“Gros Michel”香蕉胚性细胞悬浮系及遗传转化体系的建立

本研究以"Gros Michel"香蕉未成熟雄花序为外植体,建立了其胚性细胞悬浮系及遗传转化体系。结果表明,90 d后可诱导产生浅黄色松散的胚性愈伤组织,经悬浮培养120 d后获得含有均质细胞团的胚性细胞悬浮系(ECS);将3个月龄的ECS置于胚诱导培养基30 d后有大量白色半透明状球形的体细胞胚发生,继代培养60 d后发育为成熟不透明的体细胞胚;将成熟的体胚在萌发培养基上培养10 d后有幼芽产生,转移至生根培养基30 d后得到幼苗。同时开展了含绿色荧光蛋白(GFP)的pCAMBIA0380载体的遗传转化研究,经过3次液体培养基筛选转移至半固体筛选培养基90 d后,在胚萌发培养基和生根培养基中不再添加抗生素。经对转化植株的根尖镜检及PCR鉴定,均为阳性植株。研究结果将为进一步开展"Gros Michel"优质抗病基因功能研究提供材料和技术支撑。     

根癌农杆菌介导的巴西橡胶树胚性悬浮细胞的遗传转化

为了建立橡胶树胚性悬浮细胞遗传转化体系,用根癌农杆菌EHA105（携带pCAMBIA1301,含有gusA和hpt Ⅱ）侵染胚性悬浮细胞团,用GUS检测的方法分析了共培养时间和菌液浓度对转化效率的影响;同时,测定了胚性细胞团对潮霉素敏感性。结果表明适宜的共培养时间为3天,适宜的菌液浓度为OD600=0.4~0.6。潮霉素的致死剂量为15 mg/L。使用大约1 g鲜重的胚性细胞团,经过转化和选择培养,获得53块抗性愈伤组织,经诱导获得7个体细胞胚。GUS检测和PCR鉴定证实了gusA基因已经整合到橡胶树基因组中。本研究为根癌农杆菌介导的橡胶树胚性悬浮细胞遗传转化体系建立奠定了基础。     

豆瓣绿胚性愈伤悬浮培养条件优化及体细胞胚发生

本研究以豆瓣绿无菌苗叶片为外植体诱导获得质地疏松、稳定性高的颗粒状胚性愈伤组织,开展胚性细胞悬浮培养研究。结果表明:豆瓣绿胚性愈伤组织最适继代培养基为MS+0.6%琼脂+3%蔗糖+2,4 D1.0 mg/L+6-BA 1.0 mg/L,继代间隔14 d;体细胞悬浮最佳培养基为MS+3%蔗糖+NAA 0.5 mg/L+6-BA 1.0 mg/L,继代间隔7 d;体细胞悬浮最佳碳源为蔗糖,蔗糖最佳浓度为30 g/L;体细胞悬浮摇床最佳转速为110 r/min。本研究考察激素种类、激素浓度、碳源种类、糖浓度、摇床转速对体细胞胚悬浮体系的影响,并采用解剖镜进行形态学观察,为后期研究体细胞胚胎形态结构提供基础数据。     

几丁质酶基因克隆及其野生蕉转化

本研究根据GenBank公布的木霉几丁质酶基因(chitinase)序列设计一对引物,采用RT-PCR方法从木霉(Trichoderma spp.)中克隆获得了几丁质酶基因全序列,编码区共1275bp,推测其编码424个氨基酸,该基因与哈茨木霉(Trichoderma harzianum)的内切几丁质酶基因chit42(GenBank accession No.L14614)具有99%的同源性。在此基础上,将获得的几丁质酶基因从pGEM-T载体中用XbaⅠ和BamHⅠ切下,克隆到pBI121植物表达载体的XbaⅠ和BamHⅠ位点,构建了植物表达载体pBI-chit并将其转入根癌农杆菌菌株EHA105。该菌株转化野生蕉(Musa itinerans Cheesm.)胚性细胞悬浮系,经过抗性筛选、胚的诱导和萌发,获得成熟体细胞胚和再生苗。通过GUS组织化学法检测和PCR方法鉴定,结果表明外源基因已经成功转入到野生蕉中。本研究为下一阶段转化香蕉栽培品种和筛选抗香蕉枯萎病新种质奠定一定的基础。     

