小麦秆锈病新抗源及抗病基因所在染色体特异分子标记

【目的】小麦秆锈病是具潜在毁灭性的小麦病害之一,秆锈菌小种Ug99严重威胁全球小麦生产。本研究通过对165份小麦-近缘植物染色体系进行抗秆锈病鉴定,筛选小麦秆锈病新抗源并建立抗病基因所在染色体特异分子标记,以发掘小麦秆锈病新抗源,培育抗病品种,有效防御Ug99导致的秆锈病。【方法】将供试的165份小麦-近缘植物染色体系、3份六倍体小麦及感病对照小密穗分别播种于直径10 cm的瓦盆中,生长到一叶一心时,用中国小麦秆锈菌流行小种34MKGQM和21C3CTHSM进行接种,当感病品种小密穗充分发病时,按照0-4级标准调查记载侵染型,对供试材料的抗秆锈病级别进行统计。同时,提取免疫、近免疫、高抗秆锈病附加系/代换系及其对应的整套染色体系、中国春等材料的基因组DNA,利用101对PLUG引物进行PCR扩增,扩增产物经限制性内切酶酶切后进行电泳检测,筛选并建立抗秆锈基因所在染色体特异分子标记。【结果】在165份小麦-近缘植物染色体系中,中国春-卵穗山羊草7M^g#1附加系、中国春-卵穗山羊草7M^g#1(7A)和7M^g#1(7B)代换系、中国春-帝国黑麦1R附加系、中国春-中间偃麦草?Ai附加系（?表示外源染色体同源群未鉴定）、中国春-单芒山羊草6N附加系、中国春-易变山羊草6S^vS端体附加系和中国春-智利大麦6H^ch附加系9份材料对秆锈病表现为免疫或近免疫;ALCD-尾状山羊草7C#1附加系、中国春-卵穗山羊草7M^g#1(7D)代换系、中国春-帝国黑麦6R附加系、中国春-高大山羊草6S^l#3附加系、中国春-高大山羊草6S^l#2(6B)代换系、中国春-希尔斯山羊草3S#1附加系和中国春-拟斯卑尔脱山羊草2S^g#3附加系7份材料对秆锈病表现为高抗;其余材料均表现为中感或高感。抗秆锈性基因定位信息比较分析发现,高大山羊草6S^l#2和6S^l#3、帝国黑麦6R、智利大麦6H^ch、卵穗山羊草7M^g#1、尾状山羊草7C、中间偃麦草?Ai染色体上可能含有抗秆锈新基因。分子标记筛选、定位及特异性验证研究共获得8个新的多态性标记,其中5个（TNAC1715、TNAC1718、TNAC1737、TNAC1739和TNAC1753）和3个（TNAC1740、TNAC1751和TNAC1756）分别被定位在6R和6S^l染色体上。【结论】筛选得到8份可能含有抗秆锈新基因的材料,建立了抗秆锈基因所在染色体特异新标记8个。     

PLUG引物和IT引物在顶芒山羊草分子标记建立中的通用性分析

分子标记是检测和追踪小麦背景中近缘物种染色体的重要手段。依据禾本科物种基因共线性原则,基于基因序列设计的引物在不同物种中可能具有通用性。本研究对水稻PLUG引物和簇毛麦IT引物在顶芒山羊草中的通用性进行了分析,并建立了顶芒山羊草染色体特异IT标记。供试的397对PLUG引物和841对IT引物对小麦-顶芒山羊草双二倍体与中国春的扩增结果显示,377对(95.0%)PLUG引物和593对(70.5%)IT引物可以在供试材料中扩增出清晰条带。因此,PLUG引物在顶芒山羊草中的通用性优于IT引物。相比小麦对照,PLUG引物和IT引物能在小麦-顶芒山羊草双二倍体中扩增出多态性条带的引物数分别有17对和5对,分别占供试PLUG引物和IT引物的4.3%和0.6%。利用获得的IT多态性引物对一套小麦-顶芒山羊草附加系和一套小麦-卵穗山羊草附加系进行扩增,结果发现仅引物CINAU1060、CINAU1465和CINAU1517能在相应附加系中扩增出大小分别约为300、480 bp和320 bp的多态性标记,为小麦背景中顶芒山羊草染色质的鉴定提供了新的检测手段。然而,本研究中IT引物建立顶芒山羊草分子标记的比率仅为0.4%,低于我们之前用PLUG引物建立顶芒山羊草分子标记的比率(8.9%)。     

