番茄斑萎病毒N基因的VIGS载体构建

目的研究番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt orthotospovirus,TSWV) 核衣壳蛋白基因(N)对辣椒抗病性的影响。方法以易感TSWV的辣椒湘研11为研究对象,采用同源序列克隆获得辣椒CaPDS基因和TSWV N基因;利用烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)和病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)技术构建辣椒CaPDS基因沉默载体(pTRV2-CaPDS)和TSWV N基因沉默载体(pTRV2-N),农杆菌GV3101注射接种辣椒,通过qRT-PCR检测重组载体沉默效率。结果湘研11接种含pTRV2-CaPDS载体菌液3周后,新叶出现白化现象,说明辣椒上的pTRV2-CaPDS沉默载体构建成功。qRT-PCR结果表明：pTRV2-N载体可高效沉默N基因,其表达量仅为6.79%±2.56%,说明沉默N基因后,湘研11不易感染TSWV。结论本研究成功构建了pTRV2-N沉默载体,沉默TSWV的N基因后辣椒对入侵的TSWV产生一定的抗性。     

番茄环纹斑点病毒的研究进展

近年来,番茄环纹斑点病毒(Tomato zonate spot virus,TZSV)在我国云南、广西的多个地区暴发流行,严重危害当地农业生产.本文对该病毒的生物学特性、地理分布、寄主范围、危害症状、传播途径和检测技术等进行归纳总结,旨为TZSV的研究和病害防控提供参考.     

桑树PDS基因VIGS转化体系的构建与鉴定

[目的]建立桑树的病毒诱导基因沉默(VIGS)转化体系,为桑树功能基因的分析研究提供技术支持.[方法]以丰驰桑为试验材料,克隆含BamH I和Xba I酶切位点的八氢番茄红素脱氢酶(PDS)基因片段,经Xba I和BamH I双酶切后与烟草脆裂病毒(TRV)连接构建重组病毒载体pTRV2-PDS,转化农杆菌GV3101后通过压迫注射方式侵染桑树幼苗叶片.[结果]克隆获得的桑树PDS基因干扰片段346 bp,与改造后的TRV质粒连接可成功构建携带桑树PDS基因的重组病毒载体pTRV2-PDS.桑树叶片被侵染15 d后,接种重组病毒载体pTRV2-PDS桑树的第二轮真叶开始出现叶片白化现象,侵染20 d后,白化现象沿叶脉向四周逐渐扩散,叶片呈现明显的白化表型.实时荧光定量PCR检测结果显示,重组病毒载体pTRV2-PDS侵染的桑叶PDS基因相对表达量仅为阴性对照(pTRV2)的58%,二者差异极显著(P<0.01),表明桑树PDS基因表达被有效抑制.[结论]利用TRV构建的桑树VIGS体系能有效沉默PDS基因,使桑树叶片呈现明显的白化症状,即可用于后续的桑树功能基因鉴定.     

番茄环纹斑点病毒非结构蛋白NSs的原核表达及多抗血清制备

用RT-PCR从感染番茄环纹斑点病毒(Tomato zonate spot virus,TZSV)的番茄中扩增出编码病毒非结构蛋白NSs基因,将NSs基因构建到原核表达载体p ET-30 a中,获得原核表达载体p ET-30a-NSs,转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达。SDSPAGE电泳分析显示,高效诱导表达了57k Da融合蛋白。用回收纯化的融合蛋白免疫家兔,获得多抗血清。间接ELISA测定多抗血清的效价为1/8192。用制备好的抗血清对TZSV感病病样进行Western blotting检测,能检测到特异性条带。结果表明该抗血清可用于TZSV的检测,并为进一步研究NSs功能奠定了基础。     

