异育银鲫内参基因的筛选

内参基因在实时荧光定量PCR(qRT-PCR)中具有校准的作用,然而鲤疱疹病毒Ⅱ型感染异育银鲫内参基因目前仍未见研究报道。采用qRT-PCR技术检测不同处理条件下异育银鲫组织和尾鳍细胞GAPDH、EF-1α、18S rRNA和β-actin 4个候选内参基因在组织和尾鳍细胞的转录水平,利用软件geNorm、Norm Finder、Best Keeper和Delta Ct分析了其表达量的稳定性,以筛选出健康异育银鲫不同组织以及鲤疱疹病毒Ⅱ型感染的肾脏、脾脏和异育银鲫尾鳍细胞在不同时间均较稳定的内参基因。geNorm稳定值以及4个内参的表达量Ct值分析显示,健康异育银鲫脑、脾脏、肾脏、肌肉、鳃、肠、肝脏和心脏组织中β-actin和EF-1α都是比较稳定的内参基因;鲤疱疹病毒Ⅱ型感染肾脏和尾鳍细胞不同时间点,内参基因β-actin稳定性最佳;鲤疱疹病毒Ⅱ型感染脾脏不同时间点时,EF-1α稳定性最佳。分别以4个候选内参基因为内参分析PIN1基因在肾脏组织不同感染时间的相对表达量,结果进一步证实,PIN1基因在肾脏组织感染不同时间点以β-actin为内参时,其表达量呈下降趋势,与cDNA文库测序中的表达量分析结果一致,各时间点的表达量差异极显著(P<0.01)。本试验结果有利于研究异育银鲫在不同处理条件下基因的表达分析,可为获得精准的结果奠定理论基础。     

脊尾白虾GAPDH基因的克隆及其内参基因稳定性分析

为比较甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)、18S rRNA和β-actin基因在脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)作内参基因的优劣,本研究采用同源克隆和RACE技术,克隆了脊尾白虾GAPDH基因全长cDNA序列(GenBank登录号:KX893516),通过实时荧光定量PCR(quantative real-time PCR,qPT-PCR)技术,检测3种基因在脊尾白虾不同组织及不同蜕壳后时间点的表达量变化,在此基础上进行内参稳定性分析。结果显示,脊尾白虾GAPDH基因全长1514 bp,开放读码框1002 bp,编码333个氨基酸,二级结构预测显示GAPDH蛋白具有一个高度保守的NAD~+结合功能域(NAD binding domain)和行使糖运输和代谢的催化功能域。分析qRT-PCR结果并结合ge Norm、Norm Finder和Best Keeper 3种软件的分析发现,在不同组织和不同蜕壳后时间点,3种内参基因的稳定性由高到低依次为18S r RNA、GAPDH、β-actin。因此,在脊尾白虾不同组织和不同蜕壳后时间点的定量分析中,选取单内参基因时,推荐使用18S rRNA为内参基因,双内参时推荐18S rRNA和GAPDH,而18S rRNA、β-actin和GAPDH在其他生理条件下作内参基因的稳定性还有待进一步研究。     

青海湖裸鲤实时荧光定量PCR内参基因筛选与验证

为探明青海湖裸鲤候选内参基因在低温环境下的表达稳定性，根据RNA-seq定量结果筛选表达稳定的候选内参基因，利用实时荧光定量PCR检测候选基因在0℃和17℃下，脑、肝胰脏、肌肉组织中的表达量，并通过GeNorm、Norm Finder和Best Keeper 3种分析程序分析其表达稳定性，筛选出理想的内参基因。结果显示：根据RNA-seq定量结果，共筛选获得脱水酶(Abhd18)基因、微球蛋白(B2m)基因、延伸蛋白A(Eloa)基因、DAZ相关蛋白2(Dazap2)基因、肌动蛋白(Actb)基因、磷酸甘油醛脱氢酶(Gapdh)基因、BCL细胞死亡激动因子(Bad)基因和脂肪酸结合蛋白3(Fabp3)基因等8个候选基因；对上述基因的表达稳定性进行分析，发现表达最稳定的是B2m和Eloa基因，表达最不稳定的是Fabp3基因；利用B2m和Eloa基因作为双内参基因对4个脂肪酸代谢相关基因在0℃和17℃脑、肝胰脏、肌肉组织中的表达量进行校正，其相对表达比值与RNA-seq结果高度正相关。研究结果可为高原鱼类极端环境适应的研究提供候选内参基因。     

