牛白细胞介素-2在毕赤酵母中的表达

将编码牛白细胞介素-2(BoIL2)成熟肽的cDNA克隆到巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体pPICZB中，构建出含BoIL2基因的重组质粒BoIL2-pPICZB。将经Sac Ⅰ酶切后线性化的BoIL2-pPICZB电转化到巴斯德毕赤酵母X-33中，转化子经高浓度Zeoein抗性筛选鉴定后，用1％甲醇诱导目的蛋白表达。经SDS-PAGE及Western blotting检测，表明BoIL2在酵母中获得了胞内表达；通过金属螯合亲和层析(MCAC)获得纯化的重组蛋白；培养小鼠CTLL2细胞进行活性检测，证实所表达的重组BoIL2具有生物活性。     

猪IL-2基因真核表达载体的构建及在酵母中的表达

用真核表达引物从pGEM-IL-2重组质粒中扩增出猪IL-2基因，将目的基因和真核表达载体pPIC9K连接转入E．coli的JM109中，得到了猪pPIC9K-IL-2重组表达质粒。通过电激法将经SalⅠ酶切线性化的pPIC9K-IL-2质粒转化到巴斯德毕赤酵母GS115感受态细胞中，利用甲醇诱导表达，经SDS-PAGE电泳分析，表明在摇床水平及发酵罐中均表达出约17ku大小的分泌性目的蛋白，采用Sephadex G-100分子筛层析对其表达产物进行纯化，纯化结果理想。     

猪白细胞介素2基因的克隆和酵母表达

以伴刀豆球蛋白A（ConA）诱导的猪外周血淋巴细胞中提取的总RNA为模板,采用RT-PCR技术扩增出约500 bp的DNA片段,对阳性克隆进行测序与分析。结果：所克隆的基因与GenBank上公布的猪白细胞介素2（PoIL-2）基因的同源性为100%,表明试验成功获得了PoIL-2基因的全序列克隆;以该重组质粒为模板进行PCR,扩增出PoIL-2成熟蛋白的基因片段,连接真核表达载体pPICZαA,成功地构建了重组PoIL-2成熟蛋白基因的真核表达载体pPICZαA-PoIL-2;电转化pPICZαA-PoIL-2于巴斯德毕赤酵母X-33,诱导表达后进行表达产物的SDS-PAGE鉴定,结果表明试验成功地建立了重组PoIL-2的酵母表达系统。     

毕赤酵母(Pichia pastoris )分泌表达牛白细胞介素2

利用舍有强启动子PAOX1和α-因子信号肽序列的巴斯德毕赤酵母载体pPICZαA，构建出舍牛白细胞介素2(BoIL-2)基因的重组质粒BoIL2-pPICZαA。线性化的重组表达栽体转化到巴斯德毕赤酵母X-33及KM71H中，筛选Zeoein高抗性酵母菌株，甲醇诱导目的蛋白表达。经SDS-PAGE和Western blot检测表明，BoIL-2以融合蛋白形式在胞内表达，但没能分泌到胞外。通过BoIL-2在巴斯德毕赤酵母中的表达，重点讨论了信号肽、基因的偏爱性等对外源基因分泌表达的影响。     

猪白细胞介素-2在甲醇酵母中的表达

将猪白细胞介素-2(pIL-2)的完整cDNA序列克隆到甲醇酵母(Pichiapastoris)表达载体pPIC3 5K中,在E.coli体系中鉴定得到阳性克隆子pPIC3 5K-IL2。将pPIC3 5K-IL2经SacI线性化后,转化入经LiC1致敏的P.PastorisGS115菌株中,得到的重组菌株经1%浓度甲醇诱导后,利用SDS-PAGE电泳,斑点杂交及去糖基化酶消化证实,在培养上清中获得了分泌型表达的猪白细胞介素-2(蛋白分子量约为20KD),其表达量可达到80mg/L。用CTLL-2细胞进行活性检测,生物学活性可达2×106IU/ml。对其表达情况进行时间梯度分析,确定第5天表达量达到最高点,为最佳诱导时间;分析连续4个批次的重组菌株表达情况,结果表明重组菌株在适当菌体浓度下连续培养均能稳定、高效的表达外源蛋白pIL-2。本实验为进一步大规模生产pIL-2提供了理论依据。     

