紫茎泽兰细胞质小热激蛋白HSP17.7基因的cDNA克隆与表达

利用RT-PCR和RACE-PCR技术,从热激处理的紫茎泽兰叶片总RNA中扩增出了细胞质小分子量热激蛋白(sHSP)全长683 bp的cDNA基因序列。在GeneBank上的登录号是EF105483。通过半定量分析,HSP17.7基因编码的热激蛋白在常温下有表达,且叶、茎中的表达量比根中的高;在热激(40℃)和冷处理(4℃)的情况下,根、茎、叶中的表达量均有增加。为研究基因在温度胁迫下的功能,将HSP17.7基因在大肠杆菌中表达。在细胞致死温度(50℃)下,HSP17.7能够改善细胞死亡的现象;4℃条件下,也得到相同结果。这些结果表明,HSP17.7可能在紫茎泽兰耐温度胁迫中发挥作用。     

紫茎泽兰细胞质小热激蛋白HSP17.7基因的cDNA克隆与表达

利用RT-PCR 和RACE-PCR 技术,从热激处理的紫茎泽兰叶片总RNA中扩增出了细胞质小分子量热激蛋白(sHSP)全长683 bp的cDNA基因序列。在GeneBank上的登录号是EF105483。通过半定量分析,HSP17.7基因编码的热激蛋白在常温下有表达,且叶、茎中的表达量比根中的高;在热激(40℃)和冷处理(4℃)的情况下,根、茎、叶中的表达量均有增加。为研究基因在温度胁迫下的功能,将HSP17.7基因在大肠杆菌中表达。在细胞致死温度(50℃)下,HSP17.7能够改善细胞死亡的现象;4℃条件下,也得到相同结果。这些结果表明,HSP17.7可能在紫茎泽兰耐温度胁迫中发挥作用。      

瓜实蝇热激蛋白基因hsp70的克隆及序列分析

[目的]克隆分析瓜实蝇热激蛋白hsp70基因序列特征,为进一步研究瓜实蝇的热适应性机制及制定综合防治策略奠定基础.[方法]根据NCBI数据库中已报道的昆虫hsp70基因保守序列,设计合成扩增瓜实蝇hsp70基因部分片段的简并引物,并利用RACE-PCR扩增其全长序列.[结果]克隆获得瓜实蝇hsp70基因cDNA全长序列(获取号:KM112021)2271 bp,含1911 bp的开放阅读框,编码636个氨基酸,具有真核生物hsp70基因家族的3个明显基序标签,同时在C-末端具有EEVD基序,推测其属于胞质型热激蛋白.BLAST分析结果表明该序列与双翅目实蝇科昆虫hsp70基因高度相似,最高相似度达91％.氨基酸序列系统发育分析结果显示,瓜实蝇与双翅目实蝇科昆虫聚类为一个分支,证实hsp70基因的高度保守.[结论]瓜实蝇hsp70基因具有真核生物hsp 70基因家族的特征,序列表现为高度的保守性,可作为今后研究瓜实蝇抗逆性机制的一个参数指标.     

腐烂茎线虫热激蛋白新基因的克隆与序列分析

热激蛋白90基因(heat shock protein 90 genes,hsp90s)是与生物发育、生物防御反应以及生物抗环境胁迫等相关的多功能基因.本试验以RT-PCR结合RACE方法从腐烂茎线虫Dhtylenchus destructor中克隆出1个hsp90,命名为Dd-hsp90-1,基因登录号为HQ9015...     

菊花脑热激蛋白70基因的克隆及表达分析

采用同源克隆结合RACE技术从菊花脑叶片中克隆菊花脑(Chrysanthemum nankingense)热激蛋白70基因(hsp70)的cDNA序列,并通过荧光定量PCR(qRT–PCR)分析菊花脑在40℃高温下热激不同时间(0、0.5、1、2、3、6 h)后叶片中hsp70基因的表达差异。结果表明,克隆的cDNA序列全长2 224 bp,与水母雪莲花、紫茎泽兰的hsp70基因在核苷酸和氨基酸水平的同源性分别为88%、98%,表明该序列为菊花脑的hsp70基因序列(GenBank登录号,KJ561911),命名为Cnhsp70。Cnhsp70基因的开放阅读框为1 944 bp,其编码的蛋白(647个氨基酸)的相对分子质量约为70 900,含有HSP70家族序列标签。qRT–PCR分析的结果表明,Cnhsp70基因的表达在热激后短时间内迅速上调,热激3 h达到最高,热激6 h时表达量迅速下调。     

