致猪水肿病大肠杆菌F18ab菌毛单克隆抗体的研制及其初步应用

将致猪水肿病大肠杆菌 F18ab菌毛提纯 ,以其免疫 BAL B/ c小鼠 ,利用淋巴细胞杂交瘤技术 ,经 3次融合 ,共筛选出 4株能稳定分泌针对 F18ab菌毛的特异单克隆抗体的杂交瘤细胞株 4 G8、4 H11、4 A2和 3A12 ,腹水单抗的直接凝集价最高可达 1∶ 32 0 0。免疫印迹试验表明 ,4株腹水单抗均可特异识别 F18ab菌毛 Mr 15 0 0 0左右的主要亚单位多肽。应用所研制的单抗对 11株猪水肿病大肠杆菌分离株 F18ab菌毛表达情况进行了检测 ,结果显示 ,上述分离株中F18ab菌毛的出现率为 72 .7% (8/ 11) ,检出的 F18ab菌毛阳性分离株的 O血清型均为 O1 39。     

禽病原性大肠杆菌1型菌毛主要亚单位结构基因的克隆、测序与表达

从禽源大肠杆菌037(O78)、166(O78)、120(O18)分离株和猪源大肠杆菌107／86分离株分别提取基因组DNA，并以此为聚合酶链反应(Polymerase chain reaction，PCR)的模板，扩增上述分离株的1型菌毛主要亚单位结构基因pilA，通过其编码的主要菌毛亚单位FimA蛋白氨基酸的序列比较发现：3个禽源株间FimA的同源性为94．3％至99．0％；禽源株和猪源株间FimA的同源性为89．6％至91．1％。通过对重组大肠杆菌的菌体裂解物的SDS-PAGE电泳分析及Western blot分析，禽源大肠杆菌O78 037株、O18 120株出现了一致的强反应，O78 166株反应较弱，而猪源大肠杆菌107／86株反应最弱。这些结果表明：禽源大肠杆菌与猪源大肠杆菌1型菌毛间存在抗原多样性，这种多样性甚至出现在禽病原性大肠杆菌同一血清型的2个不同分离株之间，如O78 037株O78 166株之间，尽管其FimA氨基酸的同源性很高，为99．0％。     

致断奶仔猪腹泻、水肿病大肠杆菌F18菌毛a因子单克隆抗体的研制及其初步应用

以表达 F18ac菌毛参考菌株 2 134(O15 7∶ H19)为研究对象 ,摸索出了 F18ac菌毛表达的最佳条件 ,采用热洗脱法获得了较纯的 F18ac菌毛 ,并以之免疫小鼠 ,利用淋巴细胞杂交瘤技术 ,用直接玻板凝集法筛选出 1株杂交瘤细胞株 19B4 ,能稳定分泌针对 F18ac菌毛和 F18ab菌毛共同抗原表位 a因子的单克隆抗体。细胞培养上清对 F18ac菌毛参考菌株 2 134和 F18ab菌毛参考菌株 10 7/ 86的直接凝集价均可达 1∶ 8,腹水单抗直接凝集效价可达 1∶ 10 2 4 ,而与猪源产 F4、F5、F6和 F4 1粘附素大肠杆菌菌株、鸡源产 型菌毛大肠杆菌菌株及沙门氏菌不发生凝集反应。免疫印迹试验结果显示 ,腹水单抗可同时特异识别 F18ac菌毛 170 0 0和 F18ab菌毛 15 0 0 0左右的主要亚单位多肽。应用所研制的单抗对 2 15株断奶仔猪腹泻大肠杆菌分离株进行了检测 ,结果上述分离株 TSB培养物的 F18菌毛的检出率为13.4 % ,TSA培养物的检出率为 8.4 %。F18菌毛阳性分离株的 O血清型除了常见血清型 O139、O14 1外 ,还有非常见血清型 O10 7、O131和 O9等。TSB培养物的 F18菌毛检出率明显高于 TSA培养物的检出率 ,表明 F18菌毛在 TSB培养基中比在 TSA培养基上更容易表达 ,TSB培养基是适合 F18菌毛检测、流行病学调查的培养基     