高光胁迫下坛紫菜定量PCR内参基因的筛选

为了筛选不同高光光强胁迫下坛紫菜中表达水平最为稳定的内参基因,本研究采用qRT-PCR技术测定了植物中常用的6种内参基因UBC、TUB、18S、EF2、ACT和GAPDH在不同光照强度下培养的坛紫菜藻体中的绝对表达水平,并采用比较Ct值法、Ge Norm、Bestkeeper和NormFinder软件分析4种方法对6种候选内参基因的表达稳定性进行评估。结果显示,UBC的Ct值变化范围最小,18S的Ct值变化范围最大;ge Norm软件分析结果显示最稳定的内参基因为UBC和EF2;Bestkeeper和NormFinder软件分析结果类似,UBC基因的稳定值M均为最低值(分别为0.044和0.80),说明其表达水平最稳定。研究表明,UBC基因可以作为不同光照条件下坛紫菜基因表达qRT-PCR分析的最适内参基因。     

菲律宾蛤仔不同发育时期及成体不同组织中内参基因筛选

为筛选出菲律宾蛤仔17个发育时期及成体7个组织中的最适内参基因,实验采用3个内参基因筛选方法ge Norm、Norm Finder及ΔCt对菲律宾蛤仔不同发育时期和成体不同组织中的12个候选内参基因延伸因子1α基因(EF1A)、TATA盒结合蛋白基因(TBP)、组蛋白H3基因(HIS)、细胞色素b5基因(CYTB5)、泛素缀合酶基因(UCE)、核糖体蛋白L8基因(RPL8)、核糖体蛋白S23基因(RPS23)、核糖体蛋白L2基因(RPL2)、细胞色素C基因(CYTC)、生长因子受体结合蛋白2基因(GFRP2)、肌动蛋白基因(ACT)和微管蛋白基因(TUB)进行表达稳定性分析。结果显示,菲律宾蛤仔不同发育时期q RT-PCR分析需要3个内参基因,分别为CYTC、CYTB5和RPS23;菲律宾蛤仔成体不同组织q RT-PCR分析需要2个内参基因,分别为CYTB5和GFRP2。ACT在菲律宾蛤仔不同发育阶段和不同组织中表达最不稳定。     

拟穴青蟹不同发育时期胚胎基因表达的内参基因的筛选

为获得适用于研究拟穴青蟹(Scylla paramamosain)不同发育时期胚胎基因表达的内参基因,本研究采用3个内参基因筛选软件geNorm、NormFinder及BestKeeper对微管蛋白α1A(Tuba1a)、核糖体蛋白L13(Rpl13)、泛素(UBQ)、核糖体蛋白S6激酶(Rps6)、精氨酸激酶(Ak)、3-磷酸甘油脱氢酶(gapdh)、28S核糖体RNA(28S)、18S核糖体RNA(18S)和延伸因子1A基因(EF-1α)等9个常用候选内参基因在拟穴青蟹不同发育时期胚胎的表达稳定性进行分析。geNorm分析表明, EF-1α和Rpl13的表达稳定性最高,并且采用2个内参基因同时校正目标基因的定量结果可以达到最优效果; NormFinder分析表明, gapdh和EF-1α是9个候选内参基因中表达最稳定的; BestKeeper分析表明,gapdh的标准偏差和变异系数是9个候选基因中最低的。综合3个内参基因筛选软件,可以选用EF-1α,或选用EF-1α和gapdh双内参同时校正拟穴青蟹不同胚胎发育时期各基因的表达情况。     

