基于转录组测序的铁皮石斛黄酮代谢途径及相关基因解析

【目的】分析铁皮石斛Dendrobium officinale黄酮类化合物的生物合成途径及相关基因,为铁皮石斛黄酮类化合物代谢调控、药用价值的开发研究提供参考。【方法】利用Illumina HiSeq 4000测序平台对铁皮石斛2个生长阶段茎、叶进行高通量转录组测序,对组装获得的unigenes进行功能注释和黄酮类化合物的生物合成相关基因解析。【结果】铁皮石斛黄酮类化合物代谢相关Unigenes 48个,涉及14个酶。5个CHS相关Unigenes具有CHSlike保守结构域,活性位点氨基酸残基(Cys-His-Asn)高度保守,丙二酰辅酶A结合位点和产物结合位点的部分氨基酸残基发生变异。CHI(Unigene0013781)属于类型I查尔酮异构酶,异构化6′-羟基查尔酮为5-羟基黄烷酮。表达分析表明,2个生长时期的茎和叶,CHS(Unigene0008250)、 CHI(Unigene0013781)和F3H的表达量都高于CHS(Unigene0012884)和C3′H。【结论】通过对转录组数据分析,共获得铁皮石斛黄酮类化合物代谢相关Unigenes48个,涉及14个酶;5个CHS相关Unigenes中,2个编码查尔酮合酶,3个编码联苄合酶;CHI(Unigene0013781)属于类型I查尔酮异构酶。     

当归转录因子AsMYB44的克隆与功能研究

为明确AsMYB44调控次生代谢产物生物合成的功能，从当归(Angelica sinensis)中分离克隆得到MYB转录因子AsMYB44,对AsMYB44进行生物信息学分析，利用根癌农杆菌介导的遗传转化体系在Samsun烟草中过表达，并对转基因烟草进行多组学联合分析。结果表明，AsMYB44基因CDS (coding sequence)全长903 bp,编码300个氨基酸，具有完整的SANT、MYB domains结构域。系统发育树结果表明，AsMYB44与拟南芥AtMYB11(AF062863.1)、AtMYB12(AF062864.1)和丹参SmMYB97(KF059561.1)同源性较高。AsMYB44转基因烟草中差异表达基因主要富集在苯丙烷合成代谢途径，其中苯丙氨酸解氨酶基因(PAL)、肉桂酸-4-羟化酶基因(C4H)、4-香豆酸：辅酶A连接酶基因(4CL)、咖啡酸3-O-甲基转移酶基因(COMT)、肉桂醇脱氢酶基因(CAD)等表达量上调。广泛靶向代谢组学结果显示，转基因烟草中酚酸、脂质、黄酮类化合物、生物碱等代谢产物含量变化显著。AsMYB44转录因子可正向调控酚酸的代谢合...     

利用转录组测序技术分析ADC和NOS基因mRNA在鹅等级前卵泡中的表达

为研究精氨酸代谢的关键酶精氨酸脱羧酶(Arginine Decarboxylase,ADC)和一氧化氮合酶(Nitric-oxide Synthase,NOS)mRNA在鹅等级前卵泡中的表达情况。采用高通量测序技术对鹅等级前卵泡进行转录组测序分析,并通过荧光定量PCR对结果进行验证。通过FPKM值计算分析,这2个基因在鹅等级前卵泡中均有表达,且随着卵泡的发育,NOS mRNA的表达呈现先降低后增加再降低的趋势,在初级卵泡中的表达量达到最高值,在中白卵泡中的表达量最低。ADC mRNA的表达则呈现先增加后降低再增加的趋势,在初级卵泡中的表达量最低,在小白卵泡中的表达量最高。荧光定量PCR结果与转录组测序结果基本相同。     

