传染性支气管炎病毒T株核衣壳蛋白（N）基因的克隆及部分序列分析

人工合成一双对应于ＩＢＶ－Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ株Ｎ基因ＯＲＦ两侧序列的引物,应用ＲＴ－ＰＣＲ方法,获得肾型传染性支气管炎病毒Ａｕｓｔｒａｌｉａ－Ｔ株核衣壳蛋白基因,长度１．２３ｋｂ,利用引物设计中的ＥｃｏＲ Ｉ位点将其克隆至载体ｐＳＫ（＋）中,对该基因进行限制性酶切分析。结果与已报道的相一致。通过Ｎ基因的Ｃ端部分序列分析及与Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ株、Ｍ４１标准株和日本分离株相比较,结果表明该部分的序列有     

油菜PEP基因的克隆及PEP反义基因的构建

丙酮酸羧化酶（ Ｐ Ｅ Ｐ）是控制油菜蛋白质／油脂含量比例的一个关键酶⒚本研究用 Ｐ Ｃ Ｒ 法扩增出了 Ｐ Ｅ Ｐ 基因片段,并将其 克隆到 ｐ Ｂ Ｓ Ｓ Ｋ＋ 的 Ｓｍ ａ Ⅰ位点⒚ Ｄ Ｎ Ａ 序列分析表 明克隆片段 的长度为 ５３０ｂｐ,其序列与报道序列相同⒚将该 Ｐ Ｅ Ｐ基因 片段反向插入 ｐ Ｉ Ｇ１２１ 质粒,构建了带 Ｐ Ｅ Ｐ 反义基因的超级双元载体并进行油菜的转化,目前已获得转基因植株⒚     

拟南芥ATLP-3基因在转基因烟草中的整合和表达

将拟南芥ＡＴＬＰ－３基因从质粒ｐＵＣＴＬ亚克隆到植物表达载体ｐＢＩ１２１中,得到了质粒命名为ｐＢＩＴＬ。被亚克隆到重组质粒ｐＢＩＴＬ的ＡＴＬＰ－３基因通过农杆菌ＬＢＡ４４０４介导法导入烟草（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔｏｂａｃｃｏ Ｌ．ｖａｒ Ｇｅｘｉｎ Ｎｏ．１）。通过卡那霉素抗性筛选,得到１９株再生烟划植株。ＰＣＲ（用根据ＣａＭＶ３５ｓ启动子和ＮＯＳ终止子序列合成的引物）分析表明,ＡＴＬＰ－基因是在     

猪生殖和呼吸综合征中国分离株ORF5基因的克隆及序列分析

本研究利用对应于ＰＲＲＳＶＡＴＣＣＶＲ－２３３２株及ＬＶ株ＯＲＦ５基因保守序列的１对均为２５个碱基的引物１００５ＰＳ、１００６ＰＲ对ＰＲＲＳＶ中国分离株Ｂ１３进行ＲＴ－ＰＣＲ,扩增出了包括完整ＯＲＦ５基因的ＤＮＡ片段,片段长约７３０ｂｐ。将此片段定向克隆入ｐＵＣ１８载体的ＥｃｏＲＩ和ｓｔＩ位点之间,获得了Ｂ１３ＯＲＦ５基因与ｐＵＣ１８载体的重组质粒。通过ＥｃｏｒＩ／ＰｓｔＩ、ＥｃｏｒＩ／ＨｉｎｄⅢ     