蝴蝶兰热激蛋白基因PhHsp70序列分析及对冷胁迫的响应

通过RT-PCR和RACE相结合的方法从蝴蝶兰叶片中克隆了一个热激蛋白基因PhHsp70 c DNA序列(Gen Bank登录号为MG214259),该基因全长为2 239 bp,编码647个氨基酸,与多种植物的HSP70基因具有94%以上的相似性;其编码蛋白包含HSP70结构域,属于胞质型HSP70;系统进化分析显示,该蛋白与铁皮石斛的HSP70蛋白亲缘关系最近;PhHsp70基因在营养器官和生殖器官中均有表达,其中在根中表达水平最高,在花器官中表达水平较低;PhHsp70基因在4℃冷胁迫处理0.5 h表达水平下降,冷胁迫1 h后,表达水平升高,在处理24 h时表达水平最高。由此推测,PhHsp70基因参与蝴蝶兰4℃冷胁迫的生理反应。研究结果可为研究蝴蝶兰热激蛋白在低温胁迫响应中的调控机理提供理论基础。     

玉米热激蛋白70基因对温度胁迫的响应

利用RT-PCR技术从玉米自交系H21叶片中克隆获得一热激蛋白70(HSP70)基因的完整开放阅读框,全长1 737 bp,编码578个氨基酸,命名为ZmHSP70。编码的氨基酸与其他作物比对分析表明,ZmHSP70与高粱中一推测的蛋白(SbHSP70,XP_002465635)同源性最高,达95%,与水稻中一推测的蛋白(OsHSP70,EAY89062)同源性达87%。半定量RT-PCR的结果表明,该基因明显受42℃热激诱导表达,热激2 h其表达量达最大值;4℃冷胁迫也能诱导ZmHSP70表达量增加,冷胁迫4 h,其表达量达最大值。ZmHSP70是一个受温度诱导的热激蛋白。     

春尺蠖热激蛋白AcinHsp70基因的克隆、分子特性与表达分析

【目的】克隆春尺蠖热激蛋白Hsp70基因,分析其理化性质与表达情况,探究该基因在春尺蠖应对外界不利环境中的作用。【方法】基于前期所测转录组数据(春尺蠖幼虫不同低温胁迫),克隆获取Hsp70基因,命名为AcinHsp70(GenBank登录号：OP750249);利用生物信息分析软件对Hsp70基因的理化性质进行分析;采用qPCR技术检测AcinHsp70基因在不同温度(-10、-5、0、5和25℃)胁迫中回温与不回温及4℃不同时间处理下的表达谱。【结果】春尺蠖AcinHsp70基因完整CDS序列全长1899 bp,编码633个氨基酸,蛋白质预测分子量为69.91 kDa,预测等电点为5.51。在N端均不含信号肽且无跨膜区。磷酸位点检测分别发现丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸磷酸位点24、26和8个;未发现糖基化位点。该蛋白的平均亲水性为-0.507,预测不稳定系数为33.19,故该蛋白属于亲水稳定蛋白,亚细胞定位结果显示,其主要位于细胞质。序列一致性比对与系统进化树分析结果显示,春尺蠖与庆网蛱蝶(Melitaea cinxia)亲缘关系最近,序列一致性达92.91%。基因表达结果显示,不同温度(...     

大黄鱼热激蛋白cDNA克隆及系统发育分析

根据已报道的HSP基因序列（EMB登录号：AF506290），设计出特异引物，PCR扩增后测序，获得1．7kh大小的大黄鱼热激蛋白cDNA基因序列。HSP氨基酸序列的系统进化分析表明：不同物种编码的HSP存在一些明显相关的群体，高等动物编码的HSP在进化上紧密相关，形成一个显著群体，大黄鱼编码的HSP蛋白位于高等动物群体中，这与大黄鱼的亲缘关系大致吻合，其中与非洲爪蟾的同源性最高（92．3％），也间接印证了脊椎动物中两栖纲动物与鱼纲动物的亲源关系。通过大黄鱼HSP基因的提取和分析，可为以后制备出核酸探针、筛选和克隆出一批具有优良性状的基因、构建基因文库等研究工作奠定基础，同时对大黄鱼的品质改良和良种的选育有重要意义。     

