野油菜黄单胞菌的XopR基因功能

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc)是一种能够引起十字花科植物产生黑腐病的重要病原菌。笔者以野油菜黄单胞菌Xcc8004菌株XopR基因为研究对象,通过qRTPCR发现,XopR基因的表达受Ⅲ型调控基因hrpG和hrpX的调控,并且XopR蛋白的分泌依赖于Ⅲ型分泌系统结构基因hrcV,这表明XopR是Xcc8004的一个Ⅲ型分泌效应蛋白。利用同源重组的方法,笔者获得了XopR基因的缺失突变体ΔXopR。将野生型Xcc8004和ΔXopR突变体分别接种甘蓝品种中甘15、中甘21和大白菜品种中白83,发现ΔXopR突变体菌株致病性下降,表明XopR对于Xcc8004在甘蓝上的完整毒性是必须的。GFP融合蛋白分析发现XopR定位于拟南芥原生质体的细胞膜上,可以在拟南芥原生质体中抑制细菌鞭毛蛋白诱导的FRK1基因表达。     

黄单胞菌葡萄糖转运系统相关基因的敲除及功能分析

分别敲除了植物病原体野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris pv. campestris 8004）的3个葡萄糖转运蛋白和2个葡萄糖脱氢酶,获得了5株相应基因敲除的突变体。在营养丰富的培养基中,这5株突变体的生长曲线、胞外纤维素酶活性和胞外多糖量与野生型相比并无显著差异。在以葡萄糖为唯一碳源的M63培养基中,XC_2460基因的敲除显著影响了黄单胞菌的生长;在以CMC作为唯一碳源的M63培养基中,XC_2460基因的敲除使突变体的胞外葡萄糖累积量达到野生菌株的167倍。这些结果首次显示阻遏葡萄糖的跨膜转运是改进纤维素分解菌株积累葡萄糖量的有益途径。     

利用双向电泳构建十字花科黑腐病菌HrcV控制的分泌蛋白质图谱

以十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc)8004菌株为研究材料,采用双向电泳-质谱技术鉴定Hrc V控制的分泌蛋白质组。结果表明,野生型和突变体菌株均获得分辨率高且具有可重复性的双向电泳银染图谱,经过图像软件分析找出差异点61个,以野生型菌株为对照,22个蛋白点上调,39个蛋白点下调。挖取下调蛋白质点39个做质谱分析,质谱成功鉴定出25蛋白质,主要包括各种酶类、转运蛋白、延伸因子、Dna K蛋白、分子伴侣及假定蛋白。推测这些蛋白质可能在Xcc 8004的致病性中起到重要作用,为进一步研究Xcc的致病机理奠定基础。     

野油菜黄单胞菌群体感应的跨界信号交流被首次发现

群体感应(Quorum sensing,QS)是细菌根据自身分泌的信号分子的浓度感应细胞密度进而产生细菌群体行为的基因调控方式。由信号分子介导的信号传递途径不仅发生在细菌之间,也存在于真核生物与细菌之间。野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris pv.campestris,     

黄单胞菌分泌蛋白的理化性质及特征分析

基于全基因组序列已经公布的黄单胞菌Xanthomonas campestris B100、Xanthomonas campestris pv. campestris 8004、Xanthomonas campestris CN14中分泌蛋白序列为基础数据,采用Protscale、SMART、TargetP 2.0 Server等生物信息学分析软件对上述分泌蛋白展开理化性质、保守结构域以及转运肽等分析,结果显示：黄单胞菌中分泌蛋白理论等电点与氨基酸长度之间无相关关系, 44.73%的蛋白为不稳定蛋白, 83.21%的蛋白亲水性小于0,属于亲水性蛋白。同时,在每种黄单胞菌的分泌蛋白中,具有明显保守结构域的蛋白数量平均为12个,并且所有分泌蛋白均具有信号肽,转运肽预测可能性分布也较为平均。     

