白芨转录因子基因BsWRKY14的克隆与分子特性分析

WRKY转录因子在调节植物生长发育、抵抗生物和非生物胁迫响应中发挥重要作用,分析WRKY家族成员的基因序列信息,为进一步研究基因功能提供前期研究基础。基于白芨转录组数据,对Bs WRKY14基因进行克隆;利用生物信息学方法对BsWRKY14蛋白的理化特征、保守结构域和亚细胞定位等特性进行分析,用DNAMAN和MEGA 6.0进行氨基酸多序列比对和进化关系分析。结果表明Bs WRKY14基因包含1个1 179 bp的开放阅读框,编码392个氨基酸,预测是定位在细胞核中的不稳定亲水性蛋白,无跨膜结构域,BsWRKY14蛋白包含一个WRKY基因保守结构域和一个C2H2锌指结构域,属于WRKY基因家族的第Ⅱ类成员;Bs WRKY14与铁皮石斛WRKY蛋白亲缘关系最近。白芨Bs WRKY14基因的克隆与分子特性分析为深入研究BsWRKY14基因在调节白芨生长发育和逆境胁迫响应中的作用提供数据支持。     

基于转录组金银花WRKY转录因子的挖掘与分析

WRKY转录因子是植物抗逆应答过程中最为常见的蛋白家族。为了挖掘金银花抗寒相关的WRKY基因,本研究基于已有的转录组数据,利用植物转录因子数据库和BioEdit对WRKY进行筛选及保守结构域分析,对筛选出的WRKY转录因子利用ExPASy进行理化性质分析,利用PSORT进行亚细胞定位预测,NetPhos进行磷酸化位点分析并且利用MEME数据库对WRKY基因的氨基酸进行序列分析,运用MEGA软件对筛选的金银花WRKY转录因子基因和21个已知抗寒的WRKY基因进行序列同源比对,并构建系统进化树。结果表明:金银花中筛选的30个WRKY基因的蛋白为85～721个氨基酸,理论等电点的范围为4.85到9.76。所有LjWRKY基因编码的蛋白中只有LjWRKY6为稳定蛋白,其余均属于不稳定蛋白,所有蛋白均属于亲水性蛋白。亚细胞定位预测结果,LjWRKY所有蛋白定位于细胞核。除LjWRKY23不具有Try磷酸化位点,其它所有氨基酸均具有Ser、Thr和Try磷酸化位点。LjWRKY蛋白比较保守,WRKYGQK没有发生任何变异,且包含三类WRKY转录因子。系统进化树发现,有12个WRKY基因与已知抗寒基因有同源性,推测其参与了金银花低温逆境下的反应。研究结果可以通过筛选的WRKY基因,进行进一步的转基因验证,进而为植物抗寒分子育种提供分子基础。     

菊花CmWRKY4基因克隆及表达分析

WRKY转录因子在植物生长发育和逆境胁迫应答中具有重要作用。本研究克隆了一个菊花WRKY基因CmWRKY4,编码区长1 344 bp,编码447个氨基酸,预测分子量约为49.69 kD,等电点为6.62。推测的氨基酸序列中含有2个高度保守的WRKY结构域。亚细胞定位预测CmWRKY4蛋白定位于细胞核。进化树分析发现,CmWRKY4和拟南芥At WRKY3,AtWRKY20和At WRKY25聚在一个分支。组织特异性表达模式分析表明CmWRKY4在检测的组织中都有表达,在根中表达量最低,在叶中表达量最高。Cm WRKY4基因的表达受干旱诱导,说明菊花CmWRKY4基因可能参与菊花对干旱胁迫的应答。     

燕麦转录因子BTF3的电子克隆和生物信息学分析

运用电子克隆的方法获得一个燕麦BTF3基因的完整的cDNA序列。利用生物信息学方法对其编码的蛋白的一、二、三级结构和功能进行预测和分析。结果表明:该基因cDNA全长为870 bp,开放阅读框为531 bp,编码176个氨基酸,是一种亲水的不稳定的蛋白,定位在核内,拥有一个NAC保守结构域,与小麦等其它植物高度相似。为燕麦BTF3基因的克隆,功能分析和应用提供了参考。     

