超高效液相色谱-串联质谱法定量检测蜂王浆主蛋白1～3

为建立精准的蜂王浆新鲜度检测方法,利用超高效液相色谱-串联四极杆飞行时间质谱(ultra-high performance liquid chromatography-tandem quadrupole-time-of-flight mass spectrometry,UPLC-Q-TOF/MS)对经胰蛋白酶酶解的蜂王浆中王浆主蛋白(major royal jelly proteins,MRJPs)进行定性分析,并通过蛋白质组学分析平台比对,鉴定出8种王浆主蛋白(MRJP1～7和MRJP9)的一级序列数据,然后按同时具备高易酶解性与酶解后高稳定性的标准筛选得到3个特异性标志多肽,包括MRJP1多肽YNGVPSSLNVISK、MRJP2多肽TLQMIAGMK、MRJP3多肽LTVAGESFTVK。分别合成MRJP1～3的3条特异性标志多肽标准品及其同位素标志肽,建立蜂王浆中MRJP1～3的超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱(ultra-high performance liquid chromatography-triple quadrupole tandem mass spectrom...     

超高效液相色谱-四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱筛查水产品中62种药物残留

建立超高效液相色谱-四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱筛查水产品中62种药物残留的方法。样品用酸化乙腈提取后,经浓缩过滤后,进超高效液相色谱-四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱进行筛查。采用AcquityUPLCBEHC18,2.1 mm×150 mm色谱柱分离,以乙腈和缓冲液(0.1%甲酸,2 mmol·L^-1乙酸铵)为流动相梯度洗脱,质谱Fullms-dd-MS²模式进行采集分析。方法检出限为10 μg·kg^-1,回收率范围在48.3%~105.8%。该方法自建谱库,利用高分辨质谱质量数准确、精度高的特点,匹配谱库达到准确快速筛查的目的。     

大花序桉树皮化学成分分析及其抗氧化活性研究

利用超高效液相色谱-串联四极杆静电场轨道阱高分辨质谱(UPLC-Q-EXACTIVE-MS)法快速分析大花序桉树皮抽提物的化学成分,同时测定其体外抗氧化活性,为其树皮资源的开发利用提供科学依据。采用ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1 mm×50 mm×1.7μm),以0.1%甲酸水(A)-甲醇(B)流动相进行梯度洗脱,流速为0.3 m L/min;采用ESI离子源,在正负离子模式下扫描,根据高分辨质谱提供的准分子离子峰和二级离子碎片的精确分子质量信息,结合数据库和相关文献材料,从大花序桉树皮中鉴定出化学成分共26种,其中黄酮类2种、机酸类15种、三萜类1种、生物碱类2种、脂肪酸酰胺类6种;体外抗氧化试验结果表明,大花序桉树皮抽提物对DPPH、ABTS均有较好的清除能力,其IC₅₀分别为60.02、76.94μg/mL。本研究建立的UPLC-Q-EXACTIVE-MS法能快速、准确、较全面地鉴定大花序桉树皮化学成分,所得的裂解规律可为其他同类化学成分鉴定提供参考;大花序桉树皮具有良好的抗氧化活性,可作为天然抗氧化活性物质来源。     

花生过敏蛋白分离提取及结构预测分析

花生是较常见的重要食物过敏原之一。本研究采用石油醚对花生进行脱脂处理,利用硫酸铵盐析、透析、葡聚糖凝胶（Sephadex G-150）分离纯化花生蛋白,通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）法确定花生主要蛋白分子量为15、20、35和60 ku左右,Western–Blotting免疫印迹试验确定花生过敏原性蛋白分子量为63.5 ku;通过质谱测序得到31条有效蛋白肽段,其中5条肽段的谱图数较高,占总谱图数的49.6%,分别是KLEYDPRCVYDTGAT、AFNAEFNEIRRVLLEE、DNVIDQIEKQAK、PYSPSQDPDRRDPY和QDPYSPSQDPDR,并以此推断这些肽段为花生致敏蛋白Ara h 1和Ara h 2的主要肽段过敏序列,成功运用蛋白肽段推断与之对应的蛋白质种类,为进一步明确花生过敏原的致敏机理奠定基础。但花生过敏蛋白构象结构复杂,需要通过其他手段进一步开展研究工作。     

