猪高致病性蓝耳病毒与猪圆环病毒混合感染的诊治

2016年6月四川九寨沟某藏香猪养殖基地母猪出现体温升高到41℃、食欲不振、泌乳量降低、返情率升高、个别食欲废绝,仔猪出现高稽留热、精神萎靡、消瘦、眼睑水肿、呼吸困难(呈腹式呼吸)、腹泻等临床症状。剖解发现全身淋巴结肿大,肺呈弥漫性间质性肺炎,表面凹凸不平,部分坏死。遂采集患病猪病料,以四川农业大学动物生物技术中心建立的病原RT-PCR和PCR方法进行检测,初步诊断为猪高致病性蓝耳病毒和猪圆环病毒混合感染。结合临床实际采取一定措施治疗后,病情得到有效控制。     

高致病性猪蓝耳病与猪圆环病毒2型混合感染的诊断

2020年11月湖南省常德市某规模化猪场暴发了一场以仔猪呼吸困难、消瘦、皮肤发绀,并有大量死亡为特征的传染病.根据送检4头仔猪的剖检变化和实验室荧光定量PCR检测,最终确诊为高致病性猪蓝耳病、猪圆环病毒2型混合感染.经过治疗并采取严格的预防免疫措施,该猪场的发病率得到有效控制.     

一例猪瘟、高致病性猪蓝耳病、猪伪狂犬病混合感染的实验室诊断

对南充市某猪场的一起疫情进行确诊,采集病死仔猪的病料进行实验室检查。PCR结果显示猪瘟病毒、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪伪狂犬病毒均为阳性。试验结果表明,该猪场疫情是由CSFV、PRRSV和PRV混合感染所致。     

高致病性猪蓝耳病和猪瘟混合感染的诊断探讨

在肉猪养殖中,混合感染是需要重点防范的问题类型.在本文中,将就高致病性猪蓝耳病和猪瘟混合感染诊断进行一定的研究.     

高致病性猪蓝耳病和猪圆环病毒Ⅱ型病混合感染的诊断

重庆市一区县猪场2012年9月送来一头发病猪的病料,根据畜主叙述的临床症状及病理剖解变化,对此病料样品进行了高致病性猪蓝耳病病毒和猪圆环病毒Ⅱ型的检测。采用荧光PCR方法检测送检的肺脏、脾脏、肾脏、肝脏、淋巴结,结果在淋巴结中检出高致病性猪蓝耳病病毒;在脾脏和淋巴结中检出猪圆环病毒2型。     

高致病性猪蓝耳病的防控技术

笔者介绍了高致病性猪蓝耳病的发生、流行病学、临床症状以及危害,阐述了综合防控高致病性猪蓝耳病的措施。     

高致病性猪蓝耳病诊断及防控

1临床症状高致病性猪蓝耳病病毒属动脉炎病毒科动脉炎病毒属猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株。猪感染PRRSV到出现明显症状的时间为2～37d,     

高致病性猪蓝耳病的诊断与防治

针对高致病性猪蓝耳病的诊断与防治现状,笔者从高致病性猪蓝耳病流行病学角度分析,结合该病的临床症状与病理变化,试探性地提出几种预防与治疗措施,以供参考。     

高致病性猪蓝耳病的实验室诊断

采用猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2基因RT-PCR检测方法和猪繁殖与呼吸综合征病毒变异毒株试剂盒检测方法,对六盘水市钟山区某猪场发生的一起疑似高致病性猪蓝耳病进行实验室诊断,确诊为由猪繁殖与呼吸综合征病毒变异毒株引起的高致病性猪蓝耳病。     

一例高致病性蓝耳病病毒、圆环病毒2型和副猪嗜血杆菌混合感染的诊断

目前,猪场疫病混合感染的现象普遍存在,给我国养猪业造成了巨大损失。2013年10月,广西省某集约化猪场约6周龄猪群发生以高热、皮肤发绀、呼吸困难、关节炎为主要特征的传染病。根据发病情况、临床症状、剖检变化并结合实验室诊断方法进行综合诊断,最终结果显示,导致该猪场大规模发病并死亡的主要病原包括高致病性猪蓝耳病病毒、猪圆环病毒2型和副猪嗜血杆菌,是典型的混合感染导致大规模发病及死亡的案例。     

