茶树牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因CsGGDPS的克隆及表达分析

以铁观音芽叶为材料,验证从茶树转录组数据库中筛选到的1条牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(GGDPS)的编码全长序列c DNA。该c DNA全长1 661 bp,含有1个1 137 bp完整的开放阅读框,命名为Cs GGDPS。该基因编码378个氨基酸,氨基酸序列具有类异戊二烯合成酶家族的5个保守域和2个特征功能域;序列分析显示,该c DNA与其他植物GGDPS高度保守,与三七(Panax notoginseng)的亲缘关系最近。Cs GGDPS属于不稳定、亲水蛋白,可能定位到叶绿体中,不存在跨膜结构,无信号肽,发生磷酸化的位点可能有20个;二级结构主要由α-螺旋构成,三级结构与拟南芥GGPPS11匹配度最高。实时荧光定量PCR结果表明,在茶树发育过程和不同叶位Cs GGDPS的表达量随芽叶成熟度的增加呈上升趋势,随着做青过程的进行,Cs GGDPS的表达量逐渐升高;Cs GGDPS在父本黄旦、母本铁观音和子一代金观音中均有表达,但表达量存在差异。     

小麦牻牛儿牻牛儿基脱氢酶基因的克隆及电子定位与表达分析

为更好地了解小麦维生素E的生物合成并将其应用于营养品质改良,以电子和实验克隆相结合的方法克隆分离了小麦牻牛儿牻牛儿基脱氢酶（GGH）基因的cDNA序列,序列号为DQ139268。序列分析结果表明,该cDNA序列含有一个完整的开放读码框,编码462个氨基酸,含有保守的ChlP结构域,氮端有信号肽序列,定位于叶绿体中。氨基酸序列比对和系统发育分析结果显示,不同物种之间GGH基因编码的氨基酸序列同源性都较高。用生物信息学工具将该基因定位于小麦第六部分同源群的长臂上。RTPCR和电子组织表达分析结果显示该基因在光合器官中表达量丰富,这可能与其亚细胞定位有关。     

艾纳香脱氢酶基因家族的生物信息学分析

采用RT-PCR和RACE（Rapid amplification of cDNA ends）技术,从艾纳香（Blumea balsamifera (L.) DC.）叶片中克隆到4条编码艾纳香脱氢酶（BbADH1、BbADH2、BbADH3、BbADH4）基因的cDNA序列,并对4条核苷酸及其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析。结果显示:4条艾纳香脱氢酶序列开放阅读框均在900 bp左右,蛋白质等电点（pI）值在5.0~9.0之间,含量最多的氨基酸为亮氨酸（Leu）,最少的为色氨酸（Try）,具有明显的疏水区和亲水区,N端未发现信号肽,且无跨膜区;同源性比对结果显示,艾纳香BbADH蛋白与其他植物中ADH蛋白具有高度的相似性,且具有脱氢酶的特征功能域;系统发育分析表明,艾纳香（B. balsamifera (L.) DC.）BbADH1和BbADH3同处于一个分支,且与胡杨（Populus euphratica Oliv.）PeADH物种亲缘关系较近,而艾纳香BbADH4和BbADH2处于不同分支,且分别与葡萄（Vitis vinifera）VvADH和烟草（Nicotiana tabacum）NtADH物种亲缘关系较近。     

茶树GGPS基因家族的克隆、生物信息学和表达分析

牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶(Geranylgeranyl diphosphate synthase,GGPS)是萜类合成途径的结构酶,对植物生长发育具有重要意义。本研究通过RACE和RT-PCR方法克隆得到5条潜在的茶树GGPS序列,分别命名为CsGGPS1-4和CsGGPS9,其中CsGGPS9存在3条等位基因,分别是CsGGPS9-1、CsGGPS9-2和CsGGPS9-3,在系统进化树上与其他基因分成两支。蛋白质序列分析表明,茶树GGPS家族成员都具有polyprenyl_synt结构域,不存在信号肽序列。亚细胞定位预测结果显示,CsGGPS1、CsGGPS2和CsGGPS4定位在叶绿体上,CsGGPS3和CsGGPS9定位在线粒体上。通过Swiss Model进行三维建模,结合"three-floor"模型对茶树GGPS家族成员的功能进行预测,预测结果显示,CsGGPS1、CsGGPS2和CsGGPS4是GGPS;CsGGPS3是异源二聚体形式的牻牛儿基焦磷酸合酶的小亚基;CsGGPS9的催化主产物是碳链数大于30的异戊烯基焦磷酸。q RT-PCR分析表明,CsGGPS1整体表达丰度较低,仅在一芽二叶中表达量稍高;CsGGPS2在茶树各个组织中均有表达,在花中表达量最高,且花发育过程中表达量先上升后下降;CsGGPS3在叶和幼根中的表达量高于花,花发育过程中表达平稳;CsGGPS4在茶树各个组织中表达量数值相近,在花发育过程中表达量变化趋势与CsGGPS2相同;CsGGPS9的表达量在成熟叶中显著低于幼嫩叶片。     