单芒山羊草染色体组优异基因发掘

单芒山羊草是小麦遗传改良的优异基因源,为发掘其基因组优异基因,以中国春小麦为对照,对一套中国春-单芒山羊草附加系进行农艺性状调查、抗病性鉴定以及品质性状测定。结果发现,单芒山羊草5N染色体上含有矮秆基因,1N和7N染色体上含有密穗基因;1N染色体上具有抗小麦条锈病基因;4N染色体导入小麦能够显著提高小麦品质。这些优异基因可用于小麦染色体工程育种中。     

用AFLP标记一个来自偏凸山羊草的抗条锈病新基因 YrG775

 对小麦抗病种质贵农775与西农97148的F2后代人工接种CY32条锈病菌进行抗性鉴定，通过卡方检测抗感病单株分离比例确定贵农775携带两对重叠抗条锈病基因。从128个AFLP引物组合中筛选到与其中一个抗病基因YrG775共分离的多态性标记M8P151200bp，该标记仅能在原始亲本偏凸山羊草中检测到。由于已知来源于偏凸山羊草的Yr17苗期不抗CY32条锈病菌，所以根据抗性鉴定和分子生物学试验结果，推断YrG775很可能是一个来自偏凸山羊草并与已知抗条锈病基因都不同的新基因。     

普通小麦-华山新麦草异附加系的SSR分析

为了建立一套完整的小麦-华山新麦草异附加系,从筛选出的46对在华山新麦草与小麦间具有多态性的SSR引物中选出7对扩增条带清晰的引物,对20个小麦-华山新麦草二体附加系进行归类分析。结果发现:出现了11个小麦-华山新麦草异附加系类型,说明在这20个附加系中包括了华山新麦草7个同源群的附加系,并探讨了小麦与华山新麦草杂交及其后代衍生过程中发生华山新麦草染色体间重排的可能。     

山羊草及普通小麦遗传多样性的研究

使用微卫星荧光标记-全自动基因分析仪(3700 DNA Analyzer)，用43对D染色体组引物标记76份普通小麦、粗山羊草、拟斯卑尔脱山羊草和尾状山羊草品种和材料，将其结果进行聚类分析，共聚成四类：普通小麦被聚成一类，粗山羊草被聚成两类，拟斯卑尔脱山羊草、尾状山羊草和部分来自巴基斯坦的粗山羊草聚成一类。聚类结果与现有的植物学分类的结果相一致。     

寡聚核苷酸FISH在鉴定小麦-单芒山羊草种质中的应用

在小麦-单芒山羊草杂交种质鉴定研究中,尚缺乏可同时鉴定小麦和单芒山羊草染色体的细胞遗传学方法。本研究用寡聚核苷酸Oligo-p Sc119.2-1和Oligo-p Ta-535-1为探针的双色FISH和以(GAA)8为探针的单色FISH分别对小麦-单芒山羊草双二倍体、中国春-单芒山羊草附加系进行分析,建立了可以同时鉴定小麦和单芒山羊草全部染色体的FISH标准核型。同时,利用建立的FISH标准核型在1N附加系自交后代材料中发现了5BS.3BS和5BL.3BL易位,在5N附加系自交后代中发现5NL端部寡聚核苷酸序列删除现象,这为研究染色体结构变异与表型变化的关系等提供了研究材料。此外,还在4N附加系自交后代中发现4B染色体丢失现象,造成该附加系自发形成4N(4B)代换系,为诱导产生涉及4N染色体的小麦-单芒山羊草罗伯逊易位系奠定了基础。     