新生仔猪大批死亡疫情诊断及HP-PRRSV的分离鉴定

本试验通过对高发病率、高死亡率的新生仔猪腹泻病例进行诊断与控制,以期为该病的防控提供参考和借鉴.2013年1月初广西玉林某规模猪场发生以2~3日龄仔猪腹泻、呕吐、精神不振为主的疫情,发病率80%,死亡率80%~100%.为确定此次疫病的病因,本研究从发病猪群中采集10 份病死猪小肠、脾脏、肺脏、淋巴结等组织进行细菌分离、PCR检测、病毒分离、病毒效价(TCID₅₀)测定、基因测序与分析.检测结果显示猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)均为阳性,猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(PRoV)均为阴性,未分离到致病菌.克隆测序分离株的ORF7和Nsp2全基因序列,结果显示分离株为美洲型PRRSV,ORF7基因全长为372 bp,编码123个氨基酸;Nsp2基因全长为2 850 bp,编码950个氨基酸,其中Nsp2基因在第481、532—560位发生了共30个氨基酸的不连续缺失,与高致病性PRRSV(HP-PRRSV) JXA1株Nsp2基因缺失特征一致,属于HP-PRRSV分离株.匀浆病料接种Marc-145 细胞,48 h开始出现 PRRSV 特征性病变,TCID₅₀为10^-5.75/0.1 mL.推测此次新生仔猪大批死亡主要是PEDV感染后继发高致病性猪繁殖与呼吸综合征所致.     

Diagnosis of a Large Number of Death Cases of Newborn Piglets and Isolation and Identification of HP-PRRSV

The assay was aimed to provide theoretical references for the prevention and control of newborn piglet epidemic diarrhea which was characteristic of high morbidity and mortality.An outbreak of newborn piglet epidemic featuring diarrhea,emesis and lassitude was reported in January 2013 in a large-scale pig farm in Yulin,Guangxi province.The morbidity and mortality in the epidemic were 80% and 80% to 100%,respectively.To identify the causes,ten samples of small intestines,spleens,lungs and lymph glands were collected for the bacterial isolation,PCR,virus isolation,determination of TCID₅₀,gene sequencing and analysis.The detection results showed that PEDV and PRRSV were positive while those of CSFV,PRV,TGEV and PRoV were negative.No pathogenic bacteria were isolated.Clone and sequence results of ORF7 and Nsp2 genes of the isolate indicated that the isolate was an American PRRSV,with ORF7 of 372 bp (123 amino acids) and Nsp2 of 2 850 bp (950 amino acids).There was a discontinuous deletion of 30 amino acids of Nsp2 gene at sites 481 and 532 to 560,which was consistent with Nsp2 of highly pathogenic PRRSV JXA1,so the isolate could be determined as a HP-PRRSV strain.48 h after Marc-145 cells being inoculated by pathological sample,the typical CPE of PRRSV appeared,and TCID₅₀ of PRRSV isolate was 10^-5.75/0.1 mL.The newborn piglet epidemic diarrhea was caused by PEDV infection and HP-PRRSV subsequent infection.     

表达猪流行性腹泻病毒COE基因的重组乳酸菌的构建与鉴定

用疑似患猪流行性腹泻病（PED）的病猪肠病料,根据猪流行性腹泻病毒（PEDV）S糖蛋白基因设计引物进行RT-PCR扩增,获得531bp的PEDV部分保护性抗原基因,将其克隆入pMD18-T载体后测序,核苷酸序列与PEDVCV777株相应序列的同源性为99．4％。根据测序结果和表达载体特点,设计一对引物,扩增PEDV部分保护性抗原基因（COE基因）501bp片段。将COE基因与乳酸乳球菌表面表达载体pNZ8149进行连接,电击转化入食品级乳酸乳球菌NZ3900细胞。重组菌以1ng／mL乳链菌肽（Nisin）诱导,通过SDS-PAGE和Westernblot分析,PEDV部分S蛋白成功表达,并具有反应原性。间接免疫荧光试验表明,重组菌表达蛋白定位于菌体细胞表面。     