猪瘟病毒E2基因在毕赤酵母中的表达

猪瘟是严重危害养猪业的一种烈性传染病,病死率高,被世界动物卫生组织(OIE)列为必须报告的动物疫病。E2蛋白是猪瘟病毒中最主要的保护性抗原,因此,围绕E2的基因工程疫苗研究已成为热点。本研究以含有猪瘟E2基因的重组质粒pMD18-T-E2为模板,设计一对特异性引物扩增去除跨膜区的E2基因,将PCR产物插入巴斯德毕赤酵母表达载体pPICZαA中,构建重组质粒pPICZαA-E2,将该质粒用SacⅠ酶切线性化后,电穿孔导入巴斯德毕赤酵母X-33中,经Zeocin筛选得到高拷贝转化子,通过甲醇诱导表达、SDS-PAGE和Western bolt试验验证,结果表明E2蛋白在酵母中获得成功表达。     

荣昌猪白细胞介素-2基因的原核表达

应用DNA重组技术,将克隆的荣昌猪白细胞介素-2基因亚克隆到PET-32a( )表达载体上,构建重组表达载体。酶切鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21,用1 mM的HPTG诱导表达重组蛋白。RT-PCR方法检测表明白细胞介素-2基因得到了转录;对表达蛋白进行SDS-PAGE电泳,发现在相对分子质量约37 Ku处有明显的蛋白质条带,而对照组无相应条带产生。最后用MTT法检测表达蛋白的生物学活性,表明所获得的重组蛋白具有较好的生物学活性,这为利用该蛋白及其基因研制高效抗病免疫制剂和基因工程疫苗奠定了良好的基础。     

重组山羊FSH基因在毕赤酵母中的高效表达

为探讨快速高效表达山羊FSH（促卵泡素）基因的方法,将获得的FSHα,β亚基基因克隆到毕赤酵母快速表达载体pPICZαA中,然后将构建的载体线性化处理后,电击转化至毕赤酵母GS115中,经Zeocin抗生素筛选后获得阳性菌落,经甲醇诱导表达后进行SDS-PAGE和Western–blot分析。结果表明：pPICZαA载...     

猪带绦虫未知基因SLC10在毕赤酵母中的表达

SLC10是以反式剪切引导序列为基础,通过RT-PCR从猪囊尾蚴中克隆到的一个未知基因。将猪囊尾蚴SLC10基因从重组克隆载体pGEM-SLC10扩增并酶切后,与相应酶切处理的毕赤酵母分泌性表达载体pPIC9K相连接,构建重组表达载体pPIC9K-SLC10,转化大肠杆菌JM109,经PCR、酶切和测序鉴定,基因序列完全正确。纯化的重组质粒pPIC9K—SLC10用内切酶Sac I线性化,电转化毕赤酵母,使重组表达载体与酵母染色体发生同源整合;采用G418抗性梯度法筛选多拷贝重组菌株,用甲醇进行诱导表达;通过SDS-PAGE和Western—blot分析表达产物,结果表明目的蛋白得到了表达,但不具有免疫反应性。     

林麝白介素-2在毕赤酵母中的表达

克隆林麝（Moschus．berezovskii）白介素-2（interleukin．2，IL-2）到酵母表达载体pPIC9K，SalⅠ酶切后转化毕赤酵母GS115，G418抗性筛选高拷贝克隆，再由酵母菌落PCR鉴定；阳性克隆用甲醇诱导表达，SDS-PAGE分析．结果在诱导至第6d的酵母上清浓缩液中，检测到与预测林麝IL-2分子量相接近的，分子量约为18Ku的诱导表达带；TRIzol提取表达期间的酵母总RNA，并通过RT-PCR扩增IL-2 mRNA，发现表达期的重组酵母细胞中存在IL-2 mRNA，而对照没有检出，表明林麝IL-2存在低水平的表达。     

