花生种子全长cDNA文库的构建和鉴定

以花生品种闽花5号各发育时期的种子为材料分离mRNA,利用SMART技术合成双链cDNA。利用限制性内切酶SfiⅠ酶切。将经过分级分离得到的cDNA连接到质粒载体pDNR-LIB,成功构建花生种子全长cDNA文库。将所得到初级文库扩增后进行保存,检测扩增文库滴度为1.7×109cfu/mL。PCR鉴定重组子,发现重组率接近100%,插入片段集中分布在0.5~2.0 kb。插入片段的平均大小在1000 bp左右,这说明该文库既可以满足低丰度基因的筛选,也可保证获得全长cDNA。     

花生蛴螬中肠组织cDNA文库的构建

利用Qiagen试剂盒提取花生害虫华北大黑鳃金龟幼虫蛴螬中肠总RNA,并纯化mRNA,然后按照Stratagene试剂盒合成双链cDNA,经过凝胶柱层析,收集符合要求的cDNA片段,加工后与Uni-ZAP XR Vector连接,经Gigapack Ⅲ Gold体外包装,即获得蛴螬的cDNA文库,未扩增文库滴度1.95×106pfu/mL,重组率为99.7%,扩增后文库滴度达1.34×109pfu/mL,插入cDNA片段的长度平均为1.34kb,表明成功构建了高质量的蛴螬中肠cDNA文库。     

应用SMART技术构建甘蔗叶片全长cDNA文库

以甘蔗（Saccharum officinarum Linn）为材料,利用SMART技术构建甘蔗叶片全长cDNA文库,从甘蔗叶片中提取总RNA并分离mRNA,用分离到的微量mRNA合成cDNA第1链,通过长距离PCR扩增得到足量的双链cDNA,同时比较了不同双链cDNA与载体的连接效率和转化效率。结果表明,所构建的甘蔗叶片cDNA文库库容和重组百分比分别是1．8×106个克隆和98．6％,插入片段长度主要集中在0．6-2．5kb,平均插入片段长度约为1．2kb。本研究为国内首次报道甘蔗全长cDNA文库,所构建的文库拥有较好的质量,为项目组进一步开展甘蔗功能基因组学研究提供了平台。     

低温诱导东乡野生稻幼苗期叶片cDNA文库的构建和鉴定

从8℃低温诱导的东乡野生稻幼叶中提取总RNA,以总RNA为模板,利用SMART技术合成第1链,再经LD-PCR扩增合成第2链后,将获得的双链cDNA与双元表达载体YPL3连接,重组质粒电转入大肠杆菌,成功构建了东乡野生稻cDNA文库。经测定,原始文库滴度平均为4.4×107cfu/mL,平均插入片段约1kb,重组率为100%,符合cDNA文库构建要求,为后续利用酵母功能互补技术筛选东乡野生稻有利基因奠定了基础。     

斑茅抗旱全长cDNA文库的构建

以干旱处理后的甘蔗近缘属植物斑茅为材料,采用SMART^TM方法,合成并富集ds cDNAs,然后通过电泳时分段切胶以分离不同大小片段并分别与载体连接和转化,构建了斑茅的抗旱全长cDNA文库,为进一步研究和利用斑茅中的抗旱基因奠定了基础。     

巴西橡胶树低温诱导全长cDNA文库构建

通过低温诱导处理巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)品系93-114幼嫩枝条和树叶,提取总RNA,并分离纯化mRNA.利用SMART技术合成橡胶树全长cDNA,经过Sfi I酶切后连接到pDNR-LIB载体中,得到全长cDNA文库.文库库容为1.4×106,重组率达到100%.挑取单菌落提取质粒并酶切鉴定,插入片断分布在0.3～2 kb之间,平均大小为1 kb左右,表明该文库质量合格,可用于全长基因的筛选.     

香蕉果实cDNA文库的构建

将从处于一定成熟度的香蕉果肉中纯化出的mRNA反转录成cDNA。cDNA纯化后与EcoRI转接头相连,并插入λgt10载体,经体外包装,侵染大肠杆菌C600hfl菌株,从而构建了香蕉果实的cDNA文库。     

苎麻茎皮cDNA文库的构建

以生长中期的苎麻茎皮为材料,提取总RNA,经纯化mRNA后,合成双链cDNA。双链cDNA加上EcoRI-SmaI接头后,用限制酶NotI酶切并除去小于400bp的短链cDNA,长的cDNA片段连接到EcoRI-NotI酶切载体pAP3neo上,获得滴度为2.6×104的苎麻cDNA文库,插入片段大部分分布在500bp～1500bp之间。该文库的建立为苎麻表皮功能性新基因的发现奠定了基础。     