普通小麦-簇毛麦易位系T4VS·6AL的选育

在小麦背景中离果山羊草3C染色体具有优先传递的作用.当离果山羊草3C染色体处于单体状态时会导致后代不含有杀配子染色体的配子中产生包括缺失和易位等染色体结构变异.簇毛麦4V染色体携有抗小麦眼斑病和全蚀病基因.为进一步利用簇毛麦4V染色体上的有益基因.利用染色体C-分带和基因组原位杂交分析,从普通小麦-簇毛麦4V染色体二体异附加系(DA4V)与普通小麦农林26-离果山羊草3C染色体二体异附加系(DA3C)杂种后代中选育出小麦-簇毛麦纯合易住系T4VS·6AL.该易位系为杀配子染色体诱发形成的非补偿型易位;易位系T4VS·6AL高抗梭条花叶病.是小麦抗病育种的新种质.     

普通小麦大赖草易位系T3AS·3AL-7Lr#1S的分子细胞遗传学鉴定

大赖草对赤霉病具有较好的抗性,将大赖草赤霉病抗性基因转入普通小麦,对拓宽小麦赤霉病抗性基础有重要意义。本研究在获得抗赤霉病普通小麦-大赖草异附加系基础上,采用1 200 R ⁶⁰Co-γ射线处理小麦-大赖草二体附加系DA7Lr花粉,授予已去雄的普通小麦中国春,对其后代(M₁)种子根尖细胞有丝分裂中期染色体进行GISH分析,获得了1株具有1条普通小麦-大赖草易位染色体的植株,让其自交,对自交后代中具有2条易位染色体植株的花粉母细胞减数分裂中期Ⅰ进行观察,发现2条易位染色体形成了稳定的环状二价体,表明该植株为纯合体。利用顺序GISH-双色FISH分析,结合C-分带、小麦D基因组专化探针Oligo-pAs1-2和B基因组专化探针Oligo-pSc119.2-2,进一步鉴定出该普通小麦-大赖草易位系为T3AS·3AL-7Lr#1S,且筛选出了可追踪该易位系的3个EST-STS分子标记BE591127、BQ168298和BE591737。该易位系的育成为小麦赤霉病遗传改良提供了新种质。     

李种质资源ISSR反应体系引物筛选

以李18个品种种质资源为试验材料,对其开展ISSR反应体系引物筛选,结果表明,从41个随机引物中筛选出25个多态性引物用于PCR扩增,每个多态性引物扩增出的条带数在8～23条之间,扩增出的DNA片段长度大多在150～2 400 bp之间;共扩增出条带数为385条,其中,样品间相同的条带数有53条;所选引物的多态位点百分率为86.23%。     

普通小麦-簇毛麦易位系T4VS·6AL的选育

在小麦背景中离果山羊草3C染色体具有优先传递的作用。当离果山羊草3C染色体处于单体状态时会导致后代不含有杀配子染色体的配子中产生包括缺失和易位等染色体结构变异。簇毛麦4V染色体携有抗小麦眼斑病和全蚀病基因。为进一步利用簇毛麦4V染色体上的有益基因,利用染色体C-分带和基因组原位杂交分析,从普通小麦-簇毛麦4V染色体二体异附加系（DA4V）与普通小麦农林26-离果山羊草3C染色体二体异附加系（DA3C）杂种后代中选育出小麦-簇毛麦纯合易位系T4VS·6AL。该易住系为杀配子染色体诱发形成的非补偿型易位;易位系T4VS·6AL高抗梭条花叶病。是小麦抗病育种的新种质。     

普通小麦-簇毛麦易位系T6BS·6BL-2VS的选育

[目的]为进一步利用簇毛麦2V染色体上的有益基因,为小麦育种提供新种质。[方法]通过普通小麦-簇毛麦2V(2D)二体代换系(DS2V)与普通小麦农林26-离果山羊草3C染色体二体异附加系(DA3C)杂交,综合运用染色体C-分带、基因组原位杂交和分子标记分析,并结合性状调查。[结果]从杂种后代中选育出小麦-簇毛麦纯合易位系T6BS.6BL-2VS,性状调查发现该易位系植株护颖颖脊上有刚毛。[结论]该易位系为杀配子染色体诱发的小片段易位;簇毛麦护颖颖脊刚毛基因定位于2VS的中部至端部。     