辐射诱变甘薯悬浮细胞筛选耐盐植株

我国盐碱地面积大,影响粮食作物生产。甘薯是适应性广、抗逆性强的粮饲作物,选育耐盐甘薯品种对改良土壤盐碱化有重要意义,本研究旨在通过60COγ辐射甘薯悬浮细胞,筛选甘薯耐盐新材料,加快甘薯耐盐育种进程。本研究以甘薯品种西成007为实验材料,剥离茎尖诱导胚性愈伤组织,将胚性愈伤组织进行液体振荡培养得到悬浮细胞培养系,利用60COγ射线80 Gy、1.09 Gy/min辐照处理悬浮细胞,经过Na Cl抗性筛选培养,悬浮细胞分化得到175株再生植株,通过对再生植株的脯氨酸含量、SOD酶活性测定,得到了二者较对照都有显著提高的3株耐盐突变株。其中1株叶色变浅,叶形由心形变为长条形。突变株和对照株的Na Cl水培实验表明,突变株较对照生根能力更强,生长更加旺盛。本研究得到的耐盐突变株系将为甘薯耐盐新材料的选育提供新的种质,同时为盐碱地的利用提供帮助。     

不同浓度秋水仙素对贡蕉的多倍体诱导

本试验以贡蕉胚性细胞悬浮系、胚性愈伤组织和多芽体为试验材料,利用不同浓度的秋水仙素溶液对不同外植体材料进行不同时间的诱变处理,以期获得染色体加倍的植株。结果表明,试验所用的胚性悬浮细胞系、胚性愈伤组织和多芽体三种不同外植体对秋水仙素处理的敏感性都较高,出现了不同程度的死亡,以0.4%(w/v)浓度的秋水仙素溶液处理多芽体48h诱导效果较好,多芽体的死亡率达到45.83%,接近半致死率,诱变率为18.64%。通过染色体计数和气孔鉴定,获得62株纯合四倍体小苗。诱变获得的植株的染色体数目加倍,叶片气孔数量减少,体积增大。本次试验为香蕉多倍体诱变育种和新种质的创新提供了技术参考和相关依据。     

连香树胚性细胞悬浮系的建立和植株再生

本试验以连香树授粉120 d后未成熟种子子叶胚为外植体,开展胚性愈伤诱导增殖和悬浮培养体系的研究,初步建立了连香树胚性细胞悬浮系与植株再生体系。将连香树未成熟子叶胚接种在添加0.5 mg/L6-BA+1.0 mg/L NAA+1.0 g/L AC的1/2 MS基本培养基上,进行胚性愈伤组织诱导,获得的愈伤组织在0.1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+0.5 g/L AC的1/2 MS固体培养基上进一步增殖培养。将得到的胚性愈伤组织置于添加5%聚乙二醇6000的1/2 MS的悬浮培养液中进行振荡培养,建立起细胞均一、增殖较快、稳定性较强的细胞悬浮系;将悬浮培养获得的胚性材料接种到添加5%香蕉汁的0.1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+0.5 g/L AC的MS固体培养基中进行培养,可分化出的子叶期体胚,将获得的子叶胚转接到添加1.0 mg/L IBA的WPM固体培养基中,体胚萌发再生成植株。     

剑麻悬浮细胞体系的建立

为了获取良好的剑麻悬浮细胞体系,以剑麻无菌幼苗嫩叶为诱导材料,对剑麻胚性愈伤组织的获得,建立细胞悬浮系和影响悬浮细胞增殖的主要影响因子进行了探讨。结果表明:幼叶在培养基为MS+2.0 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA上诱导的愈伤组织,经1～2次继代培养后获得了颗粒状、浅黄色的胚性愈伤组织;接种于液体培养基接种量为2 g (鲜重),继代周期为7 d,经4～5次继代震荡培养建立了细胞悬浮系,细胞生长符合"S"型曲线,细胞浓度可达6.1×105～4.6×106个/m L以上;在悬浮细胞生长前期,pH值明显下降,在细胞对数生长期,pH值略有升高,并趋于平缓;最适宜的细胞悬浮培养基为(MS+1.5 mg/L 2,4-D+4.0 mg/L6-BA+350 mg/L水解酪蛋白, 30 g/L蔗糖, pH值为5.8)。通过建立剑麻悬浮细胞培养体系的方法,为进一步应用于剑麻悬浮细胞转化体系和多倍体育种等研究。     