大黄鱼热激蛋白cDNA克隆及系统发育分析

根据已报道的HSP基因序列（EMB登录号：AF506290）,设计出特异引物,PCR扩增后测序,获得1．7kh大小的大黄鱼热激蛋白cDNA基因序列。HSP氨基酸序列的系统进化分析表明：不同物种编码的HSP存在一些明显相关的群体,高等动物编码的HSP在进化上紧密相关,形成一个显著群体,大黄鱼编码的HSP蛋白位于高等动物群体中,这与大黄鱼的亲缘关系大致吻合,其中与非洲爪蟾的同源性最高（92．3％）,也间接印证了脊椎动物中两栖纲动物与鱼纲动物的亲源关系。通过大黄鱼HSP基因的提取和分析,可为以后制备出核酸探针、筛选和克隆出一批具有优良性状的基因、构建基因文库等研究工作奠定基础,同时对大黄鱼的品质改良和良种的选育有重要意义。     

5个品系罗非鱼热休克蛋白Hsp70基因序列比对分析

采用RT-PCR技术,对美国尼罗、埃及尼罗、美国奥利亚、中国奥利亚、奥尼杂交罗非鱼(埃及尼罗♀×美国奥利亚♂)5个品系罗非鱼热休克蛋白Hsp70基因进行扩增并克隆测序,最终获得5个品系罗非鱼Hsp70基因完整编码区(code sequences,CDS)cDNA序列,全长均为1923 bp,编码640个氨基酸,含有Hsp70家族3个签名序列IDLGTTYS、IFDLGGGTFD和VVLVGGSTRIPKIQK,以及C末端保守序列EEVD,核定位信号标签KRKHKKDISQNKRALRR;Dank特征基序DLGTT-S-V;胞质Hsp70特征基序EEVD;靠近C末端的GGMP4肽序列;2个糖基化位点NKSI和NVSA.对5个品系罗非鱼Hsp70基因序列比较分析发现,它们之间共有12个核苷酸位点发生转换,但氨基酸序列完全一致.研究结果为深入研究不同品系罗非鱼的抗逆机理以及指导罗非鱼抗性育种奠定了可行性支撑基础.     

绵羊肺炎支原体热休克蛋白Hsp70 C末端基因原核表达

为研究绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)热休克蛋白Hsp70抗原特性,以Mo贵州分离株为模板扩增得到Hsp70蛋白C末端基因,将目的基因连接至pET-28a原核表达载体,经PCR、双酶切和序列测定正确的阳性重组质粒转化E.coli Rosseta表达菌,IPTG诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE及Western blotting分析。结果显示,经PCR从Mo贵州分离株扩增获得567bp的C末端片段,并成功构建含Mo Hsp70蛋白C末端基因的原核表达质粒,经IPTG诱导表达获得分子质量约为27ku的目的蛋白,且目的蛋白能与Mo阳性血清印迹反应。说明,成功构建可有效表达Mo贵州分离株Hsp70蛋白C末端基因的原核表达载体。     

马铃薯甲虫热激蛋白基因Ld-hsp70的克隆及温度胁迫下的表达特性

[目的]热激蛋白(heat shock protein,HSP)是一种在生物体内广泛存在且高度保守的蛋白质,在生物抗逆过程中发挥重要作用.当生物体遭受不利环境条件胁迫时,其迅速产生可保证生物体的正常生理活动.本研究以重大检疫害虫马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata)为研究对象,对其热激蛋白HS...     

云南切梢小蠹热激蛋白40基因的克隆与序列分析

[目的]克隆云南切梢小蠹(Tomicus yunnanensis)热激蛋白40基因,并进行序列分析,得到该基因的特征。[方法]采用RACE克隆技术,获得云南切梢小蠹热激蛋白40基因,并对该基因进行分析。[结果]试验获得的基因序列长为1 205 bp,开放阅读框1173 bp,编码氨基酸序列390个,编码蛋白质的预测分子量为43.56 ku,等电点为7.35。该基因蛋白序列具有1个Amidation位点,2个天冬酰胺N末端糖基化位点,2个CAMP和CGMP依赖性蛋白激酶磷酸化位点,3个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,7个N末端十四烷基化位点,4个蛋白激酶C磷酸化位点,1个RGD细胞附着序列,1个DNAJ-1结构域等热激蛋白40所具有的典型特征。[结论]通过同源性比对分析发现,云南切梢小蠹热激蛋白40基因与家蚕(Bombyx mori)、赤拟谷盗(Tribolium castaneum)、美洲斑潜蝇(Liriomyza sativae)和东亚飞蝗(Locusta migratoria)的热激蛋白40基因在氨基酸水平上一致性为20%~30%,它们的相似性均不高。虽然不同昆虫Hsp40在进化过程中具有高度的保守性,编码序列变异比较低,但是结构域差异与生物体适应外界环境有一定的关系。     