17α, 20β 双羟孕酮诱导鲤卵母细胞最终成熟相关基因表达内参基 因的筛选

本研究检测了18S rRNA(18S)、28S rRNA(28S)、组织蛋白酶Z(cathepsin Z,CTSZ)、延伸因子1-α(elongationfactor 1-α,EF-1α)、3-磷酸甘油脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,gapdh)、β肌动蛋白(β-actin)6个候选内参基因在17α,2β双羟孕酮(DHP)诱导鲤(Cyprinus carpio)卵母细胞最终成熟过程的表达情况,并应用不同的内参分析软件对数据进行了分析.Bestkeeper软件分析表明EF-1α的变异系数和标准差是6个候选内参基因中最低的,且Bestkeeper指数在6个候选内参基因中最高,说明其表达稳定性最高,适合做为内参基因;geNorm软件分析认为需要同时使用EF-1α和CTSZ两个内参基因来校正目标基因的表达;NormFinder软件分析同样表明EF-1α是6个候选内参基因中表达最稳定的;最后通过RefFinder软件综合比较分析,确定EF-1α相对于其他5个候选内参基因,在17α,20β双羟孕酮诱导卵母细胞最终成熟阶段表达最为稳定,可作为内参校正17α,20β双羟孕酮诱导鲤卵母细胞最终成熟阶段各基因的表达情况.     

中华虎头蟹线粒体16S rRNA和 COⅠ基因的序列比较及其系统进化分析

为研究中华虎头蟹野生群体的种质资源及遗传多样性状况,采用PCR扩增获得中华虎头蟹线粒体DNA的16S rRNA和COⅠ基因片段,分别对其进行序列比较及系统进化分析。16S rRNA和COⅠ基因片段的A+T平均含量分别为67.7%和61.4%,A+T含量显著高于G+C含量。长度为515 bp的16S rRNA基因片段共检测出单倍型4种,多态性位点4个,均为单一变异位点;长度为653 bp的COⅠ基因片段共检测出单倍型11种,多态性位点23个,其中简约信息位点5个和单一变异位点18个。COⅠ基因片段比16S rRNA基因片段具有较大的变异,更适于中华虎头蟹种群的遗传多样性分析。基于16S rRNA和COⅠ基因片段的遗传距离与系统进化分析结果一致,表明中华虎头蟹与梭子蟹科的蟹类亲缘关系最近,方蟹科与沙蟹科的蟹类聚为一支,与传统分类结果基本一致;而脊椎动物2个基因片段的系统进化分析结果不一致。根据16S rRNA基因片段的遗传距离推测出4科7种蟹的大致分化时间发生在古新世至始新世。     

基于DNA条形码对浙南岛屿日本花棘石鳖的遗传特征分析

采用COⅠ、16S rRNA两种分子标记对中国浙江南部沿海岛屿岩相潮间带日本花棘石鳖(Liolophura japonica)13个群体遗传特征和亲缘关系进行了探讨。结果显示:COⅠ基因片段长度为675 bp,16S rRNA基因长度为517 bp,A+T比例分别为62.5%和64.9%。COⅠ基因总多态位点数为41个,单倍型多样性指数0.847,核苷酸多态性指数为0.006 01,平均核苷酸差异数为4.057 8;16S rRNA基因的总多态位点数为9个,单倍型多样性指数0.665,核苷酸多态性指数为0.001 69,平均核苷酸差异数为0.871 2。以Acanthopleura brevispinosa和A.granulata为外群构建了ML和BI系统发育树,其拓扑结构显示,基于COⅠ基因的日本花棘石鳖形成2个分支;基于16S rRNA基因的日本花棘石鳖群体仅聚合为一支。不同地理群体单倍型散乱分布,没有出现明显的地理结构和遗传谱系结构,表明各岛屿的日本花棘石鳖为近期分化并存在基因交流。     

达氏鲟实时荧光定量PCR内参基因的筛选

实时荧光定量PCR（qRT-PCR）是基因表达研究的常用方法,筛选达氏鲟（肌动蛋白（）、18S核糖体RNA（）共7个常用内参基因作为候选基因,利用geNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder 4个软件分析这7个候选基因在达氏鲟成鱼不同组织和不同发育时期胚胎及性腺的表达稳定性。结果表明,7个候选内参基因的定量PCR引物均可获得特异性扩增产物和理想的扩增效率。在成鱼不同组织中,候选内参基因稳定性由高到低的顺序为18S rRNA > > GAPDH > -actin > ;在不同发育时期卵巢中,候选内参基因稳定性由高到低的顺序为 > ,而不同发育卵巢最稳定表达的内参基因是。本研究旨在为今后达氏鲟不同组织、不同发育时期胚胎及性腺的基因表达差异研究提供理论基础。     