小麦(牛龙)牛儿(牛龙)牛儿基脱氢酶基因的克隆及电子定位与表达分析

为更好地了解小麦维生素E的生物合成并将其应用于营养品质改良,以电子和实验克隆相结合的方法克隆分离了小麦(牛龙)牛儿(牛龙)牛儿基脱氢酶(GGH)基因的cDNA序列,序列号为DQ139268.序列分析结果表明,该cDNA序列舍有一个完整的开放读码框,编码462个氨基酸,含有保守的ChlP结构域,氮端有信号肽序列,定位于叶绿体中.氨基酸序列比对和系统发育分析结果显示,不同物种之间GGH基因编码的氨基酸序列同源性都较高.用生物信息学工具将该基因定位于小麦第六部分同源群的长臂上.RT-PCR和电子组织表达分析结果显示该基因在光合器官中表达量丰富,这可能与其亚细胞定位有关.     

甜菜蔗糖磷酸合成酶基因的克隆及序列分析

甜菜蔗糖磷酸合成酶(Beta vulgaris sucrose phosphate synthase,BvSPS)是甜菜体内控制蔗糖合成的关键酶之一。根据Genbank上的BvSPS序列(Genbank accession no.X X81975),利用RT-PCR方法,从甜菜体内扩增获得了BvSPS基因的cDNA全长,并将其连接到pMD 18-T载体上。通过利用PstI、XbaI和EcoRI对重组质粒pMD 18-T-BvSPS进行酶切鉴定,进一步确定了重组质粒的正确性。利用生物信息学软件分析结果表明,该基因cDNA全长为3138bp,编码1045个氨基酸,蛋白质分子量为118.18kDa,等电点为6.15,该蛋白被预测定位于细胞核内。     

茶氨酸合成酶基因的全长cDNA克隆及序列分析

采用SMART RACE技术成功克隆了安吉白茶茶氨酸合成酶基因（TS）的全长cDNA序列,并将其登录Genbank,登录号为JN226569。TS基因的cDNA全长为1503bp,开放阅读框（ORF）为1071bp,编码356个氨基酸。经生物信息学分析,TS蛋白的氨基酸残基数为356,分子量为39250.3Da,理论等电点（PI）为5.79,其氨基酸序列中可能不存在卷曲螺旋结构。TS蛋白不存在信号肽序列,不发生跨膜运动,属于亲水性的非分泌蛋白,其磷酸化位点有26个。通过亚细胞定位预测,安吉白茶TS蛋白是一种细胞质蛋白。克隆茶氨酸合成酶基因的全长cDNA序列,对于利用生物技术手段改良茶树品种,以调控茶树中茶氨酸的含量具有重要意义。     

艾草(Artemisiaargyi)单萜合成酶基因的克隆及序列分析

利用RACE技术从艾草(Artemisia argyi)的成熟叶片中克隆了萜类化合物生物合成的单萜合成酶(TPS)的基因,并对其进行序列特征分析和系统进化关系预测。结果表明,该基因c DNA全长为1.7 kb,开放阅读框可编码538个氨基酸残基,并包含与其功能高度相关的DDxx D保守区和RR(degenerated RRx8W)保守区。预测的Aa TPS二级结构具有28个转角,30个α螺旋,8个β折叠。预测的三维结构符合单萜合酶的立体构象。系统发育分析表明,Aa TPS基因与其他双子叶植物中的单萜合酶基因聚为一类,与菊科植物的单萜合酶基因相似性较高。     