人胰岛素样生长因子-Ⅰ基因农杆菌工程菌株的构建

采用固相亚磷酸三酯法人工化学合成了人胰岛素样生长因子－Ⅰ（ｈｕＩＧＦ－Ｉ）基因的４条寡核苷酸 片段，再通过片段１、２与３、４末端互补配对和Ｋｌｅｎｏｗ酶促补平及酶切连接成为完整的ｈｕＩＧＦ－ＩＤＮＡ片段，用 ＥｃｏＲ　Ｉ／ＰｓｔＩ酶切后克隆于 ｐＧＥＭ Ｔ－Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ，经测序证明所得 ＤＮＡ序列与设计的序列完全一致；选用植物 偏爱密码子校正了启始密码子ＡＴＧ下游的６个密码子，并在ＡＴＧ处增加Ｋｏｚａｋ序列后，插入ｐＢＩ１２１的ＢａｍＨＩ／ ＳａｃＩ位点，构建了以 ３５Ｓ为启动子的植物表达载体；以 Ｈｉｎｄ ＩＩ／ＥｃｏＲＩ切下“３５Ｓ－Ｋｏｚａｋ－ＩＧＦ－Ｉ－ＮＯＳ（ｔｅｒ．）”插入 ｐＣＡＭＢＩＡ２３００之Ｈｉｎｄ ＩＩ／ＥｃｏＲ　Ｉ位点，构建成ｈｕＩＧＦ－Ｉ植物表达载体；通过ＣａＣｌ２直接转化法将表达载体导入农 杆菌ＥＨＡ１０５（Ｒｉｆ．ｒ），并以菌落原位杂交技术和 ＤＮＡ ｄｏｔ ｂｌｏｔ对重组农杆菌进行了筛选，所获得的重组农杆菌菌株为培育ｈｕＩＧＦ－Ｉ豆药用植物奠定了基础。     

乙肝表面抗原与促黄体激素释放激素的融合基因5''''端改造及其在大肠杆菌中的表达

应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）对畜型和禽型两个融合基因ＨＢｓＡｇ／ＬＨＲＨ的５′端分别作了改造，切去了融合基因起始密码ＡＴＧ前一段非编码序列６１个碱基，将改造后的融合基因插入ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｅ１１ＫＳ＋质粒中。琼脂糖凝胶电泳以及序列分析均表明改造和克隆成功。将改造后的融合基因克隆到含Ｔ７Ｐｒｏｍｏｔｅｒ强启动子的表达载体ｐＥＴ１５ｂ中，经异丙基硫代半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导，在Ｅ．ｃｏｌｉＤＥ３中表达，表达量占菌体总蛋白的１０％，以兔抗ＬＨＲＨ抗体进行Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ检测，出现阳性反应带。用抗ＨＢｓＡｇ抗体作ＥＬＩＳＡ检测，结果稀释１×１０－６时仍为阳性反应。     

尿激酶原基因cDNA在BHK21细胞中的表达

将人尿激酶原基因ｃＤＮＡ分别插入到真核表达载体ｐｃＤＮＡ３的ＣＭＶ启动子和ｐＳＶ２ｎｅｏ的ＳＶ４０启动子下游,构建了重组表达质粒ｐｃＤＮＡ３－ＵＫ和ｐＳＶ－２－ＵＫ分别将这两种表达质粒以脂质体载体法转染ＢＨＫ２１细胞。ＥＬＩＳＡ检测结果表明,ｐｃＤＮＡ３－ＵＫ和ｐＳＶ２－ＵＫ在哺乳动物细胞中能够表达,７２ｈ表达量分别为２８．７ｎｇ／ｍｌ和１３．５ｎｇ／ｍｌ。     

大麦黄矮病毒缺失复制酶基因植物表达载体的构建及转基因小麦的 …

以大麦黄矮病毒ＧＰＶ株系的ＲＮＡ为模板,采用反转录－聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）方法,扩增出１１３４ｂｐ的缺失复制酶基因。将扩增的片段克隆到ｐＵＣ１９的Ｓｍａｌ位点上并进行了序列测定,获得正向插入的重组质粒ｐＵＣ１９Ｄ。以Ｋｐｎｌ从Ｘｂａｌ从ｐＵＣ１９Ｄ上切下此基因并插入质粒ｐＥｍｕ－ｍｃｓ－Ｎ得到植物表达载体ｐＰＰＩ８。应用花粉管通道法转化普通小麦品种陇鉴１２７、陕１６０和晋麦４７,通过卡那酶     