辣椒WRKY转录因子的鉴别及进化分析

为了深入了解WRKY转录因子调节植物生长发育的过程,以辣椒全基因组和辣椒疫病转录组测序数据为材料,利用生物信息学方法分析辣椒WRKY转录因子的数目、种类、系统发生学和保守基序特征。结果表明,辣椒基因组中至少存在40个WRKY基因,包含1~2个WRKY保守结构域,根据WRKY结构域的数量及锌指结构的特征可将其分为Ⅰ、Ⅱ( a)、Ⅱ( b)、Ⅱ( c)、Ⅱ( d)、Ⅱ( e)和Ⅲ类/亚类。辣椒WRKY基因的保守motif共有3个,motif长度最长为50,最短为21,辣椒WRKY编码的蛋白为151~747个氨基酸,平均氨基酸数量为378.1个。该研究对辣椒WRKY基因功能的研究及进化具有重要的意义。     

中间锦鸡儿WRKY12基因克隆与生物信息学分析

WRKY转录因子是植物信号网络中不可缺少的部分,是最大的调节子家族之一。本研究从中间锦鸡儿干旱转录组及基因表达检测数据中,挑选出对干旱、冷、盐、碱及ABA都响应明显的CiWRKY12基因,对其进行克隆及生物信息学分析。结果显示:CiWRKY12基因的开放阅读框为696 bp,编码232个氨基酸,含有一个典型的WRKY保守结构域,属于GroupⅡc亚族。对转录因子CiWRKY12与其它8种植物的同源蛋白的理化性质和一、二、三级结构进行生物信息学比较分析,发现这9个蛋白无规则卷曲比例较高,大部分属于不稳定蛋白;亚细胞定位预测表明大部分的蛋白定位于细胞核内;多重序列比对显示WRKY保守结构域保守性很高,其三级结构上也呈现较高的相似性,推测这9个转录因子可能具有相似的转录调控功能。通过本研究生物信息学分析将有助于对CiWRKY12深层次功能研究提供借鉴作用。     

蒜芥茄黄萎病抗性相关基因SsWRKY22和SsWRKY33的克隆与表达分析

黄萎病是茄子生产中的重要病害之一,严重影响茄子的产量和品质。WRKY转录因子在植物抗病中扮演着重要的角色,但在茄子黄萎病抗性中的作用不明。本研究从黄萎病高抗材料野生蒜芥茄的转录组数据中,筛选获得WRKY家族中的SsWRKY22和SsWRKY33基因,利用PCR技术克隆获得目的基因,并对其进行生物信息学和表达模式分析。结果表明,SsWRKY22和SsWRKY33基因的ORF序列大小分别为528和1 073 bp,编码175个和357个氨基酸;蛋白分子量分别为19.19和40.46 kD,均属于亲水性不稳定蛋白,其中,Ss WRKY22编码的蛋白属于酸性蛋白,而Ss WRKY33编码的蛋白属于碱性蛋白,亚细胞定位预测两个基因编码的蛋白均定位于细胞核上;此外,SsWRKY22和SsWRKY33分别属于Ⅱ类和Ⅰ类WRKY转录因子,具有不同的蛋白结构。系统发育分析结果表明,Ss WRKY22与野生潘那利番茄、番茄和马铃薯中的WRKY22亲缘关系较近;而Ss WRKY33与辣椒中的WRKY33亲缘关系最近。利用RT-qPCR对SsWRKY22和SsWRKY33基因在蒜芥茄不同部位(根,茎,叶)的表...     

