J亚群禽白血病病毒与禽网状内皮增生症病毒共感染对肉鸡生长和免疫功能的抑制作用

1日龄肉鸡感染J亚群禽白血病病毒(ALV—J)以及共感染禽网状内皮增生症病毒(REV)后，肉鸡生长发育明显受阻，体重增重明显下降(P＜0．05)，法氏囊、胸腺明显萎缩(P＜0．05)，在用新城疫疫苗免疫后，感染组血清中新城疫抗体效价显著低于对照组(P＜0．05)；在ALV—J和REV共感染后，这种抑制作用更为明显(P＜0．01)。ALV—J单独感染后，鸡对传染性法氏囊病病毒(IBDV)弱毒疫苗免疫后的抗体反应与对照组没有明显差别，但ALV—J与REV的共感染可明显延缓鸡对IBDV弱毒疫苗免疫的抗体反应。     

从J亚群禽白血病肿瘤中检测出禽网状内皮组织增生症病毒

将表现为典型 J亚群禽白血病肿瘤的病料分别接种于鸡胚成纤维细胞和 DF1细胞 ,采用间接荧光抗体试验(IFA)和 PCR方法 ,从这些肿瘤病料中分离和鉴定出 8株 J亚群禽白血病病毒 (AL V- J)。对证明感染了 AL V- J的细胞继续培养 ,并用禽网状内皮组织增生症病毒 (REV)的特异性单抗及引物做 IFA和 PCR,在 8株 AL V- J中 ,有 3株AL V- J的感染细胞中同时有 REV感染。由此表明 ,发生肿瘤的肉鸡中 ,AL V- J和 REV的共感染已相当普遍。将这 3株 REV- SD0 0 0 3、SD0 0 0 4和 SD0 10 2的 3′- L TR用 PCR扩增、克隆和序列比较 ,发现分离的 SD0 0 0 3、SD0 0 0 4和SD0 10 2与国内的另外 2株 REV- SD990 1和 HA990 1的同源性为 96 .7%和 96 .1% ;而与另 1株 REV参考株鸭脾坏死性病毒 (SNV)的同源性高达 99%。     

鸡J亚群禽白血病病毒与七种常见病毒混合感染的调查

应用PCR方法对2009年6月到2009年9月来自不同地区、不同品种、不同日龄的45个疑似感染J亚群禽白血病病毒(ALV-J)的病鸡病料进行检测,同时对ALV-J与新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)、H9N2亚型禽流感病毒(H9N2 AIV)、包涵体肝炎病毒(IB-HV)、鸡传染性贫血病毒(CIAV)和呼肠病毒(REOV)等病毒的混合感染情况进行了调查。结果表明,采用ALV-J的特异性引物H5/H7,在45份送检病料中,有3份检出ALV-J,阳性率为6.67%。绝大多数病例检测出内源性禽白血病病毒,部分病例检测有其他7种病毒中的一种或几种。混合感染病例中以IBHV和IBV混合感染的比率较高,其中ALV-J与H9N2亚型AIV混合感染多见。     

J亚群禽白血病病毒与禽网状内皮增生症病毒共感染对肉鸡生长和免疫功能的抑制作用

1日龄网鸡感染J亚群禽白血病病毒(ALV-J)以及共感染禽网状内皮增生症病毒(REV)后,肉鸡生长发育明显受阻,体重增重明显下降(P＜0.05),法氏囊、胸腺明显萎缩(P＜0.05),在用新城疫疫苗免疫后,感染组血清中新城疫抗体效价显著低于对照组(P＜0.05);在ALV-J和REV共感染后,这种抑制作用更为明显(P＜0.01).ALV J单独感染后,鸡对传染性法氏囊病病毒(IBDV)弱毒疫苗免疫后的抗体反应与对照组没有明显差别,但ALV-J与REV的共感染可明显延缓鸡对IBDV弱毒疫苗免疫的抗体反应.     