棉花高效体细胞胚发生及同步控制培养体系研究

棉花体细胞胚胎发生的频率低, 且体细胞胚的发育存在着不同步性, 给体细胞胚胎发生发育过程的生理学、生物化学和分子生物学的研究带来许多困难。本研究以陆地棉品种Coker201为材料, 建立了一种简单有效的棉花体细胞胚高频率发生和同步发育的培养体系。经过多次继代获得的胚性愈伤, 首先在液体培养基中振荡培养2 d使其分散, 然后过30目筛去除大的颗粒, 重新悬浮于同样的液体培养基中。悬浮培养14 d后, 过50目筛, 将筛上的胚性愈伤重悬浮于新鲜的培养基中, 并用吸管吸取悬浮液, 将其均匀地接种在表面垫有滤纸的同成分固体培养基(附加2.46 mmol L^-1 IBA和0.70 mmol L^-1 kinetin)上。培养21 d后, 用垫有滤纸的相同的固体培养基继代培养。利用这种培养体系, 获得的体细胞胚数量分别是单纯悬浮培养和固体培养(不垫滤纸)的16.5倍和4.0倍。其中, 球形胚、鱼雷形胚和子叶胚的同步发生率分别为70.2%、52.3%和73.0%。     

野生阿宽蕉胚性细胞悬浮系原生质体分离及植株再生

本研究以野生阿宽蕉(Musa itinerans Cheesman)未成熟种子诱导的胚性细胞悬浮系为材料,对其原生质体的分离和植株再生进行研究。结果表明:胚性悬浮细胞在酶组合:3.0%纤维素酶R-10、1.0%离析酶R-10、0.2%果胶酶Y-23、1.52%KCl、0.78%CaCl2、0.01%MES和11%甘露醇中,酶解8h,原生质体的产量和活力达到最大值,分别为19.46×106个/mL和92.17%。采用看护培养法对原生质体培养60d后,可获得大量增生的小细胞团,细胞团悬浮培养15d后转至体胚诱导培养基上培养约30d,其体胚萌发率为45.97%,然后转至生根培养基上培养35d,其再生植株率为54.76%。     

西瓜‘SM1’高效遗传转化体系的构建

为构建高效的西瓜再生和遗传转化体系,本研究以西瓜‘SM1’材料子叶节为外植体,研究不同激素配比对子叶节再生的影响。在此基础上,通过农杆菌介导法导入外源基因,研究潮霉素浓度、农杆菌侵染时间、共培养时间等因素对遗传转化效率的影响,建立遗传转化体系。结果表明,‘SM1’不定芽分化最佳培养基为MS+6-BA 1.0 mg/L+IAA 0.1 mg/L,不定芽分化率为91.7%。最优遗传转化组合为农杆菌侵染时间15 min,共培养3 d,之后进行选择培养。外植体不定芽分化潮霉素最适浓度为10 mg/L,最适生根培养基为1/2MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.01 mg/L。通过潮霉素筛选和PCR鉴定,获得12株阳性转化株系,转化率为6.5%。本研究建立了高效西瓜‘SM1’再生及遗传转化体系,为进一步开展基因功能研究及西瓜遗传改良提供了技术支撑。     

菊花‘金不凋’再生及遗传转化体系的构建

‘金不凋’属于典型的日中性菊花,可作为日中性菊花开花分子机理的理想研究材料,目前尚未建立‘金不凋’的再生及遗传转化体系。本研究以‘金不凋’叶片为外植体,分别对影响再生及转化体系的主要因素进行试验。结果表明‘:金不凋’叶盘愈伤组织的不定芽分化最佳培养基为MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L,不定芽分化率为90.0%,平均再生不定芽数达5.5556个;相关性分析表明褐化率与愈伤诱导率以及平均再生愈伤组织数之间存在显著的负相关关系;试管苗最佳生根培养基为MS,生根率为100%。在‘金不凋’再生体系建立的基础上,初步建立了其遗传转化体系:‘金不凋’叶盘经过24 h预培养,在菌液浓度OD600=0.6的农杆菌中侵染10 min,共培养2 d,延迟培养5 d,叶片不定芽分化潮霉素临界浓度为2 mg/L,生根筛选潮霉素临界浓度为5 mg/L时,转化效率最高。通过潮霉素抗性筛选和PCR鉴定,获得3株PCR阳性菊花苗,转基因阳性苗频率为2.5%,本研究为‘金不凋’的基因工程育种提供了技术基础。     

利用SSH技术鉴定香蕉体细胞胚发生相关基因

本研究以野生蕉胚性悬浮系为材料,将胚性细胞增殖培养基上的香焦胚性悬浮系作为对照,体胚诱导培养基上的培养材料为处理,利用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术,构建野生蕉胚性悬浮系激素诱导的胚胎发育差异表达cDNA文库,随机挑选阳性克隆并进行生物信息学分析...     