禽病原性大肠杆菌I型菌毛单克隆抗体的研制及其对分离株的检测

从禽病原性大肠杆菌分离株ＴＫ３（Ｏ１）提取Ｉ型菌毛免疫ＢＡＩＢ／ｃ小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,获得４株能稳定分泌针对Ｉ型菌毛的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为ａＢ６、ｂＧ５、ｃＦ３和ｃＧ３。单克隆阻断甘露糖敏血凝试验,免疫胶体金和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ试验证明,单抗是Ｉ型菌毛特异的。这些单抗培养上清及腹水的ＥＬＩＳＡ效价为分别为１０＾－２～１０＾－３和１０＾－５～１０＾－６;腹水的平     

禽源和猪源大肠杆菌1型菌毛主要亚单位抗原多样性分子基础的初步研究

从禽源大肠杆菌037(O78)、166(O78)、120(O18)分离株和猪源大肠杆菌107/86分离株分别提取基因组DNA,并以此为聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)的模板,扩增上述分离株的1型菌毛主要亚单位结构基因pilA,得到了大小约570bp的扩增产物,将此扩增产物克隆于T载体,通过内切酶酶切分析得到4个阳性重组质粒;对上述4个大肠杆菌分离株的pilA基因进行序列测定,通过其编码的主要菌毛亚单位FimA蛋白氨基酸的序列比较发现:3个禽源株间FimA的同源性为94.3%至99.0%;禽源株和猪源株间FimA的同源性为89.6%至91.1%。在pilA开放性阅读框所编码的FimA182个氨基酸序列中,禽源大肠杆菌O78血清型的2个分离株037株和166株间只有2个氨基酸不同,其同源性为99.0%。     

抗鸡大肠杆菌F11菌毛单克隆抗体的研制

将充分菌毛化的大肠杆菌（C1976－79（pap )经4‰甲醛灭活作为免疫原免疫BALB／c小鼠，经淋巴细胞杂交瘤技术，用间接ELISA筛选获得FA1、FB11两株抗FB11菌毛单抗，其FLISA效价分别为18log2和15log2试管凝集价分别为8log2和6log2。免疫印迹实验表明：两株单抗均能与鸡大肠杆菌F11菌毛反应，识别分子量为18kD左右的菌毛蛋白。同时对猪病原性大肠杆菌进行检测，结果均无交叉反应。这表明F11菌毛是不同于K88、K99、987P、F41及F18等粘附素的一种大肠杆菌菌毛。     

鸡致病性大肠杆菌菌毛分型的初步研究

以鸡致病性大肠杆菌F1菌毛特异性单抗1F4－1、2C3、3H3和F11菌毛特异性单抗FA1、FB11作为检测试剂，将111株已知O抗原的鸡致病性大肠杆菌经MD液体培养基连续传代培养后，通过直接玻板凝集法对各菌毛进行初步分型。结果发现F1、F11菌毛与O78、O1及O2三种优势O抗原型菌株之间存在较为明显的相关性，即致病性大肠杆菌主要集中在上。F1、F11菌毛在这三种O抗原型上的总检出率分别为95．6％、75．4％及73．3％。另外，在所检测的111株鸡致病性大肠杆菌中，只表达F1菌毛的大肠杆菌占菌杆总数的33．3％。只表达F11菌毛的大肠杆菌占菌株总数的8．1％，两者都表达的占菌株总数的36％，F1、F11菌毛的总检出率为78．3％。     