三倍体虹鳟实时荧光定量PCR内参基因稳定性分析

采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法比较甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapdh)、核糖体大亚基蛋白基因(rplp2)、真核延伸因子基因(ef1-α)、β-肌动蛋白(β-actin)和18S核糖体核酸基因(18S rRNA)等5个候选内参基因在体质量约800 g三倍体虹鳟脑、眼、鳃、皮肤、心脏、肾脏(头肾、中肾、后肾...     

Evaluation of housekeeping genes as references for quantitative real-time PCR analysis of gene expression in the murrel <Emphasis Type="Italic">Channa striatus</Emphasis> under high-temperature stress

Quantitative real-time polymerase chain reaction is the most advanced method of quantifying gene expression studies; however, the significance of the obtained results strongly depends on the normalization of the data to compensate for differences between the samples. In the present study, expression analysis of six different constitutively expressed genes viz. 18S ribosomal RNA, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (gapdh), beta actin (βactin), ribosomal binding protein L13, tubulin and TATA-box-binding protein (tbp) were carried out to test their efficacy as reference genes in three different tissues, namely liver, gill and muscle of murrel Channa striatus exposed to high temperature for variable time periods. The stability and suitability of the genes were determined by using bioinformatic tools: GeNorm, NormFinder and BestKeeper. Based on the results, tub/βactin could be used as the reference genes for liver and gill tissues and βactin/gapdh could be the reference genes for muscle tissues in Channa striatus under both short- and long-term thermal stress.     

基于COI和16S rRNA的库页岛马珂蛤遗传多样性和分子系统进化研究

本研究以库页岛马珂蛤(Pseudocardium sachalinense)为研究对象,讨论COI和16S rRNA两种DNA条形码在贝类的遗传多样性、分子进化和种类鉴定的适用性,并利用两种条形码评估库页岛马珂蛤的遗传多样性。本文在获得库页岛马珂蛤线粒体全基因组的基础上,测序获得库页岛马珂蛤群体的COI和16S rRNA序列,发现COI基因核苷酸多样性为0.00195,高于16S rRNA核苷酸多样性(0.00073)。基于COI基因的单倍型多样性为0.76,大于16S rRNA的单倍型多样性(0.318)。其次,用全线粒体基因组构建8种贝类的系统进化树为参考,发现基于COI和16S rRNA的系统进化树与参考一致,提示这两种条形码片段可用于推断贝类的分子进化关系。最后,分别对马珂蛤科和帘蛤科15属17种贝类的COI基因和16Sr DNA进行序列比较,发现COI基因和16S rRNA的种间遗传距离均是种内距离的62倍。以上结果说明,16S rRNA与COI基因一样,能有效地构建马珂蛤科和帘蛤科的系统发育关系和物种鉴定,但在分析库页岛马珂蛤的遗传多样性时利用COI基因比16S rRNA能发现更多的遗传变异。     

罗非鱼海豚链球菌16S rRNA基因的序列测定和系统进化分析

为了从分子水平上对1株致病性罗非鱼链球菌进行分类学鉴定,利用原核生物16SrRNA基因通用引物对分离纯化的罗非鱼致病性链球菌进行16S rRNA基因的克隆及序列分析。结果扩增出长约1.5 kp目的片段,测序得到1条长度为1 447 bp核苷酸序列。核苷酸相似性分析表明,序列与NCB I公布的海豚链球菌(Streptococcus iniae,S.iniae)SCCF5L菌株16SrRNA基因核苷酸序列相似性最高(99.4%),暂称为中国广西株(S.iniae-CGX)。同时,亲源关系较近的S.iniae、S.difficilis和S.agalactiae代表菌株构建的系统发育进化树显示,所得菌株与S.iniae代表菌株组成同一进化分支,与S.agalactiae代表菌株组成的另一进化分支距离较近(95.5%),而与S.difficilis代表菌株组成的进化分支距离较远(92.3%)。上述研究证实,本试验从发病罗非鱼脑组织分离到的致病性链球菌为海豚链球菌。     

