特利波契巴尔通体基因敲除体系的建立

本研究旨在建立基于同源重组技术的特利波契巴尔通体基因敲除方法。研究通过扩增并融合Ⅳ型分泌系统VirB4基因的上下游同源片段,将同源片段与pJM05质粒进行体外拼接,并将pJM05-ΔVirB4质粒转化进入S17-1大肠杆菌中;通过双亲接合转移将大肠杆菌S17-1中的pJM05-ΔVirB4质粒转移到特利波契巴尔通体中进行同源臂交换,产生单交换菌株;随后利用质粒中sacB基因表达产物分解蔗糖对自身产生毒性作用,在蔗糖平板中筛选出22个双交换菌株,通过菌落PCR及测序验证,共确定出6个VirB4基因框内缺失菌株;并且测序结果表明这6个菌株在VirB4基因框内缺失了2 136 bp。     

一种改良的猪圆环病毒2型荧光定量PCR检测方法的建立

[目的]利用SYBR Green Ⅰ荧光染料建立一种快速、灵敏的用于检测猪圆环病毒2型的荧光定量PCR方法.[方法]根据猪圆环病毒2型ORF2保守区的基因片段,扩增目的基因645 bp插入至PUC57载体,以重组质粒为模板进行荧光定量PCR反应条件优化及灵敏度、特异性等验证.[结果]建立的猪圆环病毒2型绝对定量检测方法与猪圆环病毒1型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒、猪博卡病毒无交叉反应.检测猪圆环病毒2型的灵敏度是5.0×101 copies/μL,建立的标准曲线回归方程的相关系数0.999,扩增效率105.403％.[结论]成功建立一种特异性强、敏感性高、稳定性良好的绝对定量检测猪圆环病毒2型的荧光定量PCR方法,可以用于临床样品猪圆环病毒2型的检测.     

猪链球菌9型荧光定量PCR检测方法的建立及应用

【目的】建立猪链球菌9型(SS9)的快速诊断和定量分析方法。【方法】根据GenBank已登录的SS9cps9H基因保守部分序列设计合成引物和TaqMan荧光探针,建立了SS9的TaqMan荧光定量PCR检测方法(Taq-Man FQ-PCR),并进行了敏感性、特异性和重复性试验;利用所建立的检测方法对河南省11例疑似猪链球菌临床样品进行了应用检测,并与常规PCR方法进行了对比。【结果】成功建立了SS9的FQ-PCR检测方法和定量标准曲线,FQ-PCR方法的检测灵敏度可达1.0拷贝/μL,特异性高且重复性良好;利用该方法对11份临床疑似猪链球菌感染组织病料进行的应用检测表明,其中有3份样品为阳性,与常规PCR方法检测的阳性符合率为100%。【结论】成功建立的SS9 FQ-PCR诊断方法,可用于临床SS9型病菌感染的快速诊断及样品中细菌含量的定量分析。     

水稻细菌性条斑病菌的实时荧光PCR检测技术研究

 水稻细菌性条斑病是我国水稻上的检疫性病害之一。设计并筛选出特异性引物对Xoc2071F/Xoc2071R(Xoc2071),其扩增片段大小为329bp,利用SYBR GreenI荧光定量PCR方法进行水稻细菌性条斑菌的实时荧光PCR检测。结果表明,引物对Xoc2071能特异性检测到目标病原菌产生荧光信号而其他菌种不产生荧光信号。检测的灵敏度是2.25fg/μL质粒DNA和1.0×102cfu/mL的菌悬液,相当于1个细菌的基因,比常规PCR电泳检测的灵敏度高约100倍。此实时荧光PCR可以检测到仅需10g的带菌种子上目标菌的存在。     

大米和米制品Bt63转基因检测PCR方法的灵敏度研究

采用普通PCR法和荧光定量PCR法对Bt63转基因大米的检测灵敏度进行对比研究。根据大米内源蔗糖磷酸合成酶基因SPS和结构特异性基因Btc的基因序列,选用特异性的引物和探针进行研究,经验证试验表明具有专一性,能用于品系鉴定。在灵敏度试验中,阳性转基因大米按照不同质量百分比进行梯度稀释,提取DNA进行PCR扩增。结果表明,普通PCR检测的灵敏度在0.1%左右,而荧光定量PCR检测的灵敏度为0.01%,是普通PCR检测的10倍以上。应用两种方法对实际样品进行检测,都得到了较明显的内源SPS基因的扩增,而Btc基因都是阴性。荧光定量PCR方法避免了电泳检测的步骤,具有更高的安全性和简便性,因此日常检测中,利用荧光定量PCR技术检测Bt63转基因大米及其产品是一种快速、灵敏和准确的检测手段。     