犬细小病毒结构蛋白VP2基因的克隆和在毕赤酵母中表达

表达犬细小病毒VP2蛋白（CPV—VP2）,用于重组蛋白免疫小鼠制备单克隆抗体,并为犬细小病毒病的诊断奠定基础。采用PCR方法对CPVVP2基因进行扩增,将CPVVP2基因克隆到毕赤酵母分泌表达载体pPICZAA中,构建真核重组表达载体pPICZAA-VP2,将该重组质粒线性化后,转化巴斯德毕赤酵母（Pichiapastoris）X-33中,甲醇诱导表达CPVVP2,SDs_PAGE和Westernblotting鉴定表达蛋白。结果,成功扩增了CPV—VP2基因,构建了真核重组表达载体pPICZAA—VP2,在毕赤酵母菌中表达出约68000蛋白。Western—blotting鉴定表明,表达蛋白为目的蛋白VP2。表达菌株扩大表达体系于培养基中培养,上清液用70％过硫酸铵4℃沉淀浓缩,采用His选择镍-亲和层析柱分离纯化获得重组的酵母表达的带组氨酸标签的VP2蛋白,表达量约3mg／L。结果表明,在毕赤酵母中成功地表达了CPV—VP2蛋白,且能被犬细小病毒VP2单克隆抗体特异识别。     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌apxIA基因在毕赤酵母中的表达与分析

构建猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)apxIA基因的真核表达载体pPICZαA/apxI,并在毕赤酵母GS115中进行表达。SDS-PAGE显示仅在浓缩40倍的上清中检测得到表达产物,同时经RT-PCR可检测到重组酵母中编码目的基因成熟肽的mRNA,经分析发现目的序列AT含量高达62%,其中含49个毕赤酵母稀有密码子,占15.4%。证实ApxIA在毕赤酵母中为低水平表达。     

番鸭白细胞介素2基因的克隆及其原核表达

为原核表达番鸭白细胞介素2 (MdIL-2),本研究利用ConA刺激诱导番鸭脾淋巴细胞,采用RT-PCR技术扩增MdIL-2基因的编码序列,并将其克隆至pGEX-6P-1中,构建重组质粒pGEX-MdIL-2,转化E.coli BL21受体菌.测序结果表明,MdIL-2基因ORF全长420 bp,编码140个氨基酸.重组菌经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分析显示,重组蛋白约为40 ku.Western blot分析表明,重组蛋白能够被抗GST单克隆抗体特异性识别.MdIL-2基因的克隆及其原核表达为进一步进行MdIL-2的活性检测以及应用研究奠定了基础.     

猪IL-2基因在毕赤酵母中的高效表达及生物活性分析

本研究根据密码子偏爱原则设计猪IL-2引物,克隆其基因后构建pPIC9k-IL-2重组表达载体,线性化后电转化毕赤酵母GS115,获得优化密码子的重组酵母转化子;再用G418抗性梯度法筛选得到多拷贝重组菌株,不同条件下进行甲醇诱导表达。结果表明:经PCR鉴定IL-2基因已整合到酵母基因组中。表达产物经SDS-PAGE电泳分析发现相对分子质量为16、20ku两条目的蛋白表达带,脱糖基化分析表明目的蛋白得到了适度的糖基化修饰,Western blotting分析显示表达的蛋白具有良好的免疫反应性,分子筛纯化可以获得纯度为95%的蛋白质,淋巴细胞增殖活性分析表明所得的蛋白质具有促淋巴细胞增殖的活性。毕赤酵母表达系统可以高效地表达具有生物活性的重组猪IL-2蛋白分子。     

猪α干扰素基因在毕赤酵母中的分泌表达

将猪α干扰素(PoIFN-α)基因克隆入毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαA中,电转化毕赤酵母KM71H菌株,抗生素ZeocinTM浓度梯度筛选高抗性转化子,以PCR鉴定阳性重组菌株。筛选出的高拷贝重组菌株分别通过BMGY/BMMY培养基和YPG培养基,用甲醇诱导表达。SDS-PAGE和Westernblot印迹杂交结果证实,表达产物为重组PoIFN-α融合蛋白,经细胞毒性试验检测(WISH/VSV系统),表达产物的抗病毒活性为4.1×104IU/mL。