利用PCR技术初步鉴定小麦-加州野大麦异染色体系

为快速鉴定普通小麦与普通小麦—加州野大麦双二倍体杂交、回交后代植株的染色体组成，研究小麦背景中添加的外源染色体与小麦染色体之间的部分同源关系，选用已被定位在小麦7个部分同源群21条染色体上的38个SSR引物对杂种回交后代植株进行PCR扩增。结果表明，其中27个小麦SSR引物在普通小麦与小麦—加州野大麦双二倍体间有多态性扩增，涉及4个部分同源群的11对引物，可在不同杂种回交植株中扩增出与双二倍体相同的多态带纹；根据PCR扩增和细胞遗传学分析的结果，在18个回交后代中初步鉴定出7个可能的异附加系，其中2个二体异附加系、1个端二体异附加系、2个单体异附加系和2个双单体异附加系。所选育的异附加系分别涉及第1、2、4和7部分同源群。     

普通小麦-簇毛麦易位系T6BS·6BL-2VS的选育

[目的]为进一步利用簇毛麦2V染色体上的有益基因,为小麦育种提供新种质。[方法]通过普通小麦-簇毛麦2V（ZD）二体代换系（DS2V）与普通小麦农林26-离果山羊草3c染色体二体异附加系（DA3C）杂交,综合运用染色体C-分带、基因组原位杂交和分子标记分析,并结合性状调查。[结果]从杂种后代中选育出小麦-簇毛麦纯合易位系T6BS·6BL-2VS,性状调查发现该易位系植株护颖颖脊上有刚毛。[结论]该易位系为杀配子染色体诱发的小片段易位;簇毛麦护颖颖脊刚毛基因定位于2VS的中部至端部。     

偏凸山羊草的抗条锈病新基因YrG775的AFLP标记

对小麦抗病种质贵农775与西农97148的F2后代人工接种CY32条锈病菌,对其进行了抗性鉴定,通过卡方检测抗感病单株分离比例,确定贵农775携带有2对重叠抗条锈病基因。从128个AFLP引物组合中,筛选到与其中1个抗病基因YrG775共分离的多态性标记M8P15(1 200 bp),该标记仅能在原始亲本偏凸山羊草中检测到。由于已知来源于偏凸山羊草的Yr17苗期不抗CY32条锈病菌,所以根据抗性鉴定和分子生物学试验结果,推断YrG775很可能是1个来自偏凸山羊草,并与已知抗条锈病基因都不同的新基因。     

大赖草染色体对小麦光合特性和产量性状的效应

大赖草是改良小麦的重要近缘植物,目前已育成多个小麦-大赖草二体附加系和代换系,然而对大赖草染色体的光合效应和对产量性状的效应却研究较少。因此,了解大赖草染色体的效应,对进一步利用大赖草外源基因具有指导作用。通过光合仪测定和产量性状调查,对小麦-大赖草二体附加系、代换系和亲本中国春进行了鉴定,结果表明,10个异染色体系的净光合速率均低于对照普通小麦中国春,但多数差异不显著。大赖草E染色体具有增加水分利用效率的正向效应。大赖草E、J染色体能够提高小麦单穗粒重和千粒重,对提高小麦产量具有正效应。     

中国春-柱穗山羊草杀配子染色体2C附加系与小麦-冰草附加系杂交F2的细胞学特性

 【目的】对5个小麦-冰草附加系与中国春-杀配子染色体2C附加系杂交F2的减数分裂进行观察,分析杀配子染色体在小麦-冰草附加系背景下诱导染色体变异的有效性,为获得小麦-冰草染色体易位奠定基础。【方法】杂交F2植株幼穗减数分裂染色体行为观察采用常规细胞学方法,冰草P染色质的检测采用GISH方法。【结果】杂交F2PMC减数分裂中期普遍观察到多个单价体、多价体以及落后染色体和断片,多数组合观察到染色体桥,个别组合出现单价环状染色体。杂交F2减数分裂染色体存在异常现象：平均36.5%的细胞中有多个单价体,15.8%的细胞含有多价体,31.6%和11.7%的细胞中含有染色体断片和桥,四分体时期存在微核、多裂和四分孢子退化现象。F2植株的自交结实率平均为31.47%。对部分F2植株的减数分裂细胞GISH检测表明,P染色体多为单体附加,有2.7%的植株可能产生染色体易位。【结论】较高频率的染色体断裂和部分配子致死是杀配子染色体诱导变异的典型特征,柱穗山羊草2C杀配子染色体在小麦-冰草附加系背景下能够有效诱导染色体产生结构变异,这种诱变作用和频率在不同附加系背景下存在差异。     