动物性食品源大肠杆菌O血清型鉴定及其K88菌毛基因检测

本研究对河北省冀东地区农贸市场和超市采集的生猪肉、生鸡蛋和生羊肉等分离得到的20株大肠杆菌进行大肠杆菌血清型鉴定;并检测不同血清型大肠杆菌的K88菌毛基因。采用常规方法进行大肠杆菌的O血清型鉴定,用PCR方法检测K88菌毛基因。分离鉴定的20株大肠杆菌有7种血清型,包括O38、O78、O88、O11、O107、O91、O9,其中O38、O78为优势血清型菌,均占分离菌株的25%(5/20)。在分离的动物性食品源大肠杆菌中有30%(6/20)的菌株K88菌毛基因扩增呈阳性。结果表明,O78、O38为冀东地区动物性食品源大肠杆菌常见血清型,30%(6/20)的菌株K88菌毛基因扩增阳性。     

天津地区鸡致病性大肠杆菌血清型分布及其优势血清型的外膜蛋白型研究

从天津地区各区县养鸡场分离 ,鉴定出 45株鸡致病性大肠杆菌。对 45株致病性大肠杆菌进行血清型鉴定 ,共定型出 3 1株 ,分属 1 4个血清型 ,其中 O78、O88、O2 、O4 5、O53、O14 5为优势血清型 ,占定型菌株的 58.3 %。提取 O78、O88、O2 、O4 5、O53和O14 56个血清型 1 8个分离株的外膜蛋白 ( Outermembrane protein,OMP) ,测定外膜蛋白型 ( Outmembrane protein patterns,OMPS) ,SDS-PAGE分析表明这些分离株共产生了 3个 OMP型 ( 1～ 3型 )。 OMP-1型为 O78、O88、O2 、O53、O14 55个血清型分离株所共有 ,OMP-2型为 O78、O4 5、O14 53个血清型分离株所共有。这表明同一血清的菌株可能属于完全不同的 OMP型 ,而血清型不同的菌株也可能为同一 OMP型。     

临沂市鸡源致病性大肠杆菌的优势血清型监测及其致病性试验

为了查清我市禽大肠杆菌的血清型及其致病性,对我市不同区域的23个规模化养鸡场及60个养鸡户的412份疑似大肠杆菌病病例进行了细菌分离,并对其进行了生化试验、致病性试验、血清学鉴定。结果:(1)412份病料中分离出了362株大肠杆菌,分离率为87.9%;⑵不同区域的鸡场流行的血清型有较大差异,在362个分离株中,除了27株未能定型、12株自凝外,共鉴定出323个分离株的O型血清型,占分离株的89.2%,这些定型菌株覆盖了36个血清型;(3)优势血清型为O1、O78、O18、O11、O88、O24,这6种血清型共占定型菌株的56.3%;⑷6种优势血清型均具有致病性,其中O1、O78、O18、O11、O24为高致病性菌株,O88为中致病性菌株。     

肠出血性大肠杆菌O157∶H7主要保护性抗原单克隆抗体的研制及特性分析

以基因重组技术构建工程菌株表达肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157∶H7主要保护性抗原紧密素和志贺毒素的融合蛋白.融合蛋白采用凝胶分离电洗脱法回收纯化,用纯化的蛋白抗原免疫BALB/c小鼠,细胞融合后获得的3株杂交瘤细胞株1G2、3C6、1B10,能分别稳定分泌针对紧密素、志贺毒素Stx1和Stx2的单克隆抗体.3株单抗分别制备腹水并纯化,ELISA检测效价分别为1∶6.4×105、1∶1.2×106、1∶3 200.Western-blot检测表明,3株单抗与融合蛋白发生特异性反应.应用3株单抗均可特异性检出EHEC O157∶H7,而3株单抗与其他不产生紧密素和志贺毒素的大肠杆菌不反应.     