黄单胞菌α-淀粉酶基因的克隆、测序及表达探讨

用鸟枪法构建了野油菜黄单胞茵(Xanthomonas campestris pv．campestris)8004的基因组文库,经LBSP法筛选,得到了含α-淀粉酶基因的基因片段,SDS-PAGE凝胶电泳确定其蛋白质分子量约为45kd;经测序后,分析其序列结构并翻译成氨基酸序列．     

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种一个新的致病相关基因的克隆和鉴定

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xcc)是十字花科植物重要的病原菌,能引起十字花科作物发生黑腐病.本课题组采用转座子Tn5gusA5对Xcc野生型菌株8004诱变,获得17280株Tn5gusA5突变体,并从中筛选到一批致病缺陷突变体,采用TAIL-PCR对致病缺陷突变体的Tn5gusA5插入位点进行定位,发现5株突变体的Tn5gusA5插在8004菌株的基因组ORF1857内(未发表资料), 该ORF功能尚未见报道.序列分析表明,ORF1857演绎的编码产物与铜绿假单胞菌(Pseudomonase aeruginosa)的wbpL基因演绎的编码产物具有33%的一致性和45%的相似性,并具有第4家族的糖基转移酶功能域,因此本文暂将ORF1857命名为wbxL基因.对 wbxL基因进行缺失,获得的缺失突变体用剪叶法接种到寄主萝卜叶片时,缺失突变体完全丧失致病性,一段PCR合成的包含wbxL基因的DNA片段能互补缺失突变体,恢复缺失突变体的致病性.这证实wbxL基因是Xcc的一个新的致病相关基因.     

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种一个新的致病相关基因的克隆和鉴定

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xcc)是十字花科植物重要的病原菌，能引起十字花科作物发生黑腐病．本课题组采用转座子Tn5gusA5对Xcc野生型菌株8004诱变，获得17280株Tn5gusA5突变体，并从中筛选到一批致病缺陷突变体，采用TAIL-PCR对致病缺陷突变体的Tn5gusA5插入位点进行定位，发现5株突变体的Tn5gusA5插在8004菌株的基因组ORFl857内(未发表资料)，该ORF功能尚未见报道．序列分析表明，ORFl857演绎的编码产物与铜绿假单胞菌(Pseudomonase aeruginosa)的ωbpL基因演绎的编码产物具有33％的一致性和45％的相似性，并具有第4家族的糖基转移酶功能域，因此本暂将ORFl857命名为ωbxL基因．对ωbxL基因进行缺失，获得的缺失突变体用剪叶法接种到寄主萝卜叶片时，缺失突变体完全丧失致病性，一段PCR合成的包含ωbxL基因的DNA片段能互补缺失突变体，恢复缺失突变体的致病性．这证实ωbxL基因是Xcc的一个新的致病相关基因．     

转录调节因子VrhR负调控野油菜黄单胞菌的致病力

以野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris pv. campestris, Xcc）转录调节因子VrhR，VrhA和VrhB为研究对象，通过基因敲除和致病性分析确定它们在Xcc与宿主互作过程中的作用。结果表明:VrhR只含有HTH（helix-turn-helix）结构域；在基因组上vrhR位于其他2个lysR类转录调节因子（vrhA和vrhB）之间，但转录方向相反。vrhR突变会提高Xcc的致病能力，但vrhA和vrhB突变对病原菌的致病能力没有影响。同时, vrhR，vrhA和vrhB突变均不影响细菌的运动性及胞外酶（蛋白酶、纤维素酶和淀粉酶）的活性。     

十字花科黑腐病菌编码RNA聚合酶ω亚基的基因（rpoZXcc）突变导致细胞生长减慢

ω（Omega）亚基是组成细菌RNA聚合酶（RNA polymerase,RNAP）核心酶的5个亚基（2α、β、β′andω）中最小的一个,也是5个亚基中唯一可以去除而不会导致细胞死亡的亚基。尽管ω亚基存在于所有细菌中并且序列非常保守,但迄今为止,人们对ω亚基的功能却知之甚少。基因组注释结果表明,十字花科黑腐病菌8004菌株（Xanthomonas campestris pv.campestris strain 8004,简称Xcc8004）基因组中存在一个编码ω亚基的基因rpoZXcc（ORF编号为XC0957）。为了研究Xcc RNA聚合酶ω亚基的功能,采用自杀质粒pK18mob整合突变方法,构建了rpoZXcc基因的非极性突变体NK0957。表型检测结果显示,NK0957在基本培养基MMX和丰富培养基NYG中的生长比野生型菌株Xcc8004的生长明显减慢,而且NK0957的生长缓慢表型能被rpoZXcc反式互补。这些结果说明,ω亚基在Xcc的生长过程中发挥重要作用。     