苎麻茎皮cDNA文库的构建

以生长中期的苎麻茎皮为材料，提取总RNA，经纯化mRNA后，合成双链cDNA。双链cDNA加上EcoRI—SmaI接头后，用限制酶NotI酶切并除去小于400bp的短链cDNA，长的cDNA片段连接到EcoRI—NotI酶切载体pAP3neo上，获得滴度为2．6×10^4的苎麻cDNA文库，插入片段大部分分布在500bp-1500bp之间。该文库的建立为苎麻表皮功能性新基因的发现奠定了基础。     

利用改进的Oligo-Capping法构建甘蔗茎全长cDNA文库

Oligo-Capping法是目前全长cDNA文库构建的重要方法之一.笔者在引进、消化和吸收的基础上,通过对特异引物和接头序列的设计,及cDNA扩增反应条件的优化,对该方法进行了一些切实可行的改进,形成了一套简便易行的技术体系.利用本研究中改进的Oligo-Capping法,成功地构建了甘蔗茎全长cDNA文库.综合评价结果表明,本研究中所构建的甘蔗茎全长cDNA文库的库容大于2.5x106cfu,重组率为91%,全长率高达88.9%.本文库的构建为进一步甘蔗茎中全长基因的克隆和功能基因的表达分析奠定了基础.     

人参叶cDNA文库构建中的问题与对策

人参是传统中药的典型代表且具有很高的药用价值。作为一种广泛种植的中药材，它的次生代谢产物种类多，但目前关于人参有效成分如人参皂苷的生物合成途径及其调控的基础研究相对缺乏。本文以人参叶组织为材料，总结了构建人参叶cDNA文库过程中存在的一些关键问题和应采取的对策，为今后人参和其它药用植物的RNA提取、构建高质量的cDNA文库来保存珍贵基因资源、克隆和研究与有效成分合成相关的基因及EST文库等。提供技术参考和理论指导。     

外源ABA处理大麦胚的均一化cDNA文库的构建

构建外源ABA处理大麦胚的均一化cDNA文库是利用酵母双杂交方法筛选与靶蛋白相互作用蛋白的前提条件。为给大麦抗逆基因的研究及抗逆转基因大麦材料的创制奠定基础,利用5μmol·L-1ABA和蒸馏水分别处理大麦种子0h、6h、12h、24h,剥取大麦的胚,用热酚法提取总RNA,利用SMART原理进行反转录PCR并进行均一化处理获得ds-cDNA。经SfiⅠ酶切的ds-cDNA与pGADT7-Rec载体连接后,转化大肠杆菌感受态细胞DH10B构建文库。结果表明,文库的容量为1.1×106,插入片段大于1 000bp,集中在1 000~3 000bp之间,符合酵母双杂交文库的要求。     

强优势玉米杂交种雌穗均一化cDNA文库的构建与鉴定

以强优势玉米杂交种豫玉22发育时期的雌穗为材料构建cDNA文库,为进一步研究和分离杂种优势相关基因构建技术平台。选择玉米雌穗发育过程中的4个时期(生长锥伸长、小穗分化、小花分化和花丝始伸期)的雌穗组织分别构建了4个定向cDNA文库,依据基因组DNA饱和杂交的原理,将从4个独立的cDNA文库中提取的质粒混合,通过基因组DNA亲和体系饱和杂交,获得雌穗全发育时期均一化cDNA文库。该文库平均插入片段1.3kb,含有3×104个克隆。对文库中随机的150个克隆进行测序,81.6%的序列为非冗余序列,11.2%的序列含有两个或两个以上的拷贝,并且主要来自多基因家族转录本,说明此文库的均一化有效。对测序结果进行功能聚类分析,发现文库序列涉及水解酶、转移酶、核苷酸结合蛋白、蛋白激酶、转录因子等基因,涉及环境应答、蛋白代谢、物质转运、个体发育等多个生化途径,说明该均一化文库基因覆盖度较高。该文库还包含有大量的未知基因,有待进一步的发掘和研究。     

茉莉酸刺激的橡胶树胶乳cDNA消减文库的构建及其序列分析

采用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术,构建了外源茉莉酸刺激条件下橡胶树胶乳与未处理橡胶树胶乳差异表达的cDNA消减文库,经蓝白斑筛选共得到121个含有插入片段的阳性克隆。通过菌落PCR的方法分别对阳性克隆的插入片段进行扩增,结果表明,95％左右阳性克隆插入片段的大小在200-600 bp之间。随机选取25个克隆进行测序,并对所得的25条表达序列标签(EST)序列用Blastn(基本局域联配搜寻工具)检索基因文库(genbank),其中10条EST片断可找到碱基序列相似性大于80％以上的同源基因序列,其余15条EST为没有任何功能线索的未知序列。外源茉莉酸刺激条件下橡胶树胶乳cDNA消减文库的构建和在此基础上克隆橡胶树胶乳中JA信号的候选应激基因,将为开展茉莉酸调控橡胶树胶乳代谢和橡胶生物合成的分子机理研究打下基础。