不同DNA条形码基因在帘蛤目贝类分类鉴定中的比较分析

DNA条形码基因已经广泛应用在海洋贝类的分类鉴定、系统发育进化、种群遗传分析等领域的研究。为进一步研究评估不同DNA条形码基因在海洋贝类鉴定中的作用,本研究利用从Gen Bank数据库随机下载的帘蛤目COI、16S r RNA、18S r RNA和28S r RNA基因序列,通过传统距离法和单系聚类法结合分析,比较了上述DNA条形码基因在鉴定物种及系统发育进化中的鉴定效率,并以本实验室已获得的部分贝类DNA序列进行了验证。结果表明,根据"10倍法则"和"2%"阈值标准,本研究中COI能够鉴定57.1%物种,16S r RNA能够鉴定60.9%,18S r RNA鉴定16.7%,而28S r RNA无法有效鉴定;多数种COI和16S r RNA基因序列的种间遗传距离和种内遗传距离存在"条形码间隙",而18S r RNA和28S r RNA序列的种间和种内的遗传距离存在显著重叠,没有明显"条形码间隙";聚类分析结果表明,基于COI基因序列,87.9%的个体与同种聚为单系,以16S r RNA序列,65.6%的个体与同种聚为单系,未聚成单系的个体则形成姐妹系,未出现不同种聚为单系现象,能够呈现与形态分类基本一致的系统发生关系;但18S r RNA和28S r RNA呈现的聚类关系相对混乱。相对而言,在鉴定帘蛤目物种时,COI和16S r RNA都能够作为条形码基因,且COI有效性更高,18S r RNA和28S r RNA基因由于种内变异较大,不适于作为条码基因。研究结果为科学选用DNA条形码基因进行帘蛤目贝类的鉴定提供了参考资料。     

内参基因在虾夷扇贝定量PCR中表达稳定性的比较

应用实时荧光定量技术,检测虾夷扇贝的β-actin、Glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogen-ase、α-tubulin、Cytochrome b5、TATA box binding protein-associated factor、Elongation factor 1α共6个内参基因在饥饿胁迫下各组织、致病菌感染前后和水环境升温前后不同时间段血样中的mRNA表达情况。经geNorm程序统计分析,6个内参基因在上述处理中的表达稳定性存在差异,导致不同处理中适用的内参基因有所不同。为进一步开展虾夷扇贝基因表达的定量研究奠定了基础。     

Natural co‐infection of cultured Nile tilapia Oreochromis niloticus with Aeromonas hydrophila and Gyrodactylus cichlidarum experiencing high mortality during summer

Aeromonas hydrophila and Gyrodactylus cichlidarum are common pathogens that induce significant economic losses in farm‐reared Nile tilapia. Nowadays, the sudden appearance of fish mortalities was exaggerated due to mixed and multiple infections. During summer 2016, mass mortality among earthen pond‐farmed Nile tilapia was reported. Clinico‐pathological, bacteriological and parasitological examinations have been demonstrated. As well, the water quality parameters were assessed. The clinical and histopathological findings of the moribund and recently dead fish were characterized by generalized septicaemic signs. The water quality parameters were significantly elevated over the permissible levels, whereas there was an elevation in nitrite (0.04 mg/L), un‐ionized ammonia (0.8 mg/L), hydrogen sulphide levels (153.1 mg/L) and organic matter content (3.79 mg/L). A. hydrophila was identified based on phenotypic characterization, API 20E features and the homology of 16S rRNA gene sequence analysis. In addition, PCR data confirmed the presence of aerolysin (aerA) and haemolysin (hly) genes in the identified A. hydrophila isolates. Gene sequencing and phylogenetic analysis based on 16S rRNA sequence confirmed that A. hydrophila H/A (accession No. MN726928) of the present study displayed 98%–99% identity with the 16S rRNA gene of A. hydrophila. Furthermore, the monogenetic trematode, G. cichlidarum was identified in the wet mounts from the skin and gills of the examined fish with a high infestation rate. In this context, it was reported that the synergistic co‐infection of A. hydrophila and G. cichlidarum with deteriorated water quality parameters could induce exaggerated fish mortalities during hot weather.