普通小麦大赖草易位系T3AS·3AL-7Lr#1S的分子细胞遗传学鉴定

大赖草对赤霉病具有较好的抗性,将大赖草赤霉病抗性基因转入普通小麦,对拓宽小麦赤霉病抗性基础有重要意义。本研究在获得抗赤霉病普通小麦-大赖草异附加系基础上,采用1 200 R ~(60)Co-γ射线处理小麦-大赖草二体附加系DA7Lr花粉,授予已去雄的普通小麦中国春,对其后代(M_1)种子根尖细胞有丝分裂中期染色体进行GISH分析,获得了1株具有1条普通小麦-大赖草易位染色体的植株,让其自交,对自交后代中具有2条易位染色体植株的花粉母细胞减数分裂中期Ⅰ进行观察,发现2条易位染色体形成了稳定的环状二价体,表明该植株为纯合体。利用顺序GISH-双色FISH分析,结合C-分带、小麦D基因组专化探针Oligo-pAs1-2和B基因组专化探针Oligo-pSc119.2-2,进一步鉴定出该普通小麦-大赖草易位系为T3AS·3AL-7Lr#1S,且筛选出了可追踪该易位系的3个EST-STS分子标记BE591127、BQ168298和BE591737。该易位系的育成为小麦赤霉病遗传改良提供了新种质。     

小麦抗旱相关基因TaGSTF6的多态性

【目的】研究TaGSTF6基因多态性与抗旱性的关系。植物谷胱甘肽-S-转移酶（GSTs）是一类重要的受逆境胁迫诱导表达的酶类，能减少干旱等逆境胁迫导致的体内活性的氧积累，在植物的抗旱反应中发挥重要作用。【方法】以86份抗旱性不同的普通小麦品种和7份粗山羊草为材料，检测TaGSTF6基因的核苷酸序列长度及碱基组成多态性，并预测氨基酸序列多态性。【结果】Northern分析结果表明，小麦幼苗中TaGSTF6基因受水分胁迫诱导表达。序列多态性分析发现在长达113.6 kb的核苷酸序列中有47个单核苷酸变异位点，其中23个SNP，24个InDel，二者的频率分别为1SNP/4 940bp和1InDel/4 734bp，粗山羊草中SNP和InDel出现的频率明显高于普通小麦；仅在11份材料中预测到氨基酸序列多态性。根据核苷酸序列变异可能导致的氨基酸变异把基因编码区的变异分为两类：核苷酸转换或颠换导致的单个氨基酸变异；碱基缺失导致的移码突变或翻译提前终止，其中大多数变异属于移码突变。【结论】尽管小麦基因组庞大，重复序列多，但在功能基因TaGSTF6中SNP的分布频率非常低；虽然TaGSTF6受水分胁迫诱导表达，但其结构多态性分析未能揭示其多态性与小麦抗旱性之间的直接关系。     

小麦条锈病不同抗性材料中分子标记YrY201-1分布研究

以22个抗病品种、4个感病品种以及12个野生近缘材料的基因组DNA为模板进行PCR扩增,检测小麦抗条锈病基因分了标记YrY201-1的分布.结果表明:YrY201-1具有较高的扩增效率(96.2%,25/26);在4个感病材料中均能扩增出目标条带;在野生近缘材料中扩增效率也较高(91.7%,11/12),且在多数材料中扩增条带较多,除目标产物外还有许多非特异性扩增产物出现;在抗性基因YrY201的来源材料J11(粗山羊草)中该标记只扩增出1条特异性条带,但比预期目标条带稍大.