尿激酶原基因cDNA在BHK21细胞中的表达

将人尿激酶原（Ｐｒｏ－ＵＫ）基因ｃＤＮＡ分别插入到真核表达载体ｐｃＤＮＡ３的ＣＭＶ启动子和ｐＳＶ２－ｎｅｏ的ＳＶ４０启动子下游,构建了重组表达质粒ｐｃＤＮＡ３－ＵＫ和ｐＳＶ２－ＵＫ,分别将这两种表达质粒以脂质体载体法转染ＢＨＫ２１细胞。ＥＬＩＳＡ检测结果表明,ｐｃＤＮＡ３－ＵＫ和ｐＳＶ２－ＵＫ在哺乳动物细胞中能够表达,７２ｈ表达量分别为２８．７ｎｇ／ｍｌ和１３．５ｎｇ／ｍｌ。     

乙肝表面抗原与促黄体激素释放激素的融合基因5‘端改造及其在大 …

应用聚全酶链反应（ＰＣＲ）对畜型和禽型两个融合基因ＨＢｓＡｇ／ＬＨＲＨ的５’端分别作了改造,切去了融合基因起始密码ＡＴＧ前一段非编码序列６１个碱基,将改造后的融合基因插入ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｅ １１ ＫＳ＾＋质粒中。琼脂糖凝胶电泳以及序列分析均表明改造和克隆成功。将改造后的融合基因克隆到含Ｔ７Ｐｒｏｍｏｔｅｒ强启动子的表达载体ｐＥＴ１５ｂ中,经异丙基硫代半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导,在Ｅ．ｃｏｌｉＤＥ     

花粉育性基因MS2的克隆与RNAi载体构建

［目的］研究MS2基因的功能。［方法］采用RT-PCR克隆棉花花粉育性（MS2）基因cDNA片段,将MS2反义基因、与陆地棉chinase基因第一个内含子和MS2正义基因3个片段串联在一起,经鉴定后,插入到植物表达载体中PBI121中。［结果］成功构建了MS2基因的RNAi载体p35S12MSIn。［结论］该载体的构建为棉花不育材料的遗传转化创造了条件。     

烟草花叶病毒移动蛋白基因转化烟草及在转基因烟草中的表达

根据烟草花叶病毒蚕豆株系（TMV-B）的已知序列合成引物，经PCR扩增获得TMV-B的移动蛋白（MP）基因。该基因测序验证后，分别以正、反向克隆到植物表达载体pBI121中，并置于CaMV35S启动子控制之下，通过三亲交配及叶盘转化，将MP基因导入烟草。经卡那霉素抗性筛选，PCR扩增，Southern点杂交,Northern点杂交及Westernblot检测，获得了正义表达MP基因及反义表达MP基因的转基因烟草，分别命名为pTMP（+）烟草和pTMP（-）烟草。     

尾叶桉U6 4CL基因cDNA克隆及反义表达载体的构建

[目的]为了获得桉树4-香豆酸:辅酶A连接酶(4CL)基因,构建植物反义表达载体,研究4CL基因对木质素的调控机理。[方法]从尾叶桉U6幼茎组织中提取总RNA,经RT-PCR扩增得到1.4 kb cDNA片段,将其克隆到质粒载体pGEM-T Easy。[结果]测序结果表明,该基因1413 bp,编码471个氨基酸。克隆片段经双酶切消化,反向插入到植物表达载体pBI121上,构建成4CL反义基因表达载体。通过冻融法将携带反义cDNA的植物表达载体质粒导转入根癌农杆菌EHA105,得到完整的Ti质粒表达载体系统。[结论]为该基因转化桉树的主栽品种尾叶桉U6以降低其木质素含量奠定了基础。     

草莓乙烯受体FaEtr2基因的克隆及其反义表达载体的构建

为了构建草莓乙烯受体FaEtr2基因的反义表达载体,在已报道的FaEtr2基因序列的基础上,设计特异引物,克隆草莓乙烯受体FaEtr2基因部分特异序列,将该片段反向插入植物表达载体pBI121的CaMV 35S启动子和NOS终止子之间,构建了反义表达载体pBI121Etr2。通过双酶切鉴定后,导入农杆菌EHA105中,酶切和PCR鉴定表明质粒已导入到农杆菌中。本研究为后期该反义基因转化草莓品种以改良草莓果实耐贮运性打下基础。     