鸡感染J亚群禽白血病病毒的免疫抑制机理

通过人工接种建立了雏鸡感染J亚群禽白血病病毒（ALV-J）后发生免疫抑制的病理模型。对免疫抑制的机理进行了初步研究。结果表明：ALV-J感染早期可诱导胸腺、法氏囊的淋巴细胞凋亡，这种早期的淋巴细胞凋亡是胸腺和法氏囊萎缩的重要原因之一。病理组织学动态观察表明。ALV-J主要引起骨髓的髓系细胞灶状或弥漫性增生，病变导致骨髓机能受损，使机体免疫机能下降。是引起免疫抑制的根本原因。病毒感染组免疫器官均发生了严重的实质萎缩性病变．这种病变的发生除与骨髓的病变及淋巴细胞凋亡有关外。还与中后期淋巴细胞的坏死有关．从而导致严重的免疫抑制。ALV-J感染可引起免疫器官及部分内脏器官中嗜酸性粒细胞样的瘤细胞浸润增生，这可以作为病毒感染早期的病理诊断指标。     

散养土鸡J亚群禽白血病病毒和网状内皮组织增生症病毒混合感染的诊断

湖北某农户散养的土鸡,鸡群精神委靡、整体消瘦,对病鸡进行剖检,发现部分鸡体表和脏器可见大小不等的肿瘤结节。取病变典型的组织制作病理切片,镜检可看到髓样细胞瘤和网状细胞。提取病鸡组织DNA,用两组Multi-PCR分别检测A、B、J亚群禽白血病病毒(ALV-A、ALV-B、ALV-J)和马立克病病毒(MDV)、禽网状内皮增生症病毒(REV)。结果仅扩增出与ALV-J和REV相应的条带,表明该鸡群为ALV-J和REV混合感染。     

蛋鸡中发现J亚群白血病与网状内皮增生症自然混合感染

发病蛋鸡经组织学、免疫组化检测确诊为J亚群白血病与网状内皮增生症混合感染。与人工接种病例不同的是，在肿瘤组织内还发现一种特殊的细胞——淋巴-巨噬细胞；在骨髓和肿瘤组织中检测到部分髓细胞胞浆内有ALV—J抗原表达。从发病情况、各器官病变程度及免疫组化结果来看，2种病原存在明显的相互协同作用，脾可能是网状内皮增生症的原发器官。但其发病的时间可能不如J亚群白血病早。此次在蛋种鸡发现此混合感染提示，病毒在环境选择压及免疫选择压的作用下，其生物特性、致病作用以及宿主范围均可发生改变。应警惕J亚群白血病和网状内皮增生症混合感染在蛋鸡中的大面积暴发。     

禽白血病病毒J亚群(ALV-J)免疫抑制特性研究

本研究人工接种1日龄及7日龄SPF雏鸡禽白血病病毒J亚群(ALV-J),模拟先天感染及早期感染,检测ALV-J不同感染时间对机体的影响。对感染鸡体质量、免疫器官质量、组织病理学、血细胞、CD4+及CD8+T淋巴细胞进行了检测。结果发现,ALV-J对免疫器官抑制显著,尤其是中枢免疫器官,1日龄感染组的抑制程度显著高于7日龄感染组。免疫器官的抑制是产生体质量抑制的根源。病理学观察发现,1日龄感染组中枢免疫器官淋巴细胞流失严重,间质结缔组织明显增生;而7日龄感染组在3周前表现为免疫细胞增殖,在3周以后淋巴细胞逐渐坏死流失,其他器官主要表现炎性浸润及出血,未见肿瘤增生灶。血细胞检测发现,ALV-J感染组粒细胞、淋巴细胞和红细胞均有下降,但对粒细胞的影响更加明显,1日龄感染鸡更为严重。对胸腺和脾脏CD4+及CD8+T淋巴细胞检测发现,CD4+细胞数量明显下降,而CD8+细胞数量明显升高,说明机体的免疫抑制和这两种细胞的变化高度相关。无论是1日龄还7日龄感染,均在4周龄时达到免疫抑制最低值,因此可以确定ALV-J感染在体内潜伏期约为3～4周的时间。ALV-J造成机体免疫力极其低下,为肿瘤的形成及混合感染创造了条件。     