秋茄(Kandelia candel L.)响应重金属胁迫的数字基因表达谱

基于高通量测序的数字基因表达谱(DGE)技术,对重金属污水胁迫处理组和对照组秋茄材料进行转录组测序分析。结果表明,重金属污水胁迫处理样品与对照样品相比,共筛选出的3 097个差异表达基因,其中2 202个表达上调,895个表达下调。GO功能显著性富集分析出38个GO分类条目,大量与生长发育,代谢调控,环境刺激响应相关的基因表现为富集。进一步的KEGG代谢途径分析表明,差异表达基因主要与糖类、核酸、蛋白质和脂质等生物大分子代谢、能量代谢以及次生代谢过程有关。转录因子分析发现b HLH,MYB,NAC和WRKY在重金属胁迫中发挥重要作用。此外,重金属胁迫还促进萜类、黄酮类化合物生物合成的关键酶基因(牻牛儿基焦磷酸合酶(Unigene0029352)、黄酮醇合成酶(Unigene0010384))的表达,进而促进秋茄有效成分的积累;显著诱导细胞分裂素相关基因type-b响应调节子ARR2(Unigene0033740)的表达、抑制油菜素内酯的信号转导组分基因BSK(Unigene0008986)的表达,进而提高秋茄对重金属胁迫的适应能力。实验选取了5个与环境刺激响应密切相关的基因,通过qRT-PCR验证了它们在重金属污水胁迫处理下的表达差异,结果与数字基因表达谱分析的结果较为一致,证实了差异表达基因数据的有效性。说明在重金属胁迫处理下,秋茄通过调节基因表达提高自身对污染胁迫的耐受能力。     

海南油茶2个优良单株的比较转录组学分析

选取“万海1号”和“万海4号”2个海南产油茶 ( Camellia vietnamensis )优良单株为试验材料,采用新一代高通量Illumina转录组测序技术,对二者进行转录组测序分析,并进行差异比较。结果表明,“万海1号”的特异性基因中,有651条被注释到与植株抗病性相关的途径,约占5.26%,有510条被注释到脂肪酸代谢相关的途径,约占4.12%;“万海4号”中有169条特异性基因被注释到倍半萜和三萜生物合成、油菜素类固醇生物合成、类固醇生物合成和单萜类生物合成等植物次生代谢相关途径。2个样本的单拷贝同源基因多被富集到与抗氧化能力相关的GO条目,以及与氨基酸合成代谢相关的KEGG条目,且P值均小于0.05,显示出显著的相关性。本试验可进一步探究海南本地油茶的生理特性及代谢过程,作为海南本地油茶的优良品种选育的科学依据。     

萝卜根径发育候选基因的初步筛选

为了鉴定调控不同萝卜品种间根大小性状差异的关键基因,利用基于高通量测序的数字基因表达谱(DGE)技术,对2种根直径大小不同的圆球形萝卜‘扬州圆白’(直径大)和‘萨丁’(直径小)进行差异表达基因分析。测序共获得1 468个差异表达转录本。基于基因功能注释分析,共鉴定到参与细胞壁代谢相关的转录本28个,参与蔗糖代谢相关的转录本2个,参与激素合成与信号转导相关的转录本29个。利用RT-qPCR分析对6个细胞壁代谢相关基因的表达模式进行验证,其结果与测序结果基本一致。研究发现参与植物激素合成与激素信号转导相关基因(TIFYs、DELLA、 ERF2和 CYCD3)、蔗糖代谢相关基因( ATBETAFRUCT4和 HK3)和细胞壁代谢相关基因(XTHs、EXPs和COBs)可能是调控‘扬州圆白’和‘萨丁’萝卜根大小品种间差异的关键基因。     