野油菜黄单胞菌8004α-淀粉酶酶学性质研究

对野油菜黄单胞菌的α-淀粉酶进行了定位,确定该酶为胞外酶,且只有一型α-淀粉酶。采用切胶纯化得到纯酶,SDS-PAGE测得其相对分子质量为52ku。研究显示,该酶的最适作用温度为50℃,最适pH值为6.2,通过酶的稳定性研究发现该酶热稳定性较差,而pH值在4.86～10.47具有较好的稳定性。     

甘蓝黑腐病菌XC_3374基因功能的初步探究

【目的】初步探究XC_3374基因在甘蓝黑腐病菌Xcc8004中的功能,为深入研究甘蓝黑腐病菌Xcc8004中L-天冬酰胺酶的功能奠定基础。【方法】从KEGG数据库内获取XC_3374基因的旁侧序列,通过常规PCR对其进行克隆,同时利用自杀质粒pK18mobSacB通过同源双交换的方法构建了其缺失突变体DM3374并检测其表型。【结果】以引物D3374L-F/D3374R-R扩增,野生型菌株能够扩增出1789 bp的DNA片段,而候选突变体菌株能扩增出1367 bp的片段;以内部引物3374F/3374R扩增,野生型菌株能扩增出332 bp的片段,而候选突变体菌株不能扩增出任何片段,表明目标基因已缺失,缺失突变体DM3374构建成功。平板检测法结果表明,XC_3374基因突变后不影响胞外多糖及胞外酶的合成与分泌。在MMX基本培养基上,突变体菌株能够正常生长,形成的菌落大小与野生型菌株基本相同,表明缺失突变体不是营养缺陷性。游动平板检测结果表明, XC_3374缺失突变体的运动能力比野生型稍强,但差别不明显。采用剪叶法检测缺失突变体的致病性,结果表明,野生型Xcc8004和缺失突变体DM3374 病斑平均长度分别为13.000和11.983 mm,两者致病性无显著差异。【结论】XC_3374基因突变体在胞外多糖、几种胞外酶的合成与分泌、致病性等各种表型与野生型基本一致。     

野油菜黄单胞菌重组克隆pIXU9278对黄原胶生物合成的影响

用ＰＩＪ３２００作为载体,构建了包含１５６２个重组克隆野生型野油菜黄单胞菌的粘粒文库,通过三亲交配法,基因文库中的重组克隆可以在ＰＲＫ２０１３的帮助下,从Ｅ．ｃｏｄｉ中以ＸＣＣＮＡＵ－９２中,绝大多数重线克隆对黄原胶合成无影响,但导致菌株生长缓慢,工程菌株ＸＣＣＮＡＵ－９２７８（ＰＩＸＵ９２７８）在２８℃、１２０ｔ／ｍｉｎ条件下发酵７２ｈ,产量达３７．５０ｇ／ｋｇ,发酵液度力为１４６００ｍＰａ．ｓ     

十字花科黑腐病菌中假定糖基水解酶基因与致病力相关研究

[目的]已报道的十字花科黑腐病菌Xcc 8004菌株基因组中XC1077被注释编码一个假定糖基水解酶,初步研究XC1077基因的致病性,为深入研究Xcc 8004中的糖基水解酶在植物病原菌侵染及定殖过程中的作用奠定基础.[方法]通过同源单交换构建XC1077整合突变体NK1077,用带有全长XC1077基因序列的pLAFRJ质粒对NK1077进行功能互补并检测致病性.[结果]PCR及酶切验证表明整合突变体NK1077和互补菌株C1077构建成功.在MMX基本培养基上,NK1077及C1077的生长情况与Xcc 8004一致.致病性试验结果表明,NK1077在满身红萝卜的致病性下降到Xcc 8004的48.3％,过敏反应(HR)检测结果表明NK1077在辣椒ECW-10R上产生的HR反应明显滞后,而互补菌致病力及过敏反应能恢复至野生型水平.[结论]XC1077基因在Xcc 8004中是一个与致病相关的基因.     

