R和H7S为材料，运用差别显示（DD－PCR）技术获得RMal9片段。用此片段为探针筛选cDNA文库，获得3944bp全长基因RIM2。Northern杂交华结果显示该基因在水稻抗感品系中均受稻瘟病菌的强列诱导。RIM2 ORF编码653个氨基酸，其序列与多种植物转座类似蛋白有32％－55％的同源性，其5′端约800bp与Xa21基因家庭Al，C的非编码区有82％的序列同源性。Southern杂交表明RIM2多拷贝存在与水稻基因组中。RIM2为一新的受病菌诱导的早期反应基因。     

洋葱伯克霍尔德氏菌CAS19嗜铁素合成相关基因cepR的克隆及生物信息分析

本研究采用PCR方法克隆了洋葱伯克霍尔德氏菌CAS19嗜铁素合成相关基因cepR,并对cepR基因编码蛋白的结构和功能进行生物信息学分析和预测。同源性分析表明,CAS19的cepR核苷酸序列与Burkholderiacepacia LMG1222cepR基因的同源性为99％;cepR基因全长768bp,包含一个完整的231bp的开放阅读框架,编码239个氨基酸;该基因编码蛋白分子量为26．59kD,理论的等电点为5．55,含有一个LuxR型HTH结构域,在氨基酸残基的不同区域分布有酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、蛋白激酶C磷酸化位点、酪氨酸激酶磷酸化位点、N-肉豆蔻酰化位点和N-糖基化位点,还有一个明显的跨膜结构。本研究结果将为洋葱伯克霍尔德氏菌嗜铁素合成相关研究提供调控基因信息和参考依据,并为其进一步开发和利用奠定基础。     

植物青枯菌aac基因突变株的构建及其致病性的测定

根据青枯菌(Ralstonia solanacearum)与群体猝灭相关aac基因序列设计PCR引物,扩增获得了aac基因,并将基因克隆到pGEM-T- easy载体中。将庆大霉素基因插入aac基因内部,使其突变,将含有庆大霉素基因的aac突变基因亚克隆进入自杀质粒pDS132中,构建成aac基因重组自杀质粒pDS-aac’-Gm。将自杀质粒电转化至青枯菌GMI 1000菌株中,通过体内同源重组,置换其野生型的aac基因。通过三步筛选法和PCR扩增鉴定,筛选获得了具有庆大霉素抗性的青枯菌aac基因突变株(GMI 1000-m)。接种番茄结果显示,青枯菌aac突变株的致病性较野生型GMI 1000明显下降。证明aac基因在青枯菌致病过程中具有重要作用。     

农杆菌介导的绿木霉遗传转化及重寄生缺陷突变体的筛选

绿木霉（Trichodermavirens）是一种重要菌寄生真菌,该菌己广泛应用于多种病害的生物防治上。本研究构建了双元载体pCATPH—I（GenBank登录号为：KC252999）,并利用该载体成功实现了农杆菌介导的绿木霉遗传转化,转化效率可达385～460个转化子／10s绿木霉分生孢子。转化子的PCR和遗传稳定性分析表明,T—DNA己整合进该菌的基因组中且在无选择压力的条件下能够稳定遗传。利用该转化体系成功建立了超过2000个转化子的转化子库,通过转化子与病原真菌立枯丝核菌限hizoctoninsolani）对峙培养在该转化子库中成功筛选到两个重寄生缺陷突变体,D441和A281。本研究的完成可为绿木霉的功能基因组学及重寄生分子机制的研究打下基础。     

Anthraquinones isolated from Cassia tora (Leguminosae) seed show an antifungal property against phytopathogenic fungi

The fungicidal activities of Cassia tora extracts and their active principles were determined against Botrytis cineria, Erysiphe graminis, Phytophthora infestans, Puccinia recondita, Pyricularia grisea, and Rhizoctonia solani using a whole plant method in vivo and were compared with synthetic fungicides and three commercially available anthraquinones. The responses varied with the plant pathogen tested. At 1 g/L, the chloroform fraction of C. tora showed a strong fungicidal activity against B. cinerea, E. graminis, P. infestans, and R. solani. Emodin, physcion, and rhein were isolated from the chloroform fraction using chromatographic techniques and showed strong and moderate fungicidal activities against B. cinerea, E. graminis, P. infestans, and R. solani. Furthermore, aloe-emodin showed strong and moderate fungicidal activities against B. cinerea and R. solani, respectively, but did not inhibit the growth of E. graminis, P. infestans, P. recondita, and Py. grisea. Little or no activity was observed for anthraquinone and anthraquinone-2-carboxylic acid when tested at 1 g/L. Chlorothalonil and dichlofluanid as synthetic fungicides were active against P. infestans and B. cinerea at 0.05 g/L, respectively. Our results demonstrate the fungicidal actions of emodin, physcion, and rhein from C. tora.     