国际病毒分类委员会 (ICTV) 2017分类系统与第九次分类报告的比较及数据分析

目的番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt orthotospovirus,TSWV)在全球范围内严重危害农业生产,病毒诱导的基因沉默 (virus-induced gene silencing,VIGS) 技术主要用于植物内源基因的功能研究,而其沉默植物外源病毒基因用于病毒防控鲜有报道。本研究利用VIGS技术在辣椒中沉默植物外源病毒TSWV的NSm基因,为辣椒产业防控TSWV病害奠定技术基础。方法以辣椒(Capsicum annuum L.)为研究材料,首先构建辣椒PDS基因的沉默载体pTRV2-PDS以评估该沉默载体在辣椒中的有效性,再构建TSWV NSm基因的沉默载体pTRV2-NSm评估该沉默载体对TSWV NSm基因的沉默效果。结果构建的沉默载体pTRV2-PDS在辣椒中有效,沉默载体pTRV2-NSm可以高效沉默TSWV的NSm基因,NSm的表达量仅为对照组的4.6%,且表现出对TSWV的抗性。结论构建的沉默载体pTRV2-NSm可以沉默TSWV的NSm基因,并使辣椒对TSWV产生一定的抗性。     

TMV 和 PVX 胁迫下云烟和番茄实时荧光定量内参基因筛选

合适的内参基因是采用实时荧光定量PCR研究基因表达获得可信数据的基础.为了获得合适的内参基因,更好地研究烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)和马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)与烟草和番茄2种寄主的互作,本项研究根据已报道的云烟和番茄看家基因设计引物,使用geNormPlus软件分别对其在TMV和PVX侵染下的云烟97和番茄中表达量的稳定性进行了评估.结果表明:2种寄主植物中供试看家基因中各有4对引物满足qPCR的要求,分别是云烟tub,CYP,GAPDH,β-tub,番茄18S,UK,ACT,EFl-α.在2种病毒侵染后的云烟内参基因中表达最稳定的为CYP,番茄中内参基因为ACT.最终确定这2个看家基因分别作为实时荧光定量PCR研究烟草和番茄在TMV和PVX胁迫下寄主体内基因表达变化的内参基因.该结果为进一步探讨2种病毒共同侵染时,它们与烟草和番茄2种寄主互作生物学效应研究奠定了基础.     

拟环纹豹蛛热休克蛋白20基因的克隆与分析

[目的]克隆拟环纹豹蛛热休克蛋白20基因(HSP20),并分析其在镉胁迫下的表达情况,为揭示蜘蛛抵御重金属胁迫机制提供参考.[方法]以拟环纹豹蛛雌蛛为试验材料,在转录组测序的基础上,通过RT-P CR克隆拟环纹豹蛛HSP20基因(PpHSP20),用生物信息学方法对其序列特征进行分析,并采用荧光定量PCR检测镉胁迫下PpHSP20基因的相对表达量.[结果]克隆获得的PpHSP20基因编码区长525 bp,编码174个氨基酸,其编码蛋白分子量20.08 kD,等电点5.97,具有小分子热休克蛋白家族典型的α-晶状体蛋白结构域,与温室拟肥腹蛛(Parasteatoda tepidario-rum)α-晶体蛋白A有较高的相似性(58%).荧光定量PCR分析结果显示,镉胁迫下PpHSP20基因的表达量显著增加(P<0.05).[结论]拟环纹豹蛛HSP20基因在抵御镉胁迫中发挥调控作用,可作为研究蜘蛛抵御镉胁迫的重要候选基因和潜在的生物标记物.     

适于烟草脆裂病毒诱导的本氏烟基因沉默分析的对照载体构建(英文)

对烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)诱导的基因沉默分析体系中目前最常用的对照载体——空pYL156载体(pYL156∷00)对沉默处理后番茄和本氏烟(Nicotiana benthamiana)植株的病毒症状和生长影响进行分析.结果表明:pYL156∷00沉默处理后的番茄和本氏烟植株均表现出严重的系统性病毒症状,生长受到显著抑制,因此,pYL156∷00并不是一个用于TRV诱导的番茄和本氏烟基因沉默分析的好的对照载体;为获得更好的对照载体,试验构建了2个新的对照载体pYL156∷NIRi和pYL156∷eGFP,它们分别通过在pYL156∷00载体多克隆位点插入253bp菜豆亚硝酸还原酶基因内含子序列和400bp eGFP基因片段而获得,对这2个对照载体对沉默处理后本氏烟植株的病毒症状和生长情况的影响与pYL156∷00进行比较分析.结果表明:pYL156∷00沉默处理后的植株表现出较严重的系统性病毒症状,生长受到显著抑制,其中26.7%植株死亡;pYL156∷NIRi沉默处理后的植株也表现出明显的病毒症状以及生长受抑制现象,但与pYL156∷00相比,所受影响较小,只有13.3%植株死亡;而pYL156∷eGFP沉默处理后的植株不表现明显的病毒症状,植株生长也不受显著影响;病毒积累量检测结果显示,3个对照载体沉默处理的植株病毒症状和生长受抑制情况与植株体内TRV病毒的积累水平密切相关.这些结果表明,新构建的pYL156∷eGFP可以作为一个优越的对照载体应用于TRV诱导的基因沉默分析.     