禽致病性大肠杆菌菌毛研究进展

禽致病性大肠杆菌的血清型以O1、O2、O8、O78等为主。研究表明，这类大肠杆菌均具有菌毛。菌毛叉称纤毛、柔毛，是大肠杆菌的一种蛋白质突起，禽大肠杆菌菌毛主要有I型菌毛和P型菌毛两种，目前认为菌毛是大肠杆菌的重要致病因子，与大肠杆菌的致病性密切相关，菌体借助菌毛与气管黏膜上的特异性受体结合，从而致病。菌毛在体外的表达具有温度及营养的依赖性。近年来，对大肠杆菌菌毛的研究越来越多，特别是随着分子生物学的发展，对禽大肠杆菌菌毛的研究也不断深入，取得了不少的研究成果。本文试就禽致病性大肠杆菌菌毛的体外表达与提取、粘附特性与致病性、免疫学特性及其分子生物学的有关研究作一综述，以供参考。     

抗Asia1型口蹄疫病毒单克隆抗体的制备及生物学特性鉴定

用纯化的Asia1型口蹄疫病毒免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经间接ELISA和间接免疫荧光(IFA)筛选,有限稀释法克隆,获得了2株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为3H6、5G3,其细胞培养上清效价分别为1:64和1:128,小鼠腹水效价分别为1×10~(-4)和8×10~(-3);ELISA和IFA结果显示,2株单抗仅与Asial型口蹄疫病毒反应,不与O型口蹄疫病毒反应,表明它们均为抗Asial型口蹄疫病毒的型特异性单克隆抗体。westem blot结果显示,2株单克隆抗体均不与全病毒抗原反应,表明它们所针对的抗原表位均为构象表位。相加ELISA试验表明,两株单抗识别不同的抗原表位。经硫氰酸盐洗脱法测定,3H6和5G3的相对亲和力指数分别为1.0 mol/L和1.5 mol/L。这2株单抗的获得为建立口蹄疫病毒检测方法提供了强有力的工具。     

海安县鸡大肠杆菌病病原的分离鉴定及多价灭活苗的研制

为了确定海安县鸡大肠杆菌病的病原并研制多价灭活苗,试验对从海安县兽医站门诊及12个大型养殖场具有疑似大肠杆菌病病变的252只病死鸡进行了病原分离及鉴定。结果表明:共分离、鉴定出大肠杆菌226株,定型198株;共测出23个血清型,其中O78(32株)、O18(26株)、O2(21株)、O88(17株)、O1(13株)、O11(10株)6种血清型占定型菌株的60.1%,为海安县大肠杆菌优势血清型;将此6种优势血清型大肠杆菌制成多价灭活苗免疫雏鸡,安全性好,保护率高。     

肉仔鸡病原大肠杆菌地方分离株的血清型鉴定

从河北的三河、滦南、乐亭、卢龙及昌黎等地 2 9个养鸡场 (户 )分离鉴定了 82株病原大肠杆菌 ,用 54种常见动物病原大肠杆菌单价 O抗血清进行了血清型鉴定。结果 82株分离菌有65株被鉴定出了相应 O血清群 (占鉴定菌株的79.2 6%) ,分属 6种不同血清型 ,其中以 O78和O45两种为优势血清型 (占定型菌株的64.61 %) ,其余 4种 O血清群占定型菌株的 3 5.3 9%,尚有 1 7株未能定型 (占鉴定菌株的 2 0 .74%)     

江苏泰州某鸡场禽源性大肠杆菌的分离鉴定及生物学特征研究

为确定江苏泰州某鸡场疑似禽大肠杆菌病的病原,通过病理剖检了解组织器官病变情况,采集患病鸡的肝脏、心脏等脏器进行细菌分离培养,并测定分离株生化特性和血清型;采用PCR鉴定分离株及其携带毒力基因(iut A、iss、tsh、iro N、irp-2、cva C)的数量,经动物感染试验确定其致病力;通过药敏试验测定分离株对14种抗生素的耐药性。结果显示:共鉴定出4株禽源性大肠杆菌,其血清型分别为O78、O24、O88和O13,其中O78株(携带iut A~+、iss~+、iro N~+、irp-2~+、cva C~+)和O24株(携带iut A+、iss+、iro N+、cva C+)为强毒力菌株,O88株(携带iutA~+、iss~+、cvaC~+)和O13株(携带iss~+、cva C~+)为弱毒力菌株;4株禽源性大肠杆菌呈现多重耐药,对氨苄青霉素、四环素、强力霉素、先锋Ⅳ、磺胺异噁唑普遍耐药。研究表明,临床分离的禽源性大肠杆菌具有不同程度的致病性,且耐药严重,提示禽大肠杆菌病的防控难度增大。     