血管瘤病变型J亚群禽白血病病毒E元件缺失突变体的构建

为构建血管瘤病变型J亚群禽白血病病毒E元件缺失突变体病毒,本研究利用融合PCR方法将E元件缺失,获得含有缺失性突变体病毒前病毒全基因组的重组质粒pSCAU-HN-△E。将该重组质粒纯化后转染DF-1细胞,并连续传代,最终获得缺失病毒rSCAU-HN-△E。该毒株感染的DF-1细胞可被ALV-J特异性单克隆抗体JE9所识别,并且体外增殖性能稳定。该缺失性病毒的获得为E元件功能的研究奠定了基础。     

J亚群白血病病理学观察及抗原定位

通过病理组织学和免疫组织化学技 术对1日龄感染鸡定期进行病理组织学观察 及gp85病毒糖蛋白检测,确定病理变化和J 亚群白血病的组织学嗜性及二者的关系。结 果在3周龄时出现第1只发病鸡,以后所有 鸡发病且病变随着日龄的增加而加重,主要 在骨髓、肝脏、脾脏、肾脏、卵巢、心肌等组织 中出现瘤细胞增生,并有炎性反应;免疫组在 3周龄时,肝脏、心脏、肺脏、小肠、肾脏、卵巢、 骨骼肌开始出现阳性反应,抗原主要在胞浆 中出现,呈深蓝色颗粒。在10周龄～14周龄 时,骨髓呈中度的阳性反应,而其它组织的阳 性信号出现的程度未见大的变化;在23周龄 时,肝内肿瘤呈较强阳性反应,信号主要集中 在细胞核;整个实验过程中,法氏囊、脑始终 呈阴性反应。研究发现,骨髓及肿瘤的抗原 性较强,并且肿瘤的抗原性要强于骨髓;另外 还发现,在阳性反应强的组织中,病变较明 显,肿瘤细胞增生明显,即阳性反应的组织器 官易形成肿瘤转移灶。     

J-亚群禽白血病JL-2株的分离鉴定

近年来，J-亚群禽自血病的暴发流行在国内时有报道，在本研究中，自吉林某患病鸡群分离出一株病毒，采用特异性引物，经RT-PCR扩增出长度为545bp的J-亚群禽自血病病毒特异性核苷酸片段；将病毒经SPF鸡胚成纤维细胞增殖，获取其前病毒DNA，依据原型毒株RPRS-103 cDNA序列设计并合成一对引物，经PCR扩增得到包括gp85、gp37、E-element基因在内的近1．8kb的DNA片段，将其连到pMD18-T载体上，转化大肠杆菌JM109，培养后提取质粒分别用Hind Ⅲ，BamHI进行单酶切和双酶切鉴定，得到了阳性重组质粒pMD18-T-JL2／env，核苷酸序列测定结果表明，该片段为J-亚群禽白血病病毒囊膜基因，其中亚型特异性片段gp85和标准对照毒株HPRS-103的同源率为94％，所编码氨基酸的同源率为87％。     

应用组织芯片免疫组化法检测ALV-J

禽白血病J亚群（ALV-J）是英国的Payne和他的同事们在20世纪90年代初从肉鸡中分离出来的新亚群，主要引起肉鸡的骨髓瘤白血病。自1999年，我国一些肉用型种鸡场陆续发生了禽白血病J亚群。并且近几年来，ALV-J已从最初只引起肉种鸡发病开始向蛋鸡及中国地方种鸡蔓延。组织芯片技术是一种新型特殊的生物芯片技术，它能明显提高工作效率，减少实验误差。本研究将组织芯片技术和免疫组化染色结合起来，用特异性抗ALV-J囊膜蛋白gp85的单克隆抗体来检测发病鸡只的各组织器官的组织切片。在肝脏、脾脏、肾脏、卵巢、腺胃、骨髓、髓细胞瘤组织均检出病毒阳性抗原。结果表明组织芯片技术和免疫组化染色相结合为临床诊断ALV-J提供了一个高通量、敏感的检测方法。     