TaqMan探针实时荧光定量PCR检测番茄黄化曲叶病毒

根据番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)外壳蛋白(CP)基因序列上的保守序列,设计特异性的引物和Taqman探针,建立荧光定量PCR方法。结果表明,试验建立的标准曲线循环阈值(Ct值)与模板浓度具有良好的线性关系,相关系数为0.9941;能检测到1 000个病毒拷贝,灵敏度比普通PCR高100倍;与番茄花叶病毒和黄瓜花叶病毒无交叉反应,特异性强、重复性佳,为TYLCV检测提供了一种特异、灵敏、快速的定量检测方法。     

病毒诱导的基因沉默

    "病毒诱导的基因沉默"(virus-induced gene silencing,VIGS)一词最早用于描述被病毒侵染的植物的"恢复"现象,是一种植物抗病毒侵染的自然机制,现在已被开发成通过插入目的基因片段的重组病毒抑制植物内源基因表达的遗传技术,用于基因功能分析VIGS由小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)驱动,siRNA单链与RNA诱导的沉默复合物(RNA induced silencing complex,RISC)结合后,特异性地和与siRNA同源的靶标RNA结合,并降解RNA模板已有源于15种不同类型病毒的VIGS载体得到开发和应用在VIGS栽体中插入的目的片段、重组VIGS病毒载体的植物导入方法、沉默处理时的寄主生育期、沉默处理后的植物培育条件等均显著影响VIGS的效率作为一种新型的基因鉴定和功能研究技术工具,VIGS具有无需事先知道目的基因全长序列、获取表型迅速、无需构建转基因植株等诸多优点,已越来越广泛地被应用于植物基因功能研究     

TRV介导的大豆基因瞬时沉默体系的建立

【目的】病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing,VIGS）技术已在植物基因功能研究领域得到广泛应用。建立以TRV为载体介导的大豆基因瞬时沉默体系,为将烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus,TRV）介导的基因沉默技术在大豆与大豆花叶病毒（Soybean mosaic virus,SMV）互作体系中对大豆基因功能进行研究提供基础。【方法】从大豆品种冀豆7号（J7）叶片中特异性扩增八氢番茄红素脱氢酶基因（GmPDS）的部分片段,并将该基因片段插入质粒pTRV﹕RNA2中;向J7的第一位真叶注射携带有TRV或TRV﹕GmPDS的农杆菌,注射后对上部未接种病毒的叶片进行表型观察,并通过半定量RT-PCR检测GmPDS的表达量。为探讨接种TRV是否影响大豆对SMV的抗性表现,在大豆第一片真叶上预接种TRV病毒后10 d,再分别接种SMV株系N3和SC-8,以单独接种N3或SC-8作为对照。待接种SMV后第5天观察未接种的上位叶表型并检测SMV的外壳蛋白基因CP。【结果】大豆叶片注射携带有TRV﹕GmPDS的农杆菌后25 d,上部未接种病毒的叶片出现了白化现象,通过半定量RT-PCR分析,发生白化的植株中GmPDS的表达量明显降低。在此基础上,向大豆叶片预注射携带有TRV的农杆菌后再接种SMV,SMV株系N3和SC-8与J7分别组成不亲和与亲和组合。 发现J7第一片真叶上预接种TRV后再接种SMV株系N3,与单独接种N3对上位叶的影响在表型上表现一致,对未接种的上位叶片进行病毒外壳蛋白基因CP检测,发现J7单独接种N3以及预接种TRV后再接种N3的上位叶片上均未能检测到CP表达。而J7单独接种SMV株系SC-8,以及预接种TRV后再接种SC-8均在上位叶上能够检测到CP。说明在J7上预接种TRV不影响J7对SMV的抗性。在感病品种南农1138-2上也获得了相似结果。【结论】建立了以TRV为载体介导的大豆基因瞬时沉默体系,并证明在大豆上先接种TRV不改变大豆对SMV的抗性表现。     