SUSIRI基因的生物信息学分析及亚细胞定位

转录因子是植物生长发育及其对外界环境的应答反应中起重要作用的蛋白调控因子,一般含有DNA结构域、转录调控域、寡聚化位点和核定位信号。WRKY蛋白是一类具有重要作用的转录调控因子。在水稻的基因组中预测到的WRKY基因多达103个,对这些基因的功能加以注释具有重要的意义。SUSIRI基因是前人从粳稻日本晴中克隆的一个WRKY家族的转录因子。其开放阅读框长度为1755 bp,可编码584个氨基酸,具有典型的双WRKY结构域。为了进一步研究SSUSIRI基因,阐明它在水稻中的生物调控功能。通过应用生物信息学的方法,对该基因的预测蛋白进行了结构与功能的分析。利用EBI的interpro数据库分析SUSIRI基因序列的基序(motif),并结合NCBI的CDD(conserved domains)数据库分析该蛋白的保守结构域,用DNAMAN软件和CBS的TMHMM软件分析蛋白氨基酸残基的亲（疏）水性特点和跨膜结构域,用CBS的Protcomp version9.0软件和Protfun软件分别分析了蛋白的亚细胞定位和功能预测;通过实验设计把SUSIRI基因与GFP基因相融合,构建了由actin启动子驱动的SUSIRI基因的荧光表达载体pNSUGFP。通过采用基因枪法把该载体转入洋葱表皮细胞进行亚细胞定位鉴定。结果表明,生物信息学预测值显示：SUSIRI基因具有转录、转录调控、信号转导类功能的可能性最高,预测值分别为0.973、1.598和0.602;同时,其参与翻译功能、中间代谢功能和脂肪酸代谢功能的可能性也较大,预测值分别为4.800、1.490和1.265;由于SUSIRI蛋白中含有的亲水性氨基酸残基较多,该蛋白不具有跨膜性,是一种非跨膜类蛋白。对其亚细胞定位预测表明：在其氨基酸序列中含有较强的核定位信号,所以定位于细胞核内的可能性很大。进一步用荧光显微镜对基因枪轰击的洋葱表皮细胞的观察发现：对照的GFP蛋白主要沿细胞壁表达,而SUSIRI-GFP融合蛋白在细胞核中有很强的表达。通过试验研究得出：SUSIRI基因可能是一个参与中间代谢调控功能的基因,主要在基因转录环节发挥作用,是一种核定位蛋白。     

苋菜WRKY13基因克隆与生物信息学分析

以苋菜试管苗为材料,利用实验室构建的苋菜转录组数据库,筛选出WRKY13基因cDNA序列,对其开放阅读框(ORF)进行克隆验证和生物信息学分析。结果表明,WRKY13基因ORF长度为675 bp,编码224个氨基酸。通过生物信息学预测,该蛋白属于疏水性蛋白,有44个氨基酸位点存在磷酸化修饰;是WRKY蛋白超级家族(WRKY superfamily)的一个成员,存在1个WRKY结合位点;其二级结构由无规则卷曲结构、β折叠组成和α螺旋;蛋白系统进化树分析表明苋菜WRKY13蛋白独立形成一个分支,但与拟南芥、芜菁、烟草、葡萄聚类到一起,说明WRKY13蛋白在生物进化过程中还是比较保守的。本研究获得了苋菜WRKY13基因完整ORF,这为将来深入研究苋菜WRKY13基因功能提供了科学依据,也为研究其调控甜菜红素代谢过程的影响提供参考。     

甜樱桃PaGAST基因的电子克隆及生物信息学分析

为获得甜樱桃PaGAST基因的cDNA序列,并预测该基因编码蛋白的结构与功能,以草莓FaGAST1基因序列为探针,通过基于NCBI数据库中表达序列标签的电子克隆技术对甜樱桃PaGAST基因进行克隆。利用生物信息学方法对其编码蛋白的理化性质、疏水性和亲水性、信号肽序列、跨膜结构域、亚细胞定位及功能等方面进行分析。结果表明:甜樱桃PaGAST基因长度为750 bp,开放阅读框长度为324 bp,编码107个氨基酸,N末端存在信号肽序列,C末端含有保守的GASA结构域。由于PaGAST蛋白中含有的疏水性氨基酸残基较多,该蛋白具有跨膜螺旋区,是一种跨膜蛋白,且有10个预测的蛋白激酶磷酸化位点。亚细胞定位分析表明,PaGAST蛋白分布在细胞膜外的可能性很大。功能预测显示,PaGAST基因可能具有响应胁迫应答、信号转导和免疫应答方面的功能。进化分析显示甜樱桃PaGAST蛋白与桃的亲缘关系最近。在一定程度上为甜樱桃PaGAST基因的克隆及功能鉴定奠定理论基础。     