J亚群与E亚群禽白血病自然重组病毒的全基因组序列分析

为了解我国东北地区部分养鸡场禽白血病病毒(ALV)的基因组序列特征及其变异情况,本研究从具有典型血管瘤病变的禽白血病发病鸡中分离到一株J亚群ALV(ALV-J)命名为JL0901,并进行了全基因测序.将该序列与已发表的ALV-J毒株序列进行比较研究,结果表明JL0901基因组的gag和pol基因相对保守,而env基因和3'端非编码区(3'UTR)的变异较大.对JL0901的env基因核苷酸序列进一步分析发现,在其gp85基因和gp37基因交界位置发生J亚群和E亚群ALV重组现象.本研究证实国内鸡群中存在J亚群和其他亚群ALV的自然重组现象,并表明国内ALV已出现新的变异趋势.     

血管瘤禽白血病病毒FJ0610株的分离与鉴定

为了解禽白血病病毒在商品蛋鸡中的流行情况,试验采用病理剖检、聚合酶链式反应(PCR)以及间接免疫荧光试验(IFA)等方法对送检的疑似禽白血病病毒感染的商品蛋鸡进行了病毒分离与鉴定,并对分离株的致瘤相关基因gp85基因进行测序,与国内外各亚群禽白血病病毒进行对比。结果表明:分离、鉴定到1株J亚群血管瘤禽白血病病毒,命名为FJ0610;分离株gp85基因核苷酸序列同源性在11.5%～94.5%之间,其中与血管瘤禽白血病毒株ZH-08株同源性最高,而与E亚群毒株同源性最低;基于gp85核苷酸序列的系统进化分析表明FJ0610株的gp85序列与ZH-08株的亲缘关系最近。     

禽淋巴细胞性白血病的诊断与病毒亚群鉴定

采用病理组织学方法对某商品蛋鸡场送检的发病鸡进行实验室诊断,在肿胀的肝、脾、肾和法氏囊组织切片中观察到成淋巴细胞增生病变。使用禽白血病A、B亚群抗体检测试剂盒对血清样本进行间接ELISA试验,抗体阳性率达到44.4%(12/27)。采集12只病死鸡的肝脏材料提取DNA样本,11份样本中扩增出ALV-A亚群特异性的病原核酸(691bp),检出率达到91.6%(11/12)。将扩增的目的基因克隆与测序,截取gp85基因片段可变区序列与ALV-A、B、C、D和E亚群参考毒株的相应序列进行比较,同源性分别达到89.0-89.6%、67.1-67.7%、69.1-70.1%、69.1-69.5%和70.9-72.0%。结果证实本次疫病是由ALV-A亚群病毒引起的淋巴细胞性白血病。     

J亚群禽白血病JL-2株gp85基因的克隆与表达

本实验在分离鉴定J亚群禽白血病JL-2株的基础上,利用PCR方法扩增出包括gp85基因在内的长度为960bp的DNA片段.将其连到PGEX-6p-1载体上,构建了重组表达质粒PGEX-6P-1/gp85,对质粒进行序列分析并在IPTG的诱导下进行表达.SDS-PAGE分析结果表明,融合蛋白(54 Ku)在BL21中得到有效表达.表达产物占菌体总蛋白的31.8%.Western Blot结果表明,表达产物可与ALV-J阳性血清发生特异性反应.这些结果为进一步研究gp85蛋白的功能及研制ALV-J ELISA诊断试剂盒奠定了基础.