非洲猪瘟病毒荧光定量PCR的建立及4种检测试剂盒的比较

为评估目前常用商品化非洲猪瘟荧光定量PCR检测试剂盒,参考OIE推荐的非洲猪瘟病毒(ASFV)荧光定量PCR方法合成引物和探针,建立非洲猪瘟病毒qPCR检测方法(OIE-qPCR);并与市面4种ASFV检测试剂盒进行了比较.以人工合成的ASFV p72基因TA克隆重组质粒为阳性标准品,OIE-qPCR可以检测到10～1...     

血清4型禽腺病毒TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立快速检测血清4型禽腺病毒病(Fowl aviadenovirus serotype 4,FAdV-4)的基于TaqMan探针的Quantitative real-time PCR(qPCR)检测方法,本研究根据Hexon基因序列,设计相关的qPCR特异性引物和探针,经特异性、敏感性和重复性试验以及反应程序等系列优化后,最终建立荧光定量检测方法并应用于临床样品的病原检测。FAdV-4的qPCR结果表明,优化后标准曲线决定系数(R²)为0.998,扩增效率(E)为95.226%,该方法效果良好。利用该方法,除FAdV-4外其他禽类常见病原均未检测到,该方法具有良好的特异性。该qPCR方法检出阳性的最低拷贝数为100个拷贝,而普通PCR方法检出阳性的最低拷贝数为10 000个拷贝,说明其具有良好的灵敏度。组内和组间变异系数均≤0.22%,该方法的重复性较高。对180份从江苏、安徽、江西和广西等省份采集的临床疑似样品进行检测,结果显示,qPCR方法检出率为51.1%,而普通PCR方法检出率为32.8%;同时基于qPCR引物的检出符合率为100.00%,而基于普通PC...     

鹦鹉热衣原体real-time quantitative PCR检测方法的研究

[目的]为鹦鹉热衣原体的快速、准确检测奠定基础。[方法]根据鹦鹉热衣原体主要外膜蛋白(MOMP)基因序列设计一对特异性引物,以SYBR GreenⅠ为荧光染料,建立了鹦鹉热衣原体Real-time quantitative PCR检测方法。根据检测结果,计算样品的批内和批间变异系数(CV)。[结果]以提取的鹦鹉热衣原体DNA为模板,用引物Cps-1和Cps-2进行PCR扩增,得到长100 bp的片段。扩增产物回收纯化后,连接到pGEM-T Easy载体上并转化到大肠杆菌DH5α,菌落PCR检测筛选阳性克隆,培养后提取质粒DNA。当模板浓度范围为1.78×102~1.78×108拷贝/μl时,标准曲线相关系数达0.998;批内和批间变异系数(CV%)分别为1.30%~4.59%和5.72%~9.87%。[结论]为鹦鹉热衣原体的感染、流行调查等提供了重要的技术参考。     

猪LFA-1和CTLA-4实时荧光定量PCR检测方法的建立

摘要：【研究目的】建立猪LFA-1和CTLA-4实时荧光定量PCR检测方法。【方法】根据GenBank中核苷酸序列设计猪淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)和细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)的特异性引物,经RT-PCR扩增、目的片段与载体连接转化以及重组质粒的鉴定,并对重组质粒标准品和样品cDNA进行检测,构建LFA-1和CTLA-4荧光定量RT-PCR标准曲线。【结果】以1×109~1×102拷贝/μL不同稀释水平的标准品进行荧光定量PCR扩增后,统计学分析显示标准品浓度的对数与Ct值之间存在良好的线性关系（LFA-1：RSq =0.992;CTLA-4：RSq =0.994）;样品检测显示LFA-1与CTLA-4引物的扩增曲线图和熔解曲线图的特异性。【结论】所构建的质粒标准品具有线性关系好、重复性好、敏感性高等特点,以及其引物在样品检测中的可应用性,为分析猪免疫细胞在感染病毒前后LFA-1和CTLA-4表达的变化以及评估猪体免疫功能,提供必要的技术平台。     

猪圆环病毒2型荧光定量PCR检测试剂盒原材料研究

通过对比3家公司生产的Taq酶、PCR反应缓冲液和UDG酶,对已建立的猪圆环病毒2型(PCV2)荧光定量PCR检测试剂盒中阳性参考品、最低检测限参考品、精密性参考品和阴性参考品进行制备.结果表明:Takara宝生物工程(上海)有限公司生产的Taq酶、PCR反应缓冲液和上海博彩生物科技有限公司生产的UDG酶的试剂组合扩增...     