VIGS介导的转复制酶基因番木瓜对PRSV的抗性

将PCR检测呈阳性的T4代转复制酶(replicase,Rep)基因番木瓜植株在苗期接种番木瓜环斑病毒(Papaya ringspot virus,PRSV)Ys株系,定期采取不同部位的叶片进行Northern blot分析.结果表明:接种PRSV之前,在植株的各部位均能检测到转基因完整的Rep mRNA,但接种后不同时间在接种叶以上部位陆续出现了Rep mRNA的降解;接种后30 d内,接种叶下部第1片叶上始终未出现Rep mRNA的降解;另外,在发生mRNA降解的叶片上都能相继检测到小分子干涉RNA(short interferring RNA,si RNA)的产生.这说明转基因番木瓜的抗病性与mRNA的降解及siRNA的积累有着密切的关系.这种抗性发生在转录后水平上,是由病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)介导产生的.     

甲基茉莉酸和草酸诱导油菜BN10基因的表达

利用实时荧光定量PCR方法,观察油菜BN10基因在根、茎、叶中的表达差异,并分析甲基茉莉酸(MeJA)和草酸(OA)对该基因的诱导表达的动态变化。结果表明:BN10基因在油菜根、茎、叶中均能表达,其中在根中的表达量最高,茎中的表达量次之,在叶中的表达量最低,且在抗病毒品种苏油1号中的表达量高于感病品种中双9号;BN10的表达受MeJA和OA的诱导影响。MeJA诱导处理感病品种中双9号叶片后,BN10基因表达先升后降,在24h时表达量最高,为诱导前的2.58倍,之后有所下降,但诱导后的表达量始终高于诱导前,72h时的表达量仍为诱导前的1.13倍;OA诱导处理中双9号后,BN10表达量也是先增加后降低,在12h时达到最大值,为诱导前的2.5倍,72h时下降至最低,仅为诱导前的25%。MeJA诱导处理抗病品种苏油1号后,BN10的表达趋势与中双9号相似,但各时间点的表达量均高于中双9号;OA诱导处理苏油1号后,对BN10的诱导更强烈,表达量在6h时即达到峰值,为诱导处理前的3.05倍,之后逐渐下降。     

不同激素处理下番茄实时荧光定量聚合酶链反应内参基因的筛选

为筛选出在不同激素诱导下番茄中较为稳定的内参基因,本研究以脱落酸(abscisic acid,ABA)、茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)、水杨酸(salicylic acid,SA)3种外源激素分别诱导处理0、24、48、120 h的感病番茄品种‘Moneymaker’(MM)和抗病番茄自交系62579叶片为试验材料,通过实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)进行扩增,利用geNorm、NormFinder和BestKeeper 3个软件分析EF1α、L33、Act、Ubi、GAPDH、UK、CAC、TIP41这8个番茄候选内参基因的表达稳定性。结果表明,8个候选内参基因的平均C_T值为26～34。综合3个软件的分析结果发现,在ABA诱导下,番茄中较稳定表达的内参基因为L33和Ubi;在MeJA诱导下,番茄中较稳定表达的内参基因为L33和EF1α;在SA诱导下,番茄中较稳定表达的内参基因为EF1α和L33。综上所述,L...     

番茄黄化曲叶病毒CP基因的原核表达载体构建选择

[目的]筛选出目的蛋白能够高效表达的重组质粒。[方法]利用原核表达载体pET-32a(+)和pET-28a(+)成功构建了番茄黄化曲叶病毒(Tomato Yellow Leaf Curl Virus,TYLCV)外壳蛋白(Coat Protein,CP)基因的重组质粒p32a-CP和p28a-CP,并通过PCR和双酶切鉴定了序列连接的正确性;再分别将2个载体转化至BL21(DE3)中,采用不同浓度的IPTG对其进行诱导表达,并进行SDS-PAGE电泳检测。[结果]测序结果显示TYLCV-CP基因已定向插入p32a-CP和p28a-CP中;SDS-PAGE电泳结果显示分子量约为50 kD的目的蛋白在重组载体p32a-CP中得到了高效表达,而在重组载体p28a-CP中未表达。[结论]为下一步的抗体制备及TYLCV的免疫学检测奠定了基础。     

病毒诱导基因沉默的研究进展

对病毒诱导的基因沉默(VIGS)的发现、载体的开发、作用机理和优势的研究,以及VIGS在植物基因功能鉴定上的应用和展望进行了综述.     