NAA或潮霉素对小麦成熟胚愈伤组织分化的影响

以5个栽培小麦品种诱导而来的成熟胚愈伤组织为外植体,研究了在分化培养基中加入NAA对小麦成熟胚愈伤组织分化的效果以及潮霉素浓度对不同阶段成熟胚愈伤组织分化的影响。研究结果表明,在对照的分化培养基中(含5mg/L激动素)加入0.1mg/L萘乙酸(NAA,1-naphthlcetic acid)形成的分化培养基,可显著提高4个供试小麦基因型的成熟胚愈伤组织的分化率,提高幅度达到12%～32%。不同的潮霉素浓度在"花培1号"愈伤组织的诱导阶段进行抗性筛选的结果表明,即使是在潮霉素浓度达到250mg/L时,仍有24%左右的愈伤组织存活率,这些存活的愈伤组织仍可能分化形成绿点甚至分化成苗,说明在"花培1号"愈伤组织的诱导阶段进行潮霉素抗性筛选是不适合的。5个不同小麦品种分化阶段进行潮霉素筛选具有明显的效果,但不同品种之间存在一定差异,其中:宁麦13的适宜潮霉素浓度为20mg/L,花培1号和扬麦158的适宜潮霉素浓度约为30mg/L,宁麦9和宁麦16的适宜潮霉素浓度在30～40mg/L左右。因此,我们认为,在分化阶段进行潮霉素抗性筛选是理想的筛选时期,在分化培养基中添加20～40mg/L浓度的潮霉素即可完全抑制小麦成熟胚愈伤组织的分化。本研究结果将有助于改进和完善普通小麦成熟胚遗传转化体系。     

香蕉遗传转化方法研究进展

香蕉是热带亚热带发展中国家重要的粮食作物和碳水化合物来源。但近年来,香蕉生产受到严重的病虫危害。大多数香蕉栽培品种是三倍体,生长周期长,而且不孕。由于没有种子,给繁殖和育种带来一定的困难。遗传转化技术的发展为香蕉品种的改良提供了一种有效的手段。香蕉的遗传转化方法有电激法、基因枪法、农杆菌介导法等。农杆菌介导法的应用是香蕉品种改良的一个重大突破。香蕉遗传转化的外植体也发展到多种,有原生质体,胚性细胞悬浮系,分生组织,以及横切薄片等。近几年,随着分子生物学的发展,出现了转化效率更高,重复性更好的香蕉遗传转化技术。如农杆菌和基因枪结合法,离心辅助农杆菌介导法、真空渗透技术等。这些新技术新方法的出现,必将推动香蕉产业高速发展。     

叶用莴苣无缝克隆构建LsE3基因过表达载体和新RNAi载体及遗传转化体系优化

研究旨在应用新技术和新载体构建过表达和沉默载体,优化遗传转化体系,验证生菜LsE3基因功能,探究高温抽薹机制。以pCAMBIA1304和pFGC5941载体为材料,通过无缝克隆构建叶用莴苣转基因载体,并通过筛选培养基配方优化遗传转化体系。试验成功地以pCAMBIA1304为基础,插入源自pFGC5941的dsRNA表达框序列,获得了新RNAi空载pCAMBIA1304- FGC5941,构建了LsE3沉默载体,并成功以双元质粒载体pCAMBIA1304构建了LsE3过表达载体。试验对易抽薹叶用莴苣品种‘GB-31’进行潮霉素浓度、直接芽诱导培养基配方和生根培养基配方的筛选,确立了潮霉素适宜筛选浓度为5 mg/L,并确立了最优培养芽诱导和生根培养基配方。试验成功获得新RNAi空载并构建了转基因载体,优化了遗传转化体系,为解决载体构建繁琐复杂的问题提供新思路,并奠定了生菜转基因技术的基础。     