贝类折光马尔太虫荧光定量PCR检测方法的建立(英文)

[目的]建立贝类折光马尔太虫荧光定量PCR检测方法。[方法]根据基因库中折光马尔太虫的基因保守序列,设计合成了一对引物和一条TaqMan探针,建立检测折光马尔太虫的荧光定量PCR方法,将建立的荧光定量PCR检测方法与常规PCR检测对比。[结果]所建立的荧光定量PCR方法灵敏度可达40个拷贝/μl,比常规PCR灵敏度高100倍,对派琴虫、单孢子虫、嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、河弧菌和拟态弧菌等病原体的检测结果为阴性。[结论]研究建立的折光马尔太虫荧光定量PCR方法具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床上折光马尔太虫感染的检测。     

关于甘肃省粮食流通体制改革的调查研究

通过典型调查,从宏观层面和微观层面深入地分析了全省粮食流通体制改革的现状和进展情况．指出现行粮食流通体制本质上仍然没有摆脱“大锅饭”的模式,长期积累的一些深层次矛盾和新形势下粮食购、销、调、存各环节中出现的新问题,到了非改不可的时候了。并提出粮改必须以科技为支撑、加强仓储设施建设、切实按保护价收购农民手中的余粮等措施。     

应用Taqman荧光定量PCR快速检测宠物食品中的沙门氏菌

[目的]建立快速检测宠物食品中沙门氏菌(Salmonella)的荧光定量PCR方法。[方法]根据Genbank中登录的沙门氏菌吸附和侵袭上皮细胞表面蛋白invA基因序列设计合成引物和探针,检测该方法的特异性和敏感性。[结果]该方法具有良好的特异性,对沙门氏菌的检测灵敏度可达到17 CFU/反应(25μl/反应)。应用该方法检测人工污染宠物食品,样品经18 h增菌后,结果均为阳性。[结论]该研究建立的Taqman荧光定量PCR方法可以快速、准确地检测宠物食品中的沙门氏菌。     

Taqman探针实时定量PCR检测猪伪狂犬病毒

选取猪伪狂犬病毒(PRV)基因组中gE基因,设计特异性引物和Taqman探针,利用实时定量PCR来定量检测PRV.利用PCR技术扩增猪伪狂犬病毒gE基因80 bp片段,并克隆到pMD18-T载体上,阳性重组质粒命名为pgE80.pgE80质粒进行10倍系列稀释,作为荧光PCR检测的标准模板,定量拷贝数,并绘制标准曲线.以提取的PRV、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒(PRRSV)和传染性胃肠炎病毒(TGEV)的DNA作为模板,进行特异性检测.该实时定量PCR方法,标准曲线斜率为-0.37,R2=0.992,可以检测到20个拷贝数.PRV能被扩增出S型荧光曲线,而其它病毒均未能扩出.用PRV强毒肌肉注射仔猪,定量PCR比普通PCR更能灵敏而特异地检出呼吸道排毒和血液带毒.建立的实时定量PCR方法可用于临床样品快捷、准确、方便地检测.     

翡翠贻贝肾CYP4基因表达受多氯联苯影响的研究

[目的]了解多氯联苯(PCB)对翡翠贻贝肾中细胞色素P450第4亚族(CYP4)基因表达的影响。[方法]从野生翡翠贻贝cDNA中扩增得到了翡翠贻贝CYP4基因和β-actin基因的部分cDNA序列,并根据所得序列设计定量PCR引物,以β-actin为内参基因,以SYBRGreenI为荧光染料,利用荧光定量PCR对经PCB暴露处理后的翡翠贻贝肾中CYP4基因表达水平进行定量测定。[结果]PCB暴露处理对翡翠贻贝肾中CYP4基因的表达有明显的诱导作用,并且这种诱导作用对CYP4表达水平的影响与PCB暴露处理的时间以及浓度有相关性。[结论]该研究为CYP4基因作为生物大分子标记物在环境监测领域的应用提供了分子生物学水平的支持,同时为海水双壳类动物体内CYP4基因功能的研究提供了有益线索。     