高效液相色谱串联三重四极杆质谱检测饲料中10种β-受体激动剂

建立了以高效液相色谱串联三重四极杆质谱检测饲料中福莫特罗等10种β-受体激动剂的分析方法。饲料样品中的β-受体激动剂经高氯酸溶液提取、HLB柱净化浓缩后,导入Agilent1100液相色谱串联API4000三重四极杆质谱,采用C18色谱柱分离,通过电喷雾(ESI)离子源电离,多反应监测(MRM)对10种β-受体激动剂进行定性定量分析,结果表明,10种β-受体激动剂在0.5～40.0μg/L范围内的峰面积与质量浓度线性相关(r0.999)。0.01、0.02、0.1、0.5 mg/kg添加水平下,回收率71.2%～103%,相对标准偏差3.7%～9.8%,方法定量限(S/N=10)为0.01 mg/kg。     

超高效液相色谱-串联质谱法测定4种麻痹性贝类毒素

建立了超高效液相色谱-串联四极杆质谱法测定贝类中4种麻痹性贝类毒素的方法。样品均质后经乙酸水溶液提取,HLB固相萃取柱净化,超高效液相色谱分离,串联四级杆质谱检测,外标法定量。STX、dcSTX、neoSTX、dcneoSTX在10.0～50.0μg/kg的添加范围内的平均回收率为77.4%～90.8%,相对标准偏差为3.87%～6.37%,定量检出限均为10.0μg/kg。该方法分析速度快、灵敏度高、重现性好,可广泛适用于贝类中麻痹性贝类毒素的测定。     

着色与非着色苹果品种中磷酸化蛋白质的鉴定与分析

【目的】苹果着色是一个重要的质量性状,构建苹果磷酸化蛋白质组并进行鉴定与分析,了解在苹果着色过程中的蛋白质磷酸化,为进一步阐明苹果着色机理提供参考。【方法】以着色‘嘎拉’和非着色‘金冠’两个品种苹果果皮为试材提取总蛋白,用TiO₂富集磷酸化肽段,对富集到的磷酸化肽段进行高效液相色谱分离,利用质谱鉴定磷酸化肽段,采用Mascot2.2和Proteome Discoverer1.4（thermo）软件进行蛋白质查库鉴定,使用的数据库为Uniprot_Maloideae.fasta。对鉴定到的磷酸化肽段和蛋白质进行分析,找出着色与非着色苹果品种中有差异的磷酸化蛋白质及其修饰位点。【结果】在着色苹果品种中鉴定到1 323个蛋白质、3 339个肽段和225个磷酸化肽段,发现磷酸化蛋白质约200-225种;在非着色苹果品种中鉴定到569个蛋白质、1 152个肽段和128个磷酸化肽段,发现磷酸化蛋白质约117-128种。比较分析表明,43个磷酸化肽段仅在非着色苹果品种中发现,139个磷酸化肽段仅在着色苹果品种中发现,在着色苹果品种中有更多的蛋白质发生了磷酸化,其中质膜H⁺-ATPase在两个苏氨酸位点发生磷酸化,过敏原蛋白和两个蛋白激酶在丝氨酸位点发生磷酸化,3个转录因子、1个钾转运蛋白和1个受体激酶都发生磷酸化。在两个苹果品种鉴定出的蛋白质中,发生蛋白质磷酸化的位点主要是丝氨酸,其次是苏氨酸,在酪氨酸位点发生蛋白质磷酸化很少。蛋白质WD40和花青苷合成途径中的相关酶蛋白C4H、4CL、CHS、CHI、F3′H、FLS、LDOX和UFGT在着色过程中未发生磷酸化。在着色和非着色苹果品种中都存在MYBR转录因子,并且都发生了蛋白质磷酸化。【结论】在着色苹果品种中产生了一些特有的磷酸化蛋白质,其中包括已知与着色相关的质膜H⁺-ATPase,苹果着色可能受到蛋白质磷酸化的影响。     