柚木cry1A(b)基因的遗传转化

1INTRODUCTIONTeakhasworldwidereputationasthemostdurabletimber .Teakisasun loving ,deciduoustree ,whichthrives,inanywell drainedsoil.Ithasagestation periodofbetween 15and 2 5 yearsde pendingontheregionwhereitisgrown .Owingtodwindlingnaturalteakforests ,teakhasbeenafavouritechoiceforagroforestry .However ,duetoitslonggestationperiod ,teakisnotaspopularasrubberoroilpalm .Neverthelessteakplantingisbe comingpopularinPeninsularMalaysiaandSabah .Witharapidgrowthratetogetherwithitssuperiortimbe…     

根癌农杆菌介导的花魔芋遗传转化体系的研究

本研究以潮霉素抗性基因为选择标记,建立了根癌农杆菌介导的花魔芋(Amorphophalluskonjac)的遗传转化体系。同时探讨了魔芋愈伤组织的培养基、筛选剂和筛选时间等因素对转化效率的影响。通过筛选时间不同的两个转化试验,分别从300个花魔芋愈伤组织中得到了16个和18个具有潮霉素抗性的愈伤组织,其抗性愈伤率为5.33%和6.00%。获得的抗性愈伤组织进一步在分化培养基上进行分化,其分化效率分别为31.2%和22.2%。移栽后,分别得到了39株和36株成活植株。PCR检测表明分别有26株和21株再生花魔芋出现了800bp的特异性扩增带型,其阳性率分别为66.7%和58.3%。随机挑取20个PCR阳性植株的DNA进行斑点杂交检测,结果表明外源基因已经整合到花魔芋的基因组中。     

香蕉ACC合成酶反义基因转化香蕉的研究

香蕉是重要的热带、亚热带地区作物,典型的呼吸跃变型果实,不耐贮藏.传统的保鲜方法存在诸多弊端,利用现代生物技术培育耐贮藏新品种,已经成为我们解决香蕉保鲜问题的重要课题.本研究利用果实特异性ACC合成酶基因反义植物表达载体,采用基因枪和农杆菌介导法转化海南主栽的巴西香蕉及红香蕉,并比较了不同转化方法及不同栽培品种的转化效果.结果表明农杆菌侵染法好于基因枪法,在农杆菌侵染方法中,对红香蕉的转化效果好于巴西香蕉.经PCR检测获得了9株转化植株,进一步采用Southern blot分析的方法,其中4株杂交信号较强,确认ACC合成酶反义基因已经整合进香蕉基因组中.本研究为香蕉的转基因研究和耐储藏新品种的培育奠定了一定的基础.     

利用共转化方法创制携带Pi9抗稻瘟病基因的无选择标记转基因水稻

水稻稻瘟病是由子囊菌(Magnaporthe oryzae)引起的水稻灾害性病害。培育抗病品种是防治稻瘟病最经济有效的措施之一。水稻Pi9抗稻瘟病基因来源于小粒野生稻并已被克隆和应用于转基因育种。为了提高无选择标记转基因植株的选择效率,将绿色荧光蛋白(GFP)用作可视遗传标记,对双菌株共转化系统进行改良:目的基因载体携带Pi9抗稻瘟病基因;标记基因载体用潮霉素磷酸转移酶(HPT)作为植物转化选择标记,用GFP作为负选择标记,筛除标记基因分离植株。两种载体的农杆菌转化株混合,分别与水稻品种‘浙恢414’、‘浙粳22’、‘浙11B’、‘日本晴’、‘空育131’和‘粤泰B’的愈伤组织共培养,然后从5%~38.3%的起始愈伤组织筛选获得了转化愈伤组织(HPT+GFP+)。对T0植株进行Pi9基因PCR检测,11.8%~77.8%的T0植株为共转化植株(HPT+GFP+Pi9+)。对共转化植株T1代进行绿色荧光检测,筛选阴性植株(GFP-),再通过PCR筛选Pi9+植株。根据13个T1群体的研究结果,61%的共转化植株在T1代分离出无选择标记转基因植株(HPT-GFP-Pi9+)。转Pi9的无选择标记植株和后代株系对水稻稻瘟病呈抗病反应。因此,本研究通过GFP标记提高了双菌株共转化系统的选择效率,转Pi9的无选择标记水稻株系为水稻抗稻瘟病育种提供了有用的遗传资源。