巴西橡胶树法尼基焦磷酸合酶基因5＇调控序列的克隆及功能初步鉴定

法尼基焦磷酸合酶是异戊二烯生物合成途径中的一个关键酶,根据NCBI数据库中巴西橡胶树法尼基焦磷酸合酶基因HbFPS序列设计引物,克隆了HbFPS起始密码子上游1066 bp的5＇调控序列。序列分析表明,该序列A/T含量为77.39 %,含有典型的真核生物核心启动子区域,在该序列中发现了一些与真核生物典型的顺式调控元件相似的TATA-box、增强子元件、CAAT-box和GATA-box以及一些与激素、胁迫诱导、转录因子相关的顺式作用元件。构建了含有该序列的植物表达载体并转化烟草,对获得的转基因烟草T0代植     

陆地棉焦磷酸酶基因GhVP的启动子序列分析

为了筛选棉花耐盐转基因育种所需的诱导型候选启动子，本研究根据陆地棉焦磷酸酶基因GhVP的cDNA序列和陆地棉基因组序列，获得陆地棉焦磷酸酶基因GhVP启动子序列，并对其进行生物信息学分析。结果表明，该启动子具有多个基本元件TATA-box和CAAT-box，并含有多种逆境胁迫诱导相关的响应元件，含有丰富的光响应元件以及其他多种顺式作用元件。推测GhVP基因的转录同时受光、高温、干旱、创伤、脱落酸诱导，受生物钟控制的顺式元件调控，参与棉花的生长发育。     

艾纳香总黄酮提取工艺研究

在考察提取溶剂、提取方法对总黄酮提取率的影响的基础上,运用正交试验对艾纳香中总黄酮的提取条件进行优化,确定最佳提取工艺.结果表明,艾纳香总黄酮最佳提取工艺为:30％的乙醇以1∶300料液比投料,以85 Hz的频率超声提取2次,每次30 min.在该最佳提取工艺下,艾纳香总黄酮提取量为208.6 mg/g.     

枇杷鲨烯合酶(Squalene synthase)基因的克隆及序列分析

鲨烯合酶(SQS)是枇杷三萜酸生物合成过程中的关键酶。以枇杷(Eriobotrya japonica L.)悬浮培养细胞为材料,采用RT-PCR和RACE方法分离得到枇杷鲨烯合酶Ej-SQS(Squalene synthase)基因的cDNA全长序列(GenBank,JQ294055),共1 775 bp,包含了5′非编码区为97 bp,开放阅读框为1 239 bp,3′非编码区为439 bp。该cDNA的开放阅读框推定的氨基酸序列(含412个氨基酸)与其它植物SQS具有79%~94%同源性,包含Trans_IPPS_HH保守结构域,可能属于Isoprenoid Biosynthesis enzymes,Class 1家族。为今后利用基因工程调控枇杷细胞悬浮培养物以提取目标产物奠定基础。     

艾纳香乙酸乙酯部位抗菌活性成分研究

本研究采用硅胶柱层析、ODS反相柱层析、sephadex LH-20分子筛等技术进行分离纯化艾纳香乙酸乙酯部位,共获得7个化合物。采用波谱学技术进行结构鉴定,7个化合物分别为：3,3’,5,7-四羟基-4’-甲氧基-二氢黄酮（1）,7-甲氧基紫衫叶素(padmatin)（2）,木犀草素-7-甲醚（3）,咖啡酸（4）,北美圣草素（5）,槲皮素（6）和木犀草素（7）。采用96孔板倍比稀释法,对单体化合物抗细菌活性进行评价,结果显示化合物2和3具有较好的抑制金黄色葡萄球菌活性,MIC值均为64 μg/mL。化合物2和4均为首次从该植物中分离,化合物2 和3可作为艾纳香抗菌活性先导化合物,为相关新药研发提供依据。     

巴西橡胶树一个新的法尼基焦磷酸合酶基因的克隆及表达分析

利用同源克隆的方法在橡胶树中获得一个新的法尼基焦磷酸合酶基因,命名为Hb FPS2。序列分析显示,Hb FPS2基因组序列长4 171 bp,由12个外显子和11个内含子组成,c DNA全长1 288 bp,包含1 029 bp的开放阅读框、105 bp的5′-UTR和154 bp的3′-UTR,编码342个氨基酸,推测分子量为39.6 ku,等电点为5.27。氨基酸序列比对显示,Hb FPS2具有FPS家族保守的5个结构域。进化分析结果表明,Hb FPS2和Hb FPS1亲缘关系最近,与大戟科的蓖麻、大戟、麻风树法尼基焦磷酸合酶聚为一个亚类。定量PCR结果表明,Hb FPS2在橡胶树根、树皮、叶、花和胶乳等组织中均有表达,在花和胶乳中表达量较高,在根中表达量最低;茉莉酸和乙烯处理均能提高Hb FPS2基因的表达量,处理9 h时基因表达量分别提高了36倍和8倍。结果为分析法尼基焦磷酸合酶基因表达特性及其在天然橡胶生物合成途径中的作用机制奠定基础。     

