葫芦种子传黄瓜绿斑驳花叶病毒的检测*

从感染黄瓜绿斑驳花叶病毒（Cucumber green mottle mosaic virus, CGMMV）的葫芦植株上收取种子,通过苗期症状观察法、双抗体夹心酶联免疫吸附法（DAS-ELISA）、免疫捕获反转录PCR（IC-RT-PCR）法测定葫芦种子的带毒情况,并用生物学接种方法测定葫芦种子携带病毒的侵染活性。苗期症状观察法结果表明,199株幼苗有2株表现花叶斑驳症状,种子传毒率为1.01%;而利用DAS-ELISA和IC-RT-PCR法随机检测30粒葫芦病株种子,CGMMV检出率为100%。种子各部位携带的CGMMV接种葫芦表现典型的花叶斑驳症状,表明葫芦种子携带的CGMMV具有侵染活性。DAS-ELISA检测葫芦种子CGMMV的灵敏度为1/5120种子研磨液。     

西瓜感染黄瓜绿斑驳花叶病毒后糖分代谢与倒瓤的关系

为揭示人工接种黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)后西瓜糖分代谢与倒瓤的关系,采用高效液相色谱法测定了接种CGMMV后西瓜的葡萄糖、果糖、蔗糖含量变化,采用比色法测定了糖酵解途径关键酶及蔗糖代谢相关酶活性的变化。结果显示,西瓜苗感染CGMMV后,果实中葡萄糖、果糖、蔗糖含量均较对照发生明显变化,接种处理后葡萄糖含量在授粉7~28 d显著高于对照,之后迅速下降,35 d时显著低于对照,仅为对照的24.87%;果糖含量仅在授粉后7~14 d高于对照,21~35 d显著低于对照;接种处理和对照的蔗糖含量在授粉后14~35 d均逐渐上升,但14~35 d接种处理显著低于对照。接种处理后己糖激酶、磷酸果糖激酶和果糖激酶活性均在授粉后7~14 d显著低于对照,21~28 d显著高于对照,35 d时显著低于对照;丙酮酸激酶活性授粉后7~21 d显著低于对照,35 d时显著高于对照;酸性转化酶和中性转化酶活性在授粉后7~21 d显著低于对照,35 d时高于对照;蔗糖磷酸合成酶和蔗糖合成酶活性均显著低于对照,其中蔗糖合成酶活性在授粉后28 d时仅为对照的21.32%。推断西瓜苗接种CGMMV后糖酵解的4个关键酶协同作用,调控糖酵解,进而调控葡萄糖和果糖的积累与代谢,同时蔗糖代谢相关酶活性降低,阻碍蔗糖合成,即西瓜苗感染CGMMV导致倒瓤与其糖分的合成与代谢密切相关。     

黄瓜绿斑驳花叶病毒种子处理试验研究

为达到从种子源头控制病害流行危害的目的,本文通过应用药剂消毒、干热处理、干热处理结合药剂消毒、温汤浸种、温汤浸种结合药剂消毒等5种方法,对感染黄瓜绿斑驳花叶病毒的种子进行种子处理试验,结果表明:干热处理结合药剂消毒最好,相对防效为100%,增产12.36%,其次是干热处理,防效为93.46%,增产11.33%;温汤浸种结合药剂消毒,防效为80.47%,增产11.00%;药剂消毒,防效为73.93%,增产9.27%;温汤浸种,防效为58.2%,增产7.21%。     

黄瓜绿斑驳花叶病毒实时荧光定量PCR检测体系的建立

为灵敏、快速地检测西瓜种子和果实中的黄瓜绿斑驳花叶病毒(cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV),根据该病毒的衣壳蛋白(coat protein,CP)序列设计特异性引物,建立基于SYBR Green Ⅰ染料的实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR,RT-qPCR)技术,并对采集的12份不同发育期西瓜果实样品进行检测。结果表明,建立的RT-qPCR检测技术可对西瓜种子中的CGMMV含量进行精确检测,检测下限为3.35×10~2 copies/μL。采集的12份不同发育期西瓜果实样品中有10份被检测出携带CGMMV,病毒含量范围为1.00×10~4～4.80×10~6 copies/μL。随着果实发育,由CGMMV引起的果实倒瓤症状愈加明显,果实中CGMMV的积累量也明显增加。授粉后25 d西瓜果实中CGMMV的含量是授粉后10 d时的30倍,表明病毒在果实中的积累可能受生长发育期的影响且果实倒瓤症状的形成与病毒积累量呈正相关。     

黄瓜绿斑驳花叶病毒单克隆抗体的研制

将纯化的黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus, CGMMV)制剂免疫BALB/c小鼠,最后一次免疫后第3天取其脾细胞与SP2/0细胞融合,经采用选择性培养基、有限稀释法克隆和间接ELISA方法进行筛选,成功获得了3株分泌CGMMV特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株并分别命名为3C9,3F7,2G10。用ELISA方法对所获得的3个杂交瘤细胞株进行亚型鉴定均为IgG2a,kappa链。 间接ELISA效价测定结果分别为3C9：1.024×107,3F7：2.56×106,2G10：1.28×106。此3株杂交瘤细胞所分泌的单克隆抗体均能与本研究室保存的其他3种不同的CGMMV分离物发生特异性反应,而不与其他3种同属成员病毒 烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus, TMV)、辣椒轻斑驳病毒(Pepper mild mottle virus, PMMoV)、齿瓣兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,ORSV) 发生反应。     