利用iTRAQ技术和转录组筛选芍药属远缘杂交不亲和基因

【目的】远缘杂交育种是目前牡丹、芍药品种改良和育种的主要方法,而远缘杂交不亲和一直是制约其快速发展的主要因素。本研究从牡丹、芍药远缘杂交授粉后不亲和应答相关的柱头差异蛋白与转录组方面深入研究,揭示牡丹、芍药远缘杂交不亲和的分子机理,为杂交育种提供理论依据。【方法】以芍药‘粉玉奴’自交、芍药‘粉玉奴’与牡丹‘凤丹白’杂交为供试材料,在授粉后24 h采取柱头,分别进行同位素标记相对定量(iTRAQ)和转录组技术分析。对所获得的蛋白和转录组数据进行生物信息学分析,并对其中可能与远缘杂交不亲和相关的基因进行定量PCR验证。【结果】利用iTRAQ技术分析牡丹、芍药远缘杂交后柱头中蛋白质的表达差异,共鉴定到685个差异蛋白,富集到了188条通路,其中显著富集的Pathway有18条。与不亲和授粉相关代谢通路有RNA降解、钙信号途径、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase signaling pathway,MAPK)信号途径、磷脂酰肌醇信号系统。在RNA降解代谢通路中,烯醇酶(Enolase)、热休克蛋白DnaK(HSP70)及病菌抗原(GroEL)均表达下调。在钙信号途径中,钙调蛋白(CALM)表达下调,腺苷酸转运酶(adenine nucleotide translocase,ANT)表达量增加,表达上调。MAPK信号途径中,乙二醛酶Ⅰ(GloI)表达下调。磷脂酰肌醇信号系统中的钙调蛋白(CALM)表达下调。随机选取与差异蛋白相关的6个基因进行qRT-PCR验证,结果显示,6个基因的表达与蛋白质水平趋势相一致,均表达下调。通过转录组测序,共获得了52 998个有注释信息的Unigene,占所有Unigene的40.37%。基于6组样品的RPKM(Reads Per Kilobase per Million)值,共筛选到16 224个差异基因。其中上调基因13 361,下调基因2 863个。对差异基因进行Pathway显著富集分析,杂交与自交相比,不亲和差异表达的基因主要富集在氧化磷酸化代谢、ABC转运蛋白、次级代谢产物等通路。与远缘杂交不亲和相关且发生显著变化的基因有CalS-5、CalS-12(胼胝质酶)和SPL(squamosa promoter binding protein-like)表达上调,ABCF(ABC transporter family protein)表达下调。【结论】在转录组和蛋白数据共注释到6个蛋白、4个基因与植物不亲和性密切相关,这些蛋白与基因可能在远缘杂交不亲和方面发挥着重要作用。     