PEDV、TGEV、RV多重RT-PCR检测方法的建立与应用

为了快速准确诊断猪流行性腹泻病毒 (PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒 (TGEV)、猪轮状病毒(RV)引起的猪腹泻病,通过设计三对引物,建立了扩增PEDV、TGEV、RV的多重RT-PCR方法,用于临床上大量腹泻病料的鉴定。该方法特异敏感,能同时检测PEDV、TGEV、RV,而对猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型病毒、乙型脑炎病毒、猪细小病毒等无扩增,检测的抗原稀释极限为107。用于35个猪场120份临床样品的检测,PEDV阳性率占37.5%,TGEV阳性率占0.75%,RV阳性率占1.25%。PEDV阳性病料测序结果分析表明,与近几年分离毒株亲缘关系较近,与经典毒株和疫苗株亲缘关系较远。结果表明建立的多重PCR方法特异性强、敏感度高,能用于临床诊断及流行病学调查。     

应用生物反应器和微载体培养Vero细胞生产猪流行性腹泻病毒的研究

对应用生物反应器系统和微载体培养Vero细胞生产PEDV进行了实验研究,通过分析和比较批培养及换液培养过程中细胞生长、代谢和病毒增殖的相互关系,发现PEDV随着细胞的生长而不断在胞内增殖和积累,72h后Vero细胞需经过一个短暂的停止生长阶段,再继续呈指数生长。反应器换液培养的单位培养基细胞产量比批培养提高了28%,比方瓶培养提高了138%,疫苗生产效率显著提高。当接种密度为1 23×105cells/ml时,换液培养至96h时获得了1 74×106cells/ml的高细胞密度,细胞扩增了14 3倍,且单位细胞的病毒产量并不低于静态培养。     

PEDV COE基因重组乳酸菌在小鼠体内定植规律研究

选用pNZ8149-COE NZ3900重组乳酸菌作为绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）的表达载体,制成活菌制剂,口服免疫小鼠,以GFP基因作为标记跟踪重组菌在小鼠体内的定位,并利用荧光定量PCR技术对各部位菌定量分析。结果表明,研究构建的重组乳酸乳球菌PEDV-COE-GFP NZ3900可较长时间定植于胃肠黏膜表面,为基因工程重组乳酸菌口服疫苗的研究奠定了基础。     

猪流行性腹泻病毒(PEDV)M蛋白原核表达载体的构建

为消除M蛋白抑茵现象使其得到稳定表达,本试验采用两种策略:一是将M基因截短得到编码M蛋白膜外区的基因序列(M'),构建重组表达载体pGEX-6p-M';二是将M基因改造,在其N端和C端同时加上GST基因,即构建pGEX-6p-M-GST重组表达栽体.     

猪流行性腹泻病毒重组腺病毒疫苗的构建及小鼠免疫试验

通过RT-PCR和重组PCR技术扩增出猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)疫苗株sM、M、S基因,构建重组腺病毒穿梭质粒。穿梭质粒与BJ5183细菌同源重组构建同源重组腺病毒质粒,同源重组腺病毒质粒经Pac Ⅰ酶切后转染AD-293细胞,获得3个含有目的基因的重组腺病毒。将3个具有感染能力的复制缺陷性重组腺病毒共同感染Vero细胞,细胞上清液进行小鼠免疫特性研究。结果表明,共同感染Vero细胞所得蛋白能诱导小鼠产生特异性体液免疫应答。     

Identification of two dominant linear epitopes on the GP3 protein of highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus (HP-PRRSV)

Glycosylated protein 3 (GP3) of PRRSV is variable between different PRRSV strains, so it is helpful for subtype classifying by using distinct epitopes. In this study, two dominant linear GP3 epitopes that were recognized by highly dilute serum in an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) were identified. Sequence alignments of 36 North American (NA) PRRSV isolates revealed that the epitope H⁸⁷DELGFMV⁹⁴ is well conserved, whereas the epitope T⁵⁹RQAAAEILE⁶⁸ differs in other low-virulence NA-type strains, which have at least one amino acid mutation in this region. A mutational analysis revealed that none of these mutations could be recognized by the purified antibodies directed against the corresponding epitope, indicating that the genetic variations altered the antigenicity of the antigenic region. Using ELISA, we also found that antibodies directed against the two epitopes were present in more than 45 of 50 HP-PRRS-positive pig sera, suggesting that their antigenicity is excellent in vivo.