超高效液相色谱－三重四极杆串联质谱仪测定植物样品中PFOS? PFOA

[目的]研究运用超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱仪测定植物样品中全氟辛烷磺酸(PFOS)和全氟辛酸(PFOA)的可行性。[方法]建立了一种SPE净化,超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱仪UPLC/MS/MS方法测定植物(绿萝)根、茎和叶中PFOS和PFOA残留量,并优化了质谱条件和前处理方式,保留时间分别为2.26和2.17 min。[结果]采用碳酸钠(Na2CO3)、四丁基硫酸氢铵(TBAHS)、甲基叔丁基醚(MTBE)作为提取试剂,HLB小柱净化后PFOS在绿萝根、茎、叶中的加标回收率为46.53%~77.35%,变异系数为5.63%~18.52%;PFOA在绿萝根、茎、叶中的加标回收率为59.01%~100.46%,变异系数为2.85%~30.06%,检出限分别为26.90×10-4和3.09×10-4ng,相关系数均大于0.998。[结论]超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱仪测定植物样品中PFOS和PFOA满足化合物残留分析要求。     

小麦叶片蛋白质组的2D-LC分离及Nano LC-MS/MS分析

 【目的】二维液相色谱（2D-LC）与双向电泳（2-DE）技术具有互补性,本文旨在探讨利用2D-LC和纳升级液相色谱串联质谱（Nano LC-MS/MS）技术分离鉴定小麦叶片蛋白质组的新方法。【方法】小麦叶片蛋白经提取、脱盐后,进行第一维阴离子交换分离;收集洗脱组分进行SDS-PAGE分析,并对非高丰度蛋白组分进行第二维反相液相色谱分离;随机选择含较低吸收峰的部分组分经胰蛋白酶水解后进行Nano LC-MS/MS 分析;将串联质谱数据通过MASCOT搜索NCBInr和EST数据库,并对二级质谱获得的蛋白序列进行MS BLAST分析。【结果】经第一维阴离子交换色谱分离,收集得到15个组分,其中第15组分包含小麦叶片丰度最高的蛋白——1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（RuBisCO）;其余14个组分经反相液相色谱分离,共收集1 551个组分,获得1 867个色谱峰;随机对其中6个含较低吸收峰的收集组分酶解和Nano LC-MS/MS 检测,9种蛋白得到鉴定。【结论】结果初步表明,利用2D-LC和Nano LC-MS/MS技术可有效地分离和鉴定小麦叶片蛋白质组,为更深入全面地研究小麦叶片蛋白质组奠定基础。     

大米抗氧化肽的分离纯化及结构鉴定

通过高效凝胶过滤层析和反相高效液相色谱先后对大米渣蛋白酶解后的多肽溶液进行分离纯化,分别得到组分2和组分RF9;再经反相高效液相色谱-质谱联用对组分RF9进行分析鉴定得到抗氧化肽氨基酸序列L-Q-P-Y(Leu-Gln-Pro-Tyr),分子质量为520.277u。合成的抗氧化肽片段L-Q-P-Y质量浓度为1 mg/mL时,对DPPH自由基清除率达到85.84%。     

勋章菊花粉鞘色素及蛋白分析

为研究勋章菊授粉形式对种子形成的影响,对其花粉鞘及蛋白成分进行分析。结果表明,黄色花粉外层含有类胡萝卜素,经板层分析得到与标准样品β-胡萝卜素具有相同的比移值(Rf值);经花粉表面蛋白色谱-质谱分析发现,大多为30~50 ku;通过搜索、比对蛋白质发现,其中较可信的蛋白有3种,它们的肽段属于驱动蛋白马达结构域,在各自有丝分裂过程中参与染色体的运动和主轴伸长。该结果可为研究菊科植物自交及异交的亲和机制提供理论依据。     