陆地棉基因GhWRKY40-1的克隆及表达分析

【目的】WRKY转录因子通过激活下游一系列抗逆应答基因的表达而提高植株的综合抗性。本研究旨在研究WRKY转录因子在陆地棉中的功能。【方法】通过基因芯片筛选鉴定出1个逆境诱导的陆地棉WRKY转录因子基因,由于此基因编码蛋白含有1个典型的WRKY结构域,且与拟南芥At WRKY40具有较高相似性,故命名为GhWRKY40-1。采用电子克隆及反转录-聚合酶链反应技术获得GhWRKY40-1基因c DNA全长,并对其进行序列分析及结构与功能预测。【结果】GhWRKY40-1的开放阅读框为981 bp,编码326个氨基酸,预测蛋白相对分子质量为35.78×103,等电点为8.39。GhWRKY40-1在拟南芥原生质体中瞬时表达定位于细胞核,且具有转录激活活性。RT-PCR结果表明,GhWRKY40-1受甘露醇诱导上调表达。【结论】推测GhWYKY40-1可能参与干旱胁迫应答反应,并且在植物逆境胁迫中发挥重要作用。上述分析为进一步从分子水平上验证其抗逆生物学功能以及揭示棉花非生物胁迫抗逆机制奠定了基础。     

龙眼DlWRKY57基因克隆与拟南芥遗传转化

以龙眼成熟叶片为材料,利用实验室构建的龙眼转录组数据库,筛选出Dl WRKY57基因c DNA序列,对其开放阅读框(ORF)进行克隆和生物信息学分析。结果表明,Dl WRKY57基因ORF长度为894 bp,编码297个氨基酸,此蛋白属于WRKY基因家族中的域a类,存在1个WRKY结合位点。通过生物信息学分析表明,该蛋白属于非跨膜亲水蛋白,预测定位于细胞核,存在45个氨基酸磷酸化位点。其二级结构由无规则卷曲、琢-螺旋和延伸链构成,其中无规则卷曲为二级结构中最主要的结构元件,并且二级结构与三级结构预测结果高度一致。同源基因进化树分析表明该基因与木薯亲缘关系最近。以p MD18-T和p BI121载体为基础,成功构建了植物超表达载体p BI121-Dl WRKY57,利用农杆菌花序法转化拟南芥,经PCR分子检测,获得含Dl WRKY57基因的拟南芥植株,该超表达载体的遗传转化为Dl WRKY57基因功能的深入研究提供依据。     

海岛棉GbWRKY40基因的克隆及特征分析

【目的】WRKY转录因子调控多种生物学进程,包括植物生长发育和应答多种环境胁迫。本研究旨在分析WRKY转录因子在海岛棉纤维发育中的功能。【方法】从海岛棉中克隆了1个WRKY转录因子基因GbWRKY40,进行同源性分析、多序列比对,利用荧光定量聚合酶链式反应分析其表达模式,通过构建酵母表达载体并转化酵母菌株AH109研究其转录激活活性。【结果】该基因c DNA全长1713 bp,5'非编码区长261 bp,3'非编码区长510 bp;开放阅读框长942 bp,编码313个氨基酸,预测相对分子质量约为34.138×103,等电点为8.46,包含5个外显子和4个内含子;其编码蛋白含有1个WRKY保守区(WRKYGQK)和1个锌指基序(C-X5-C-X23-H-X1-H),属于WRKY家族第Ⅱ类a组,包含3个核定位信号区,与陆地棉GhWRKY40同源性最高。GbWRKY40在根和开花后25 d纤维中表达量高,而且不具有转录激活活性。【结论】GbWRKY40可能参与调控棉纤维次生壁发育。     