雄性育性基因RNA干扰载体的构建与鉴定(英文)

cDNA fragment of fertility gene MS2 from cotton was cloned by RT-PCR approach, it was highly homologous with relevant genes of Brassica napus and Arabidopsis thaliana. According to the principles of constructing RNAi vector, sense and antisense fragments of MS2 gene carrying restriction endonuclease recognition sites were amplified via PCR technique, ligated with the first intron of upland cotton chinase gene, then inserted into artificially modified plant expression vector pBI121, yielding RNAi vector pBGP12MSIn. The results showed that RNAi vector pBGP12MSIn harboring MS2 gene driven by anther specific promoter BGP was successfully constructed. Our results laid a foundation for studying the function of this gene and genetic transformation of plant male sterile lines.     

番木瓜PL和β-Gal基因双价反义表达载体的构建

在已报道的番木瓜果胶裂解酶(PL)和β-半乳糖苷酶(β-Gal)基因序列的基础上,设计特异引物,分别扩增保守区序列,将其分别反向插入植物表达载体pCAMB IA1301-35S-GUS-Nos的CaMV35S启动子和Nos终止子之间,构建反义表达载体pCP和pCG.然后用2种不同的方法将带有完整启动子和终止子的PL和-βGal基因引入pCAMB IA2301中,获得PL和β-Gal基因的双价植物反义表达载体pCPG,并对2种方法进行比较.     

草莓PLDα基因cDNA克隆及反义植物表达载体构建

【目的】获得草莓磷脂酶Dα(PLDα)的HKD2功能区基因序列构建反义植物表达载体。研究PLDα基因对草莓果实耐贮性的影响。【方法】以草莓完熟果实为材料提取总RNA,利用RT-PCR技术扩增得到PLDα基因的cDNA片段,将其T-A克隆至pMD19-T simple vector上,测序正确后克隆载体经双酶切消化,目的片断反向插入到植物表达载体pBI121中。【结果】构建草莓PLDα基因的反义植物表达载体pBI121-PLD。【结论】通过冻融法将携带反义cDNA的植物表达载体质粒导入根癌农杆菌LBA44404,为进一步通过反义技术延长草莓果实贮藏的寿命奠定了基础。     

薄皮甜瓜果实ACC合成酶cDNA克隆及反义表达载体的构建

从成熟的薄皮甜瓜(Cucumis melo cv.Qitian I)果肉组织中分离总RNA,经RT-PCR扩增得到0.7 kb的cDNA片段,将其克隆到质粒载体pGEM-T Easy。测序表明,该基因为777 bp,编码258个氨基酸,与Gen-Bank中甜瓜1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶(1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase,ACS)基因比对,核苷酸同源性为99%,氨基酸同源性为98%。克隆片段经双酶切消化,反向插入到植物表达载体pCAM2301的E8启动子和NOS终止子之间,构建成E8调控下ACS基因反义表达载体。通过冻融法将携带反义cDNA的植物表达载体质粒转入根癌农杆菌LBA4404,得到了完整的Ti质粒表达载体系统。     

水稻SLR1基因的克隆及其植物表达载体的构建

[目的]为研究水稻中的SLR1蛋白的功能及寻找与其相互作用的GA信号转导蛋白奠定基础。[方法]以水稻品种日本晴基因组DNA为模板,根据水稻SLR1基因cDNA序列设计1对特异引物进行PCR扩增,回收PCR产物连接到pGEMT载体中,经筛选得到水稻SLR1基因的克隆pGEMTSLR。最后采用酚仿抽提和乙醇沉淀的方法构建水稻SLR1基因的正义和反义表达载体。[结果]通过PCR扩增获得了约为1.9kb的特异片段。回收PCR产物,将克隆片段和pGEMT载体连接后转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞,重组克隆经酶切鉴定后提取重组质粒pGEMTSLR1。该研究成功构建了SLR1基因的正义表达载体pCAMSLR(约0.7kb)和反义表达载体pCAMASLR(约1.2kb)。[结论]采用冻溶法可将表达载体pCAMSLR和pCAMASLR导入农杆菌并进行水稻的遗传转化。利用SLR1基因的正义和反义表达载体,可观察转基因植株中该基因的表达上调和下调对植物的影响。