猪乳中两种蛋白质的质谱鉴定

为鉴定猪乳中的蛋白质组分,研究采集了8头大白猪的全乳,经离心脱脂后,采用SDS-PAGE对脱脂乳中的蛋白质进行分离,然后切取凝胶上的3条蛋白质条带,经还原烷基化和胰蛋白酶解处理后,采用液相色谱-串联质谱分析产生的水解肽,以鉴定这3种低分子量蛋白质。结果表明,获得鉴定的2种蛋白质包括β-乳球蛋白(β-LG)和乳清酸蛋白(WAP),其中WAP可能对猪乳的生物学功能有重要价值。     

基于代谢组学分析桃胶中酚类化合物含量及抗氧化活性

为深入了解桃胶的营养价值,首先分析了5种不同颜色桃胶提取液中总酚含量及抗氧化活性差异,然后基于高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱(LC-QTOF-MS)和高效液相色谱串联质谱(LC-MS)的代谢组学方法对桃胶提取液中的酚类物质进行定性定量分析.结果表明,不同颜色桃胶提取液中总酚含量和抗氧化活性存在明显差异,颜色越深总酚含...     

稻瘟病菌分泌蛋白组学研究

稻瘟病菌分泌蛋白在稻瘟病菌入侵水稻过程中发挥重要作用。收集稻瘟病菌(Guy11菌株)液体培养的上清液,富集蛋白,经过烷基、还原处理和酶解后,采用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)对酶解肽段进行分离及鉴定,利用信号肽预测工具SignalP和蛋白质亚细胞定位软件Protcomp对鉴定到的蛋白进行生物信息学预测验证。结果显示,共鉴定出30个稻瘟病菌的分泌蛋白,其中:24个蛋白具有N端信号肽,26个蛋白可分泌到胞外,3个蛋白定位在细胞膜上。对其功能进行分类,发现多数为酶类,参与水解及能量代谢。这些酶类和蛋白的发现与进一步研究,将为揭示稻瘟病菌侵染的机理提供帮助。     

临床型奶牛乳房炎乳腺组织的比较蛋白质组研究

 【目的】采用比较蛋白质组学技术分析、检测了临床健康与乳房炎奶牛乳腺组织中的差异表达蛋白,以寻找药物治疗目标,探讨奶牛乳房炎的发生机理。【方法】采用二维凝胶电泳分离临床健康与乳房炎奶牛的乳腺组织蛋白,考马斯亮蓝染色,PDQuest7.4软件自动匹配检测差异表达蛋白斑点,高效液相色谱串联离子阱质谱分析鉴定。【结果】凝胶图谱中检测出15个差异蛋白斑点,串联质谱分析后有12个蛋白斑点可搜索到相应的结果,对应于10种蛋白质,主要涉及结合、运输和催化活性等分子功能,参与细胞、代谢及生物调节等生理过程。【结论】临床健康与乳房炎奶牛的乳腺组织中蛋白的表达模式存在差异,表达差异蛋白与奶牛乳房炎的发生相关,对其分析有利于探索机体的生理病理状态,还可为揭示奶牛乳房炎的发生机理提供直接依据。     

盐水鸭呈味肽的分离纯化及结构鉴定

为了明确盐水鸭中的关键性呈味肽,对盐水鸭水提物中的小分子肽进行了分离纯化和结构鉴定。采用分级超滤、葡聚糖凝胶Sephadex G-15过滤层析对盐水鸭的小分子肽提取液进行分离纯化,结合感官评定和电子舌分析筛选出其中呈味特性最强的组分,利用纳升液相色谱-电喷雾静电场轨道阱组合式高分辨质谱联用系统对其进行进一步分离纯化和结构鉴定。结果表明:超滤和凝胶分离后得到5个分离组分(F1、F2、F3、F4和F5),经过感官评定和电子舌分析后发现F1组分的稀释因子最高,达128,且与超滤组分(F)的滋味特征相似。因此对F1组分进行液质联用分析,得到7条由6~9个氨基酸残基组成的肽链,其中3条肽链可信度和相对离子强度较高,被鉴定为主要呈味肽,其氨基酸序列分别为Gly-Pro-Asp-ProLeu-Arg-Tyr-Met(GPDPLRYM)、Asp-Pro-Leu-Arg-Tyr-Met(DPLRYM)和Val-Val-Thr-Asn-Pro-Ser-Arg-Pro-Trp(VVTNPSRPW)。这3条肽链中均含有亲水性氨基酸Asp、Asn或Gly,可能产生鲜味、甜味和浓厚感。结论:从盐水鸭的小分子肽提取物中分离鉴定出3条主要的呈味肽,可能对盐水鸭的滋味有一定的贡献。     