转录因子基因TaWRKY72b-1的克隆，表达及在烟草中表达对植株磷效率的影响

在富集低磷胁迫特异表达基因的小麦根系cDNA差减杂交文库中，鉴定了1个与拟南芥WRKY75同源的小麦WRKY型转录因子基因表达序列标签(EST)。依据该EST序列高度同源的小麦WRKY72b序列，克隆了对应基因TaWRKY72b-1。TaWRKY72b-1与WRKY72b在cDNA序列上有2个碱基的差异，但编码氨基酸没有改变。TaWRKY72b-1开放阅读框为621 bp，编码206个氨基酸残基，氨基酸组成上含有保守的WRKY基序和C2H2基序。系统进化分析表明，TaWRKY72b-1与小麦WRKY72a和大麦WRKY12可能来自相同的祖先。与对照供磷水平(2 mmol L^-1 P)相比，低磷处理使根叶中TaWRKY72b-1的转录本数量均明显增多。表明TaWRKY72b-1对低磷胁迫逆境产生了明显的应答作用。TaWRKY72b-1在烟草中表达表明，低磷胁迫条件下，高表达TaWRKY72b-1的烟草植株干重、单株磷累积量和磷利用效率均较对照明显增加。因此，TaWRKY72b-1基因在改善低磷胁迫下作物的磷效率中可能具有较重要的应用价值。     

水稻中一个SUSIBA2相似基因的克隆与表达分析

大麦SUSIBA2是一个WRKY转录因子,它能够识别糖响应元件,激活异淀粉酶基因iso1和淀粉分支酶基因sbeIIb的表达,从而影响胚乳中淀粉的合成。我们根据SUSIBA2的序列,从水稻基因组序列中搜索到一个与其相似的WRKY基因（称为SUSIRI）,含6个外显子。采用RT-PCR技术,我们从水稻的幼穗中克隆到该基因的cDNA,全长为1921bp,其中ORF长1755bp,可编码584个氨基酸,并具有典型的双WRKY结构域,与大麦的SUSIBA2相似度达81%。Northernblot分析结果显示,该基因在水稻抽穗至种子成熟的发育过程中,在稻穗中的表达活性是逐渐减弱的。     

鸡NYGGF4同源基因的克隆与表达分析

小鼠和人的NYGGF4基因参与前脂肪细胞的增殖调控,并可能与肥胖的发生发展有关。本研究首次克隆获得了鸡的NYGGF4同源基因的全长编码序列,利用生物信息学方法对鸡NYGGF4同源基因的遗传进化性和蛋白功能进行预测分析,并利用半定量RT-PCR技术对雏鸡的NYGGF4同源基因进行组织表达谱分析。结果表明：鸡NYGGF4同源基因的编码序列全长654bp,进化保守,在多个组织脏器中具有转录表达活性,编码蛋白具有一个磷酸酪氨酸作用结构域(PID),而编码PID结构域的蛋白广泛参与神经发育、免疫、组织平衡和细胞生长等生理过程,这表明鸡NYGGF4同源基因是一个可能具有多种功能的新基因。     

甘蓝型油菜隐性核不育两用系S45AB中与MS2Bnap基因同源片段的克隆及序列分析

以甘蓝型油菜隐性核不育两用系S45AB的可育株和不育株为材料, 提取减数分裂期与单核期的花粉mRNA, 反转录合成cDNA, 并以其为模板扩增花粉特异基因MS2Bnap. 结果减数分裂期能扩出产物, 而单核期无任何产物. 将减数分裂期的扩增产物克隆、测序. 同源性分析表明: 在S45AB上克隆的MS2Bnap基因与Gene Bank公布的拟南芥控     

绿色棉苯丙氨酸解氨酶基因GhPAL1的克隆和实时定量表达分析

本研究以拟南芥(Arabidopsis thaliana)苯丙氨酸解氨酶(PAL)基因cDNA序列(AAC18870.1)为探针,在GenBank中与棉花EST进行tBLASTn比对,将同源性高的EST序列拼接后获得一条棉花PAL全长cDNA基因序列,以此序列为模板设计引物,通过RT-PCR扩增从绿色棉纤维分离出了一个绿色棉PAL基因全长cDNA序列,将该基因命名为GhPAL1(GenBank登录号:JN032297)。序列分析表明,该cDNA全长2347bp,含有一个编码721个氨基酸的开放阅读框。实时荧光定量PCR分析发现:该基因在绿色棉纤维中的表达模式与白色棉纤维相似,但两者在同一时期的表达量差异显著,其在花后6d绿色棉纤维细胞中的表达量是同期白色棉的6倍以上,从该基因的表达特征推测GhPAL1基因可能在绿色棉纤维色素合成过程中发挥重要作用。