海安县猪水肿病的流行病学与病原特性研究

对江苏省海安县2003年5月-2004年5月各乡镇猪水肿病的发病和死亡情况进行了流行病学调查,发现猪水肿病在该地区呈零星散发性发生,发病率为0.31%～1.84%,死亡率为0.07%～0.56%,病死率为16.0%～35.0%。水肿病主要侵害仔猪,育成猪也偶有发生,一般以气温比较高的季节多发。同时从疑似猪水肿病的病料中分离到12株大肠杆菌,经O血清型鉴定,5株为O139,2株为O45,O55、O93、O9、O101、O119各1株。经多重PCR检测毒素基因(STa、STb、LT、SLT-2e)和大肠杆菌粘附素单抗(F4、F5、F6、F41、F18)检测菌毛,共6个分离株带有SLT-2e基因,其中O139分离株5株,O55分离株1株,其余6株均带STb基因。12个分离株中,单独表达F18菌毛的4株(O1392株,O45、O119各1株),F5 F411株(O93),F41 F181株(O139),F5 F41 F182株(均为O139)。经药敏试验,多数分离菌株对壮观霉素和新霉素高度敏感。     

肠出血性大肠杆菌O157：H7主要保护性抗原单克隆抗体的研制及特性分析

以基因重组技术构建工程菌株表达肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157∶H7主要保护性抗原紧密素和志贺毒素的融合蛋白。融合蛋白采用凝胶分离电洗脱法回收纯化,用纯化的蛋白抗原免疫BALB/c小鼠,细胞融合后获得的3株杂交瘤细胞株1G2、3C6、1B10,能分别稳定分泌针对紧密素、志贺毒素Stx1和Stx2的单克隆抗体。3株单抗分别制备腹水并纯化,ELISA检测效价分别为1∶6.4×105、1∶1.2×106、1∶3200。Western-blot检测表明,3株单抗与融合蛋白发生特异性反应。应用3株单抗均可特异性检出EHECO157∶H7,而3株单抗与其他不产生紧密素和志贺毒素的大肠杆菌不反应。     

大连某奶牛场奶牛乳房炎病原菌分离及鉴定

本试验对大连某奶牛养殖场15头患临床型乳房炎病牛进行病原菌分离、鉴定。使用鉴别培养基对乳样中的大肠杆菌、葡萄球菌、链球菌及沙门氏菌进行分离,并对分离出的大肠杆菌进行血清学“O”抗原检测试验。结果显示,25个乳区的乳样共分离到病原菌37株,其中大肠杆菌15株、链球菌13株、葡萄球菌8株、沙门氏菌1株,乳房炎阳性率为5.2%,乳区阳性率为2.2%;大肠杆菌分离株以O51、O148、O78、O60血清型为主。     

一规模化猪场断奶仔猪腹泻大肠杆菌毒力因子的检测

从疑似断奶仔猪腹泻的仔猪中分离、鉴定出15株病原性大肠杆菌。经O血清型鉴定,11株为0131、4株未定型,所有O131血清型菌株呈β溶血。多重PCR检测毒素基因(STa、STb、LT、SLT-2e)和大肠杆菌粘附素单抗(F4、F5、F6、F41、F18)检测菌毛,O131菌株的毒素为STa、STb、SLT-2e,表达F18粘附素,未定型菌株的毒素为STa,共表达F6和F18粘附素。对15株大肠杆菌用16种抗生素进行药敏试验,结果表明:分离株对阿米卡星、痢特灵、新霉素敏感,而对多种抗生素产生了不同程度的耐药性。运用本场大肠杆菌分离株灭活苗免疫猪群,取得良好效果。