黄瓜绿斑驳花叶病毒疫情处置效果的研究

通过对经焚烧深埋处理的CGMMV染疫甜瓜植株和用土壤消毒剂处理的土壤的连续取样;提取土壤和病残植株样品的RNA;经RT-PCR检测和汁液摩擦接种植株的方法,检测了带有CGMMV植株残体和土壤中病毒核酸的存在和其侵染活性。结果表明:经过通常检疫销毁的病植株残体和土壤可以检到病毒RNA,但已没有侵染活性。     

小西葫芦绿斑驳花叶病毒生物学特性及传播方式

小西葫芦绿斑驳花叶病毒(Zucchini green mottle mosaic virus,ZGMMV)是我国新报道的侵染葫芦科作物的烟草花叶病毒属病毒.从感染病毒的葫芦叶片中分离出ZGMMV,摩擦接种西瓜(Citrullus lanatus)、葫芦(Lagenaria siceraria)、西葫芦(Cucurbit...     

黄瓜绿斑驳花叶病毒低风险参照物质的研制

采用RT-PCR方法扩增黄瓜绿斑驳花叶病毒的外壳蛋白基因与3,非编码区,并将其构建到马铃薯X病毒(PVX)载体中.重组质粒经线性化及体外转录后接种烟草,获得含有病毒外壳蛋白基因的感病植株.感病组织可用于分子检测的质控,也可作为毒源来繁殖阳性参照物质.基于PVX载体制备的参照物质可降低检疫性病毒的生物安全风险,尤其对稳定性强、可造成严重经济损失的高风险病毒的检疫更具实用价值.     

利用RT-PCR快速检测黄瓜绿斑驳花叶病毒

根据黄瓜绿斑驳花叶病毒（CGMMV）的外壳蛋白基因（CP基因）保守序列设计、合成引物,以感病西瓜、南瓜、玉米叶片组织总RNA为模板,进行cDNA合成和PCR扩增,并将扩增产物连接到pMD18-T载体上测序鉴定。核苷酸序列测定结果表明,此CP基因全长为654个核苷酸,与已报道的CGMMV的CP基因同源性为97%-100%。RT-PCR方法为检测CGMMV提供了操作更为简便、特异性更强的快速、准确的检测鉴定方法,是一种控制该潜在危险性有害生物蔓延的有效途径。     

日本、韩国黄瓜绿斑驳花叶病毒发生及防控策略

本文简介日本、韩国黄瓜绿斑驳花叶病毒的发生情况,分析了日、韩黄瓜绿斑驳花叶病毒发生传播特点及其防控策略,认为其种子检疫、种子消毒处理、卫生栽培和土壤处理等综合控制措施是疫情关键防控技术,为我国控制该疫情提供有益借鉴。     

人工接种CGMMV的增殖及其对西瓜 光合作用的影响

为明确西瓜感染黄瓜绿斑驳花叶病毒CGMMV后病毒的增殖过程及其对光合作用的影响,本研究以辽宁省田间主栽西瓜品种‘京欣’为试材,测定了人工接种CGMMV后,西瓜植株体内病毒含量、光合色素、光合作用相关指标以及参与光合作用的关键酶活性的变化,结果显示:接种3d后,即可检测到病毒,24d植株内病毒含量达最高;叶绿素a、叶绿素b及类胡萝卜素的含量均有所降低,叶绿素a在9d后均低于健康对照,而叶绿素b和类胡萝卜素在15d后明显低于健康对照,第18天时,健康对照的叶绿素b含量达接种处理的1.33倍;ALA脱水酶活性除第15天与对照无显著差异外,整个测定期间均低于健康对照,21d时健康对照的ALA脱水酶的活性达29.9U/h,为接种处理的2.18倍;PEP羧化酶的活性显著低于健康对照,测定期间接种处理的PEP羧化酶活性变化不大;乙醇酸氧化酶活性明显升高,测定期间其活性均显著高于健康对照;西瓜叶片的光合速率、气孔导度和蒸腾速率均远小于健康对照,而细胞间隙CO_2浓度却比对照高,本研究为揭示西瓜感染CGMMV后的光合作用变化规律奠定了基础。     

西瓜感染黄瓜绿斑驳花叶病毒后糖的变化与倒瓤关系的研究

 By high performance liquid chromatography (HPLC), the contents of glucose, fructose and sucrose, and the sweetness were analyzed in watermelon inoculated with Cucumber green mottle mosaic virus (CGMMV).The relationship between sugar change and blood-flesh of watermelon was determined. The results indicated that the content of glucose was apparently increased compared to that of the control before maturity (within 28 days after pollination), but reduced to 24.8% of the control after maturity (at 35 days after pollination). The content of fructose was higher than that of the control within 14 days after pollination, and then decreased with a significant difference. In all cases, the content of sucrose increased with the growth of watermelon. However, compared with the control, the sucrose content of watermelon inoculated with CGMMV was lower. The ratios of glucose, fructose and sucrose in the total sugar were abnormal. Coincidence with the changes of the total sugar, the fruit sweetness before maturity was higher than that of the control, whereas decreased sharply after maturity (lower than that of the control). The inner pulp of the mature fruit appeared to be water-soaked and dirty red with no edibility. In a word, after inoculation with CGMMV, the changes of sugars and sweetness affected the watermelon quality.     