TaqMan实时荧光PCR快速检测斑点叉尾鮰病毒

根据GenBank登录的斑点叉尾鮰病毒株ORF8基因序列,设计引物和Taqman荧光探针,建立了用于检测斑点叉尾鮰(Ictalurus Punctatus)病毒的实时荧光定量PCR方法;对实时荧光定量PCR反应条件进行了优化,评估了该方法的特异性、灵敏度和重复性,并建立了绝对定量方法。特异性试验证实,该方法只能检测到斑点叉尾鮰病毒,与真鲷虹彩病毒、蛙虹彩病毒、锦鲤疱疹病毒、鳜鱼传染性脾肾坏死病毒等多种常见的水生动物病毒没有交叉反应,具有高度的特异性。标准曲线表明,在3.3×10~3.3×107拷贝数之间有较好的线性关系(r=0.998 3),最少可检测到33个拷贝的阳性质粒,敏感度很高。同一样品于试验内及试验间的重复性试验发现,变异系数分别为0.7%和1.2%,重复性较好。该方法的检测时间从核酸抽提到出具结果仅需3h。试验结果表明,采用实时荧光PCR检测斑点叉尾鮰病毒方法具有特异性好、灵敏度高、检测耗时短的特点,并且能对病毒进行准确的定量分析,不仅适合口岸进出口检验检疫的需求,而且可以作为研究该病毒感染过程的有力工具。     

3种番茄斑萎病毒属病毒侵染寄主植物的细胞病理特征

应用超薄切片电镜观察,对3种番茄斑萎病毒属(Tospovirus)病毒侵染寄主细胞病理特征进行了比较分析.番茄环纹斑点病毒(Tomato zonate spot virus,TZSV)侵染的番茄,叶部细胞中病毒粒体呈块状聚集于内质网池中,果实细胞中呈块状、管状或单个粒体散布于细胞质中,细胞核较完整,叶绿体空泡化;凤仙花坏死斑病毒(Impatiens necrotic spot virus,INSV)侵染的蝴蝶兰叶部细胞和亚细胞结构消失,病毒粒体分布较少,聚集于细胞质中的内质网池内;花生黄斑病毒(Groundnut yellow spot virus,GYSV)侵染的辣椒果实的亚细胞结构较完整,病毒粒体呈块状聚集于细胞质的囊腔内.研究结果表明,不同种类的Tospovirus病毒侵染寄主植物后,其病毒粒体在寄主细胞内的分布、聚集方式及对亚细胞结构的影响具有明显差异,可作为诊断的依据.     

黄花菜八氢番茄红素脱氢酶基因HcPDS的克隆及VIGS转化表达验证

为了拓宽对黄花菜基因功能研究的技术体系,本研究以黄花菜‘大同黄花’为试验材料,基于转录组数据库检索和PCR技术克隆得到了黄花菜HcPDS基因完整编码序列,序列全长1710 bp,编码570个氨基酸。该基因编码的蛋白质具有PDS基因家族典型的Phytoene desat结构域,分子量为63.719 72 kD,等电点为7.53,是亲水不稳定性蛋白。通过序列比对,发现HcPDS基因与水仙、芦笋等植物中的PDS基因具有较高的同源性。通过构建黄花菜病毒诱导的基因沉默(VIGS)体系,黄花菜幼苗被侵染后,接种pTRV2-HcPDS的植株新叶出现不完全的光漂白现象,叶片中的HcPDS基因表达量相比接种TRV2空载的阴性对照和空白对照植株分别下降了73.33%和71.72%。空白对照和阴性对照植株叶片则无光漂白现象出现,且空白对照和阴性对照的HcPDS基因表达量相比无显著差异。所构建的黄花菜VIGS体系可有效沉默HcPDS基因,为黄花菜功能基因的鉴定与分析奠定了技术基础。