实时荧光定量PCR检测转基因玉米Bt176测量不确定度分析

应用实时定量PCR方法测定样品中转基因玉米Bt176的含量,并从多个方面来分析测量的不确定度。结果显示,A类不确定度为0.0003,B类不确定度为0.0007,合成不确定度为0.001,有效自由度veff为272,包含概率P为95%,扩展不确定度U=0.002,测量结果为(0.8±0.2)%。不确定度评估结果表明,测量不确定度的主要来源是微量液体转移量的偏差。     

Application of droplet digital PCR in detection of seed-transmitted pathogen Acidovorax citrulli

Bacterial fruit blotch caused by Acidovorax citrulli is a serious threat to cucurbit industry worldwide. The pathogen is seed-transmitted, so seed detection to prevent distribution of contaminated seed is crucial in disease management. In this study, we adapted a quantitative real-time PCR (qPCR) assay to droplet digital PCR (ddPCR) format for A. citrulli detection by optimizing reaction conditions. The performance of ddPCR in detecting A. citrulli pure culture, DNA, infested watermelon/melon seed and commercial seed samples were compared with multiplex PCR, qPCR, and dilution plating method. The lowest concentrations detected (LCD) by ddPCR reached up to 2 fg DNA, and 10² CFU mL⁻¹ bacterial cells, which were ten times more sensitive than those of the qPCR. When testing artificially infested watermelon and melon seed, 0.1% infestation level was detectable using ddPCR and dilution plating method. The 26 positive samples were identified in 201 commercial seed samples through ddPCR, which was the highest positive number among all the methods. High detection sensitivity achieved by ddPCR demonstrated a promising technique for improving seed-transmitted pathogen detection threshold in the future.     

云南省十字花科蔬菜根肿病的实时荧光定量PCR检测

根肿病是十字花科蔬菜严重的土传病害之一。为快速和准确的检测根肿病菌在土壤中的含量,本研究利用实时荧光定量PCR技术,结合传统的生物学测定方法对云南省十字花科蔬菜基地22份土壤样品进行了检测。结果表明:土壤孢子数量和病情指数呈线性相关,随着土壤中根肿病孢子数量增加,生物学测定的病情指数也随之增加;所检测的土壤中孢子密度最高为110sup8.96 g-1,病情指数为95.56%,最低为1103.12 g-1,相应的病情指数为3.33%。该方法可以快速检测和定量土壤中病原菌,为种植十字花科蔬菜土壤的检测预报提供了有效的技术手段。     

利用qPCR技术检测柑橘溃疡病菌的灵敏度分析

以常规PCR为对照,分析了实时荧光定量PCR(q PCR)检测柑橘溃疡病菌DNA和柑橘溃疡病菌菌量的灵敏度,并对接种柑橘溃疡病菌后的冰糖橙样品进行了动态监测。结果显示,q PCR检测柑橘溃疡病菌DNA和柑橘溃疡病菌菌量的灵敏度比常规PCR高1~3个数量级,且常规PCR对柑橘溃疡病菌DNA的检测会受到寄主植物DNA的干扰,q PCR不受寄主植物DNA影响;对接种后冰糖橙样品的分析,q PCR即时就能检测到柑橘溃疡病菌,并能实时观察到柑橘溃疡病菌在寄主叶片的增殖情况,而常规PCR要接种后2 d才能检测到柑橘溃疡病菌。     

2个育性恢复基因Rf1a和Rf1b在红莲型水稻中的表达量分析

[目的]探究红莲型水稻细胞质雄性不育(CMS)与不同恢复基因之间的作用模式。[方法]利用特异性引物结合荧光定量PCR技术,在红莲型水稻近等恢复基因系L-Rf5、L-Rf6,恢复系9311和不育系粤泰A(YTA)中检测2个包台型恢复基因Rf1a和Rf1b的表达量。[结果]Rf1a在L-Rf5、L-Rf6、9311中都能表达,而Rf1b只能在部分材料或部分组织中表达。对同一时期二者的表达量分析发现,L-Rf5和9311的相同组织中Rf1a表达水平显著高于Rf1b,L-Rf6叶片中Rf1a的表达量则低于Rf1b。[结论]该研究结果对研究红莲型恢复系的遗传多样性具有一定的参考价值。