人工接种CGMMV后与西瓜倒瓤相关部分生理指标的研究

 本研究以辽宁省田间主栽西瓜品种“京欣”为试材,通过测定多聚半乳糖醛酸酶(PG)的活性,以及乙烯、丙酮酸及丙酮酸代谢产物—乳酸、乙醛、乙醇含量的变化,明确了西瓜感染黄瓜绿斑驳花叶病毒后上述生理指标的改变与西瓜倒瓤的关系。研究结果表明:接种处理的西瓜果实授粉后7 d和28 d PG出现2次活性高峰,PG活性过高将导致果肉软化;乙烯含量亦在授粉后21~28 d明显高于健康对照,这一变化将导致果肉水渍化败坏;无论接种早晚,西瓜果实内丙酮酸及丙酮酸代谢产物均有不同程度的积累。定植期接种处理的西瓜,授粉后21 d时西瓜果实内丙酮酸含量为健康对照的2.51倍,35 d时达健康对照4.09倍;授粉后7 d乳酸含量已显著高于对照,35 d时接种处理的西瓜果实内的乳酸含量迅速增加至43.5 μmol·g^-1FW,达健康对照的4.7倍;乙醛含量随着西瓜成熟逐渐增加,尤其是授粉后21~35 d乙醛含量增加速度极为迅速,35 d时达健康对照的26.4倍;乙醇含量授粉后7 d最高,达健康对照的10.1倍,随后有所下降。于压蔓期接种处理的西瓜果实,授粉后21 d,丙酮酸、乳酸、乙醛含量明显高于健康对照,但均低于定植期接种处理的,乙醇含量与健康对照无明显差异,也就是说,感染该病毒越早,对西瓜的生长影响越明显。     

湖南首次检测到黄瓜绿斑驳花叶病毒

 黄瓜绿斑驳花叶病毒（Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV）自1935年首次报道^［1］以来,已广泛分布于亚洲、欧洲、南美洲的多个国家和地区,对葫芦科作物的生产造成了严重损失。CGMMV主要有两种重要的传播途径,一是带毒种子造成远距离传播,二是授粉、嫁接等农事操作造成的田间传播^［2］。     

黄瓜绿斑驳花叶病毒病防治研究进展

黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)主要危害葫芦科作物,已被世界上许多国家和地区列为检疫性有害生物。CGMMV目前在我国23个省、市、区已有报道发生和危害,严重影响葫芦科作物的生产;近年来该病害在国内外呈现迅猛扩展的趋势并对生产造成危害。本文综述了防治该病害的种子处理、化学及生物防治、嫁接以及转基因等分子生物学方法;分析了CGMMV与寄主黄瓜互作研究的最新进展,对小分子RNA参与调控寄主对CGMMV病毒的防控策略提出了展望,并概述了下一代测序技术、基因编辑技术在植物新病毒的检测、鉴定以及培育抗病新品种等方面的应用。     

黄瓜绿斑驳花叶病毒在我国定殖和扩散的风险性分析

参照国际上有害生物风险性分析（pest risk analysis, PRA）方法,从定性分析和定量评估两个层面对黄瓜绿斑驳花叶病毒（Cucumber green mottle mosaic virus, CGMMV）的危险性进行了综合评价。从CGMMV的地理分布、侵入后定殖、扩散的可能性等对其进行研究分析,认为CGMMV具有广泛的适宜寄主、极强的适生性及多种传播方式,风险值R为2.39,已给我国葫芦科作物如西瓜造成巨大经济损失,因此断定其定殖、扩散的可能性极高,属于高度危险性的有害生物,应加强对其的风险管理。     

黄瓜绿斑驳花叶病毒cp基因的原核表达及抗血清制备

 采用RT-PCR方法克隆了黄瓜绿斑驳花叶病毒辽宁分离物(Cucumber green mottle mosaic virus Liaoning isolate, CGMMV-LN)的cp基因并连接到原核表达载体pGEX-4T-3和pET-22b (+)上, 将获得的重组子pGEX-4T-3-CGMMV CP和pET-22b (+)-CGMMV CP转化大肠杆菌BL21后用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE和W estern blot分析表明, cp基因在大肠杆菌中获得了高效表达, 融合蛋白分子量分别为43.8 kDa和17.3 kDa。将17.3 kDa融合蛋白纯化后免疫家兔, 制备了CGMMV特异性抗血清, 抗原包被间接ELISA法(ACP-ELISA)测定抗血清的效价为1/20 000。