基于转录组测序分析牛不同脂肪组织的脂肪沉积差异研究

为了更好地了解肉牛(Bos taurus)的脂肪沉积机制，以安格斯牛（Aberdeen Angus）和西门塔尔牛（Simmental cattle）为模型，通过对2种脂肪组织（肾周脂肪和背皮下脂肪）进行RNA测序，确定转录组图谱。分析4个组织中共同的高表达基因，以及2个组织之间的差异表达基因。结果显示，每个样品获得约10.99 Gb数据，并注释总共23 472个基因。在50个高度表达的共同基因中，发现脂肪酸结合蛋白4（Fatty Acid Binding Protein4, FABP4），脂肪形成调节因子(Adipogenesis Regulatory Factor,ADIRF)和硬脂酰辅酶A去饱和酶(Stearoyl-CoA Desaturase,SCD)是与脂肪沉积相关的基因，表明这3个基因可能在脂肪沉积中发挥作用。在安格斯牛和西门塔尔牛的肾周脂肪与皮下脂肪组织之间分别鉴定出1 678个和1 955个差异表达基因。GO分析表明，一些DEG与代谢有关。KEGG途径分析显示，PPAR信号途径、甘油酯代谢和ECM-受体相互作用途径富集丰富。在背皮下脂肪中，PPAR信号途径和甘油脂代谢中的3个基因：视黄酸X受体α(retinoid X receptor alpha,RXRA)、C1q肿瘤坏死因子相关蛋白7(C1q and TNF related 7, C1QTNF7)和单酰甘油-O-酰基转移酶2(Monoacylglycerol O-acyltransferase 2, MOGAT2)上调；6个基因：肉碱脂酰转移酶1B(Carnitine Palmitoyltransferase 1B, CPT1B) 、解偶联蛋白1(Uncoupling Protein 1, UCP1)、 脂肪酸结合蛋白3(Fatty Acid Binding Protein 3, FABP3)、 脂肪酸转位酶(Fatty Acid Translocation enzyme, CD36) 、脂蛋白1( LPIN1) 和甘油-3-磷酸酰基转移酶3(Glycerol-3-phosphate Acyltransferase 3, GPAT3)表达量下调。在ECM-受体相互作用中，发现Ⅰ型胶原Α1(Collagen Type I alpha 1 Chain, COL1A1)、III型胶原Α1(Collagen Type III alpha 1 Chain, COL3A1) 、Ⅰ型胶原Α2(Collagen Type I alpha 2 Chain, COL1A2)和II型胶原Α1(Collagen Type II alpha 1 Chain, COL2A1)在牛的背皮下脂肪中上调，而层粘连蛋白γ3(Laminin Subunit gamma 3 , LAMC3) 和粘连蛋白γ2(Laminin Subunit gamma 2, LAMC2)的表达量下调。为验证转录组的准确性，对差异基因 COL1A1、 COL3A1、RXRA、 LPIN1和 GPAT3进行qPCR验证，结果显示qPCR结果与转录组测序数据基本一致。本研究揭示了肉牛不同脂肪组织中复杂的转录组图谱，发掘了参与脂肪沉积的候选基因。     

油菜长链酰基辅酶A合成酶基因(LACS4)的电子克隆和表达分析

长链酰基辅酶A合成酶 (LACSs)把游离脂肪酸活化成为酰基辅酶A硫脂,在油脂的合成和降解途径中发挥着重要的作用.通过电子克隆的方法,发现了1个油菜(Brassica napus)LACS基因.该基因长 2 270 bp,包含2 004 bp的开放阅读框,预测编码1个含有667个氨基酸残基的蛋白质,命名该蛋白为BnLACS4,序列分析显示,BnLACS4具有典型的LACS分子特征.表达分析显示BnLACS4在成熟油菜的根、茎、叶和花中都有表达.在授粉后(DAP)35 d, 不同含油量的角果皮和种子中,BnLACS4的表达也存在差异.表达谱说明,BnLACS4可能参与油脂的生物合成以及油菜种子中的油脂积累.     

基于转录组分析的SlCMT4基因敲除对番茄花器官的影响

[目的]DNA甲基化是由DNA甲基转移酶催化的重要表观遗传修饰,DNA甲基转移酶在植物发育、转录控制和代谢途径调控中具有重要作用。本研究旨在明确DNA甲基转移酶基因SlCMT4调控番茄花器官形成和发育的表观遗传机制。[方法]本研究以经典番茄栽培品种Ailsa Craig(AC++)为背景材料,采用CRISPR-Cas9基因编辑技术,获得SlCMT4突变株系。我们提取番茄花器官RNA,进行转录组测序,根据差异基因进行基因功能及代谢通路分析。[结果]研究了SlCMT4基因在野生型（AC++）和突变体番茄（Nr和Rin）不同果实发育阶段的表达模式,发现该基因在番茄成熟突变体Nr和Rin果实中的表达水平显著高于野生型番茄,表明SlCMT4基因的表达可能受激素乙烯信号和成熟相关转录因子RIN的负调控。SlCMT4基因敲除导致番茄花器官出现多种表型,包括雄蕊卷曲、雌蕊变粗变短等。我们在突变株系（CR-08）的花器官样品中鉴定了1398个差异表达基因（DEG）,其中512个上调,886个下调。差异表达基因的KEGG分析结果表明,大多数差异表达基因被归类为以下5条功能代谢通路：植物激素信号转导、苯丙烷...