高效液相色谱-串联质谱法测定大豆分离蛋白中的三聚氰胺

本文建立了由高效液相色谱-串联质谱法定量准确、快速检测大豆分离蛋白中三聚氰胺的方法。试样中残留的三聚氰胺经1%三氯乙酸溶液提取,经CX固相萃取柱净化,用超高效液相色谱三重四极杆质谱联用仪进行测定,通过外标法定量。三聚氰胺含量在10～100 ng/mL的范围内与峰面积有良好的线性关系,相关系数为0.999 8,检出限为5μg/kg。添加水平分别为0.02、0.05、0.10 mg/kg的样品加标回收率为86.7%～101.6%,测定结果的相对标准偏差均小于5%(n=6)。该方法简便、快速、准确、经济,适用于大豆分离蛋白中三聚氰胺的测定。     

不同温度下福氏志贺菌与其膜囊泡的比较蛋白质组学研究

【目的】对不同温度下福氏志贺菌(Shigella flexneri)及其分泌的膜囊泡进行比较蛋白质组学分析,为进一步理解福氏志贺菌膜囊泡的生物学活性奠定基础。【方法】采用差速离心和密度梯度离心方法,分别富集纯化37℃和30℃培养条件下的野生型福氏志贺菌2a 301株和相应的膜囊泡;借助二维纳升液相色谱-线性离子阱质谱联用系统,对制备得到的4种组分蛋白进行鸟枪蛋白质组学鉴定分析。【结果】37℃和30℃培养条件下,福氏志贺菌菌体蛋白和膜囊泡蛋白的鉴定总数分别为1 510、231、1 412、281,4种组分的共有蛋白数为156。生物信息学分析结果发现:膜囊泡中特异性富集了核糖体结构蛋白和膜起源蛋白,且37℃培养条件下的膜囊泡特异包被了大量三型分泌系统相关蛋白。【结论】运用比较蛋白质组学技术首次分析了不同温度下福氏志贺菌及其膜囊泡的蛋白质组变化,发现一些温度相关的膜囊泡特异包被蛋白,为深入研究膜囊泡的选择性包被奠定基础。     

临床型乳房炎与正常奶牛血浆的差异蛋白质组研究

 【目的】检测和分析临床型乳房炎与正常奶牛血浆中差异表达的蛋白质。【方法】用二维凝胶电泳分离血浆蛋白,凝胶用硝酸银染色和考马斯亮蓝染色,PDQuest7.4软件自动检测分析差异表达蛋白斑点并经高效液相色谱串联离子阱质谱鉴定。【结果】凝胶图谱分析后得到3个差异蛋白斑点,鉴定为2种蛋白质（结合珠蛋白前体和乳腺球蛋白）。结合珠蛋白前体在临床型乳房炎奶牛血浆中表达量增加,可作为乳房炎诊断标记分子;而乳腺球蛋白的表达量下调。【结论】临床型乳房炎与正常奶牛的血浆中蛋白质的表达存在差异,对差异表达蛋白质的研究有利于探索机体的生理病理状态,可为疾病的诊断和治疗提供全面的信息。     

小麦籽粒发育过程中的蛋白质组分析

以京411为材料,研究了籽粒不同发育时期清球蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白三个亚蛋白组的合成与积累特征.采用不同的蛋白提取方法,分别利用双向电泳(2-DE)和生物质谱技术(MS)、SDS-PAGE电泳以及反相高效液相色谱(RP-HPLC)等主要蛋白质组技术进行了鉴定与分析,初步得到了三种蛋白的合成与积累特征,为今后小麦发育蛋白质组学以及品质改良研究提供了科学依据.