真姬菇热激蛋白70(HmHSP70)的纯化

SDS-PAGE电泳分析显示,经过不同浓度梯度的IPTG诱导,获得了带有重组质粒pET32a-c(+)/HmH-SP70的大肠杆菌产生可溶性重组蛋白的最佳诱导条件。当IPTG的终浓度为0.15mmol/L时,诱导可溶性重组蛋白的量最高,重组蛋白浓度为22.5mg/ml。同时SDS-PAGE显示得到蛋白分子量约为90KDa的融合蛋白。并对诱导过程中产生的包涵体进行了变性和透析复性,使其变为可溶性蛋白;通过镍亲和层析的纯化以及肠激酶的酶切作用,最终得到纯度较高的HmHSP70,纯化后的目的蛋白分子质量约为70KDa,与预期结果吻合。     

6种模式生物热休克蛋白70家族的进化分析

[目的]研究柄海鞘和其他5个物种的热休克蛋白70家族的系统发育关系。[方法]通过在Ensembl中下载与筛选,获得柄海鞘和其他5种生物的热休克蛋白70家族的氨基酸序列,对其进行系统发育树和基因结构分析,并阐明其系统发育关系。[结果]经过筛选,共获得了来自线虫、果蝇、柄海鞘、斑马鱼、家鸡和人类6种生物的热休克蛋白70家族的33个氨基酸序列,其中25个具有明确的基因结构。系统发育分析表明,系统发育树并未完全按照来源物种聚类;6种生物热休克蛋白70的氨基酸序列相当保守,但其内含子插入位点并不整齐,表明热休克蛋白70家族是一个多基因、多结构的家族。[结论]这6个物种均发生了基因复制事件,新产生的基因仅仅是冗余的存在,还是具有新的功能,仍需作进一步的研究。     

白背飞虱HSP90全长cDNA的克隆与特性分析

利用同源克隆及RACE的方法,从白背飞虱Sogatella furcifera中克隆获得热激蛋白HSP90基因的全长cDNA序列(Genbank登录号:JQ743628),该基因全长为2 707bp,包含421bp的3′非编码区域(UTR)和93bp的5′UTR,开放阅读框(ORF)为2 193bp,编码730个氨基酸。该基因预测的蛋白分子量为83.85kD,等电点为4.94,无信号肽、糖基化位点及跨膜结构。在N端具有HSP90基因保守的ATPase结构,含有HSP90家族的C末端的保守序列MEEVD。从进化分析结果看出,白背飞虱的HSP90与其它昆虫的HSP90蛋白的同源性较高,与褐飞虱相比较,同源性高达98%。HSP90基因的克隆和比较分析为进一步深入研究白背飞虱的抗逆机理、耐受性及进化具有重要意义。     

杂交鲟和匙吻鲟HSP70 cDNA克隆与序列分析

采用RT-PCR法从杂交鲟(♀Huso huso×♂Acipenserschrencki)和匙吻鲟(Polyodonspathula)肝脏RNA克隆获得HSP70基因的全长cDNA(HSP70 cDNA)。所测定的HSP70 cDNA序列与NCBI/GenBank上登载的鲫(GenBank No.DQ872648)同源性最高,杂交鲟和匙吻鲟分别达96%和98%,杂交鲟HSP70序列为382 bp,匙吻鲟为334 bp。将杂交鲟和匙吻鲟与其它脊椎动物HSP70氨基酸序列用DNAstar软件进行相似度比较,鱼类与哺乳动物、两栖类非洲爪蟾之间HSP70氨基酸序列相似度平均值分别为86.2%和86.8%。鱼类之间的氨基酸序列相似度较大,平均为93.8%,表现出较高的保守性。以HSP70核苷酸序列为分子标记,用MEGA4软件中最大简约法(MP)构建了12个物种HSP70系统发育树,识别出3个大的单系类群:杂交鲟、匙吻鲟、团头鲂、鲫、鲤、斑马鱼聚为类群一(bootstrap 96);虹鳟和大西洋鲑聚为类群二(bootstrap 100);人类和褐家鼠类聚为类群三(bootstrap 89)。