硅对水稻几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶活性的影响及其与抗纹枯病的关系

在溶液培养条件下,以水稻抗病品种91SP和感病品种Lemont为材料,研究施硅和接种纹枯病菌对水稻纹枯病发生情况、外切几丁质酶、内切几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶活性的影响。结果表明,施硅能降低抗病品种91SP的纹枯病病级和病情指数,显著降低感病品种Lemont的病级和病情指数。在未接种纹枯病菌条件下,施硅增加了抗病品种几丁质酶活性,增加了感病品种的几丁质酶活性,但对β-1,3-葡聚糖酶活性影响不大。接种纹枯病菌后,水稻几丁质酶活性被迅速激活后又下降,施硅通过提高抗病品种91SP几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶活性,以及通过提高感病品种Lemont几丁质酶活性来增强对纹枯病的抗性,但感病品种Lemont施硅处理的几丁质酶活性降低幅度小于抗病品种91SP。     

中华苜蓿根瘤菌被种子分泌物诱导的基因筛选和分析

土壤中的根瘤菌与宿主植物的共生结瘤过程中,豆科植物可以通过分泌氨基酸,有机酸,糖类,有机酚及其他的次级代谢产物的种类及丰度来影响根圈范围内微生物的群体种类及数量。豆科植物可以通过分泌趋化性物质如糖蛋白等协助根瘤菌吸附在合适的侵染位点,从而增加自身被感     

Fungicidal property of Curcuma longa L. rhizome-derived curcumin against phytopathogenic fungi in a greenhouse

Fungicidal activity of Curcuma longa rhizome-derived materials against Botrytis cineria, Erysiphe graminis, Phytophthora infestans, Puccinia recondita, Pyricularia oryzae, and Rhizoctonia solani was tested using a whole plant method in vivo. It was compared with synthetic fungicides and four commercially available compounds derived from C. longa. The response varied with the tested plant pathogen. At 1000 mg/L, the hexane extract of C. longa showed fungicidal activities against E.graminis, P. infestans, and R. solani, and the ethyl acetate extract of C. longa showed fungicidal activities against B. cineria, P. infestans, Pu. recondita, and R. solani. Curcumin was isolated from the ethyl acetate fraction using chromatographic techniques and showed fungicidal activities against P. infestans, Pu. recondita, and R. solani with 100, 100, and 63% control values at 500 mg/L and 85, 76, and 45% control values at 250 mg/L, respectively. In the test with components derived from C. longa, turmerone exhibited weak activity against E. graminis, but no activity was observed from treatments with borneol, 1,8-cineole, sabinene, and turmerone. In comparison, potent fungicidal activity with chlorothalonil against P. infestans at 50 mg/L and dichlofluanid against B. cinerea at 50 mg/L was exhibited. These results may be an indication of at least one of the fungicidal actions of curcumin derived from C. longa.     

黄冠梨几丁质酶基因家族cDNA全长序列克隆与分析

根据已知植物几丁质酶基因序列的保守区域,设计特异性引物,以梨黄冠品种叶片为材料,提取RNA,进行反转录,克隆获得5个几丁质酶基因cDNA片段,进一步通过RACE技术获得该基因的全长cDNA序列,依次命名为PyChi1、 PyChi2、 PyChi3、 PyChi4、 PyChi5,序列提交GenBanK,登录号为：FJ589783、 FJ589784、 FJ589785 、 FJ589786、FJ589787。序列分析结果表明,所获得5个几丁质酶基因,都具有完整的ORF和Poly(A)结构,与其他植物几丁质酶基因具有较高的相似性;5个基因的核酸序列的同源性约在35%~53%之间,PyChi1和PyChi4的氨基酸同源性最高,约85%,而与PyChi5约77%;在几丁质酶基因家族,分别属于Chitinase ClassesⅠ-Ⅴ,为5个不同类型的成员;不同类型的几丁质酶基因在核酸和氨基酸序列以及功能结构方面都存在着存在着显著的差异,主要表现在肽链特性和基因结构等方面。这为进一步研究梨几丁质酶的结构和功能奠定了基础。     

利用高效转座质粒克隆Streptinomonas maltophilia YHJ-1的分解羽毛相关基因

嗜麦芽窄食假单胞菌Streptinomonas maltophilia YHJ-1是一株能高效降解羽毛角蛋白的菌株;该菌对卡那霉素等多种抗生素不敏感。本实验利用携带Tn5转座酶和卡那霉素抗性转座质粒pRL27和含氯霉素抗性基因盒的pMCm质粒,构建了以氯霉素抗性作为选择标记的转座质粒pRH30。以E. coli UQ3021/pRH30为供体,通过双亲本杂交,构建了S. maltophilia YHJ-1的插入突变体文库,该库共含1246个转化子。随机挑选4个突变子的氯霉素抗性检测和PCR扩增测序分析结果显示文库是可靠的。已从文库中筛选出3株不能降解羽毛转化子,表明利用氯霉素抗性的转座质粒pRH30来构建菌株YHJ-1的突变体是克隆其相关基因并进行遗传分析的有效方法。     

Volatile metabolites from Salvia fruticosa as antifungal agents in soilborne pathogens

The volatile metabolites of Salvia fruticosa plants, growing wild in 15 localities scattered across Greece, were analyzed by means of GC and GC-MS. The essential oil content ranged from 0.69 to 4.68%, and the results of the analyses showed a noticeable variation in the amounts of the five main components [1,8-cineole, alpha-thujone, beta-thujone, camphor, and (E)-caryophyllene]. The antifungal activities of the essential oils from two localities, belonging in two different groups of cluster and principal component analysis, and their main components (1,8-cineole and camphor) were evaluated in vitro against five phytopathogenic fungi. Both oils were slightly effective against Fusarium oxysporum f. sp. dianthi and Fusarium proliferatum, whereas against Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum, and Fusarium solani f. sp. cucurbitae the oils exhibited high antifungal activities.