可可蔗糖磷酸合成酶基因家族进化及组织表达分析

在高等植物中,蔗糖磷酸合成酶（Sucrose phosphate synthase,SPS）是蔗糖合成的限速酶。在多种植物中都发现了SPS基因,而可可中尚未见相关报道。通过分析可可基因组数据库,鉴定出4个SPS候选基因,依次命名为TcSPS1、TcSPS2、TcSPS3和TcSPS4。4个基因的编码区（CDS）长度在3 075~3 228 bp之间,外显子数目为12~14,预测蛋白的平均分子量为118.15 ku,等电点均小于7。进化分析结果表明SPS基因家族分成3个亚族;TcSPS1和TcSPS2属于ClassⅠ亚族,TcSPS3和TcSPS4分别属于ClassⅡ亚族和ClassⅢ亚族。实时荧光定量PCR分析结果表明,TcSPS1与TcSPS2在树皮和果实中高量表达,TcSPS3和TcSPS4主要在叶片中表达。伴随着叶片和花蕾生长发育,各TcSPS基因表达量均呈现出上升的趋势,表明其与主要光合产物--蔗糖的合成或再合成有密切联系,参与可可“源库”器官中光合产物分配。     

蝴蝶兰蔗糖合成酶基因的cDNA克隆及其表达分析

利用低夜温诱导的蝴蝶兰花芽的抑制消减杂交文库中分离的蔗糖合成酶基因的ESTs片段,采用RT-PCR和RACE技术,从蝴蝶兰花芽中克隆得到蔗糖合成酶基因的全长cDNA,命名为PhSUS,GenBank登录号JX162557.该基因全长2 816 bp,包含147 bp的5’非编码区、218 bp的3 '非编码区和一个长度为2 451 bp编码816个氨基酸的开放阅读框.PhSUS预测的分子量为93.30 ku,等电点为5.95.蛋白同源性分析结果表明,PhSUS与兰科植物的文心兰、石斛兰和莫氏兰(Mokara)等的蔗糖合成酶有很高同源性.保守结构域分析结果表明,PhSUS含有蔗糖合成酶和葡糖基转移酶两个保守功能域及4个ADP结合位点.表达分析结果表明,PhSUS在检测的组织中都有表达,但表达丰度不同.PhSUS在花蕾发育中后期、成熟花和花器官的表达量都较营养阶段根和叶中的表达量高.PhSUS的克隆为研究其参与花芽分化和发育的表达调控奠定了重要基础.     

一个新的马铃薯GBSS基因5'侧翼序列克隆及调控活性研究

采用PCR技术,从马铃薯叶片基因组DNA中扩增到了约0.6kb的马铃薯GBSS基因的5'侧翼序列,经序列同源性分析所克隆的序列与已知序列同源性为97.41%,含有启动基因表达所需的主要调控元件CAAT盒和TATA盒。构建该序列与GFP的融合基因植物表达载体pBIGGFP,并用基因枪转化法将pBIGGFP导入马铃薯无菌苗茎段、叶片和微型薯薯片,用荧光显微镜观察转化组织中GFP的瞬时表达,结果表明GFP在上述器官中都得到了表达,说明所克隆的约0.6kbGBSS基因的5'侧翼序列是具有启动基因表达的功能。     

巴西橡胶树蔗糖磷酸合成酶基因的克隆和表达分析

分析橡胶树EST数据库,得到一个注释为SPS(蔗糖磷酸合成酶)的EST序列重叠群(contig).通过PCR扩增和测序技术获得该基因的全长cDNA和基因组序列,命名为HbSPS1.序列分析显示,HbSPS1基因长度为5 298 bp,包含13个外显子和12个内含子.对应的cDNA编码序列(CDS)为3 156 bp,推测编码1 050个氨基酸,分子量大小为118.1 ku,等电点为6.05.采用荧光定量PCR技术分析该基因的表达模式,结果表明,HbSPS1基因主要在胶乳中表达,在乙烯利和机械伤害处理的胶乳中呈下调表达,在割胶影响下略有上调表达趋势,同时该基因在叶片发育过程中呈上调表达.说明HbSPS1基因可能参与胶乳蔗糖代谢和叶片发育调控.