甘蓝黑腐病菌XC3374基因功能的初步探究

【目的】初步探究XC₃374基因在甘蓝黑腐病菌Xcc8004中的功能,为深入研究甘蓝黑腐病菌Xcc8004中L-天冬酰胺酶的功能奠定基础。【方法】从KEGG数据库内获取XC₃374基因的旁侧序列,通过常规PCR对其进行克隆,同时利用自杀质粒pK18mobSacB通过同源双交换的方法构建了其缺失突变体DM3374并检测其表型。【结果】以引物D3374L-F/D3374R-R扩增,野生型菌株能够扩增出1789bp的DNA片段,而候选突变体菌株能扩增出1367bp的片段;以内部引物3374F/3374R扩增,野生型菌株能扩增出332bp的片段,而候选突变体菌株不能扩增出任何片段,表明目标基因已缺失,缺失突变体DM3374构建成功。平板检测法结果表明,XC₃374基因突变后不影响胞外多糖及胞外酶的合成与分泌。在MMX基本培养基上,突变体菌株能够正常生长,形成的菌落大小与野生型菌株基本相同,表明缺失突变体不是营养缺陷性。游动平板检测结果表明,XC₃374缺失突变体的运动能力比野生型稍强,但差别不明显。采用剪叶法检测缺失突变体的致病性,结果表明,野生型Xcc8004和缺失突变体DM3374病斑平均长度分别为13.000和11.983mm,两者致病性无显著差异。【结论】XC₃374基因突变体在胞外多糖、几种胞外酶的合成与分泌、致病性等各种表型与野生型基本一致。     

白菜型油菜亚种间杂种的合成

采用蕾期人工去雄与辅助授粉的方式,以白菜型油菜十月红菜薹和黄芽白进行正反交,以较高的频率获得了杂种后代。杂种后代叶型、株型和花等形态均表现为双亲的中间型。叶片颜色比黄芽白更深,均偏向十月红菜薹的紫红色;植株表现出较强的杂种优势,株高大于双亲,产生大量的分枝,角果数远多于双亲。杂种后代花器官发育正常,可育花粉为99%以上,且自交结实率较高。花粉母细胞减数分裂比较正常,95%的花粉母细胞在终变期所有染色体进行同源配对,形成10个二价体,减数第二次分裂中期有部分出现染色体落后现象。杂种后代极强的杂种优势和较好的自交结实性为进一步选育具有优良特性的新型白菜型油菜提供了可能。     

Plant Regeneration from Hypocotyl Protoplast of Brassica campestris

以大白菜成青２号为材料,从萌发５天的无菌苗下胚轴分离原生质体,然后以附加８．２％葡萄糖,０．４ｍｇ／Ｌ２,４－Ｄ,０．４ｍｇ／ＬＮＡＡ和０．５ｍｇ／Ｌ６－ＢＡ的改良ＫＭ８ｐ液体培养基进行浅层培养．培养１３天后,用含５．２％葡萄糖的ＫＭ８ｐ培养基以１∶１进行稀释．４～６周后,再生细胞分裂并形成愈伤组织,直径约０．４～０．５ｍｍ的愈伤组织经ＭＳ培养基（附加２％蔗糖,０．８％的琼脂,１．５ｍｇ／Ｌ６－ＢＡ,０．５ｍｇ／ＬＮＡＡ和０．２ｍｇ／Ｌ２,４－Ｄ）诱导植株分化．５９％的愈伤组织可分化形成芽,分化的芽经诱导生根发育成完整的植株．０．８ｍｇ／ＬＩＢＡ和４００ｍｇ／Ｌ的羧苄青霉素对分化再生有促进作用．