变铅青链霉菌DNA的研究——Ⅱ.位点特异性降解与DNA修饰的关系

变铅青链霉菌的DNA上存在着一种异常的修饰,使其在含有微量Fe~(++)的缓冲液中电泳时,双链DNA遭到降解。DNA的切割是位点特异性的。与已知修饰特征的DNA进行同步试验发现,变铅青链霉菌的这种特异性修饰与目前所发现的修饰系统(如DNA甲基化)均不相同,很可能是一种新的修饰系统。     

链霉菌高拷贝质粒pIJ101DNA的研究 Ⅲ.在变铅青链霉菌中的启动子活性

链霉菌高拷贝质粒pIJ101上的两个片段(1.18kb和0.54kb)在大肠杆菌中具有明显的启动子活性。把这两个片段克隆到链霉菌启动子探针载体pIJ424和pIJ425(修饰了克隆位点)上,转化到变铅青链霉菌中,然后用梯度平板测定转化子对卡那霉素的抗性水平发现:在变铅青链霉菌中,1.18kb的片段在两个方向都有启动子活性,而0.54kb的片段则明显没有。     

拮抗链霉菌AFLP分析技术体系的研究

[目的]探索基于AFLP的拮抗链霉菌DNA模板制备方法及其扩增体系,为AFLP技术在链霉菌乃至放线菌资源分析中的应用提供依据。[方法]以改进的CTAB法提取DNA,利用Pst I／Mse I型AFLP试剂盒及其反应体系进行扩增,采用5％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析扩增结果。[结果]提取了10个拮抗链霉菌菌株的基因组DNA,0.8％琼脂糖凝胶电泳检测显示其主带清晰,片段大小为37.64-40.86Kb,无降解现象,亦无RNA残留;其OD260/OD280为1.625-1.833;Pst I／Mse I双酶切产物琼脂糖电泳呈弥散荧光长带,说明酶解充分;筛选出的3对引物对DNA模板的扩增谱带清晰,多态性丰富。[结论]该研究建立的DNA模板制备方法及其扩增反应体系可用于链霉菌的AFLP分析。     

纤维素降解过程中链霉菌菌体及其碱提取物组分研究

针对链霉菌降解纤维素后是否能形成腐殖质及其碱提取物组分是否为腐殖质组分这一微生物利用问题,采用液体摇床振荡培养实验,获得链霉菌降解纤维素形成的菌体,利用元素组成、差热分析和红外光谱法等现代仪器分析手段,初步研究了菌体的化学结构和碱提取物组分碳的分配状况。结果表明:随着培养时间的延长,培养后期(60 d)的链霉菌菌体产率显著增加;链霉菌菌体在化学结构上相似,与黑土胡敏酸(HA)相比,菌体的结晶度较低,芳香性较弱,热稳定性较强,脂肪碳链和含氧官能团含量较高;链霉菌经纤维素作用后形成的菌体,与黑土碱提取物(胡敏酸、富里酸)相比,"水溶性组分"较多,"碱溶组分"(类似于胡敏酸和富里酸的总和)较少,富含"碱溶酸不溶组分(类似于胡敏酸)"的物质增多,"水溶性组分"和"碱溶酸不溶组分"与纤维素和链霉菌的共同作用有关。以上结果表明,纤维素培养过程中链霉菌菌体与真正的黑土胡敏酸(HA)是有差别的。     

链霉菌高拷贝质粒pIJ101DNA的研究 I．在大肠杆菌中的启动子活性

用大肠杆菌座子与Tn5个去除了自身启动子区域的卡那霉素抗性基因（neo)作为指标标记来探测广寄主、高拷贝的链霉菌质粒pIJ101上DNA的启动子活性所做的基因融合试验揭示，pIJ101上至少有两个可大大肠杆菌中行使启动子功能的DNA片段。基因融合后所产生的杂合质粒能够赋予大肠杆菌ED8767较高的卡那霉素抗性。对含质粒菌株在液体培养基中的生长动力学分析揭示，这种菌株在从无药物向有药物的生物环境中过渡时，生长并不受到暂时的抑制。说明这种启动子活性不是pIJ101DNA上DNA的突变所引起。用大肠杆菌的启动子探针载体pKK232-8所做的体外亚克隆试验更进一步证实了这项观察，并把两个启动子功能区分别缩小到0．54kb和1．18kb的范围内。这项试验成功地组建了质粒pIJ101亚克隆库，便于对这个重要的链霉菌质粒进行精细的分子生物学研究。     

链霉菌高拷贝质粒pIJ101 DNA的研究 Ⅳ.BclI-E片段上启动子的定位

将链霉菌高拷贝质粒pIJ101上具有明显启动子活性的BclI—E片段(1.18kb)用MboI酶切后克隆到链霉菌启动子探针载体pIJ425中所做的试验证明,当把这个片段的末端去掉以后,中间的两个次级片段(0.63kb和0.68kb)比完整的BclI—E片段具有更强的(4～6倍)激活指标基因neo表达的能力.Southern印迹杂交试验证明这两个片段均来自于pIJ101的BclI—E片段.这项试验不仅大大缩小了BclI—E片段上的启动子活性区域,而且说明BclI—E片段末端有转录终止子的存在.     

链霉菌的分子育种研究进展

大多数抗生素均是由链霉菌产生的,但随着抗生素的高剂量大面积使用,抗生素的使用寿命也随之缩短,从而使得快速选育高产量、产新抗生素的链霉菌显得尤其重要。随着基因工程技术和分子生物学手段的不断发展以及对微生物次生代谢机制的进一步了解,链霉菌的选育已由原来随机诱变筛选进入到分子育种。综述了链霉菌在提高抗生素产量和产生新抗生素方面的分子育种进展。     

泾阳链霉菌代谢产物生物活性研究

对泾阳链霉菌(Streptomyces jingyangensis)代谢产物的生物活性进行了研究.考察了泾阳链霉菌的发酵液和菌丝体对小麦发芽、生长的影响,及对土壤固氮、解磷、解钾性能和有机质含量的影响.试验结果表明,泾阳链霉菌发酵液对小麦发芽有一定的抑制作用,对小麦生长有较强的促进作用;菌丝体对小麦发芽和生长均有一定的促进作用;发酵液和菌丝体处理后,小麦呼吸强度均较强;发酵液和菌丝体均有一定的固氮、解钾、解磷作用;经发酵液和菌丝体能使土壤有机质含量提高,增加土壤的肥力.     

羽毛降解杆状链霉菌S-28遗传转化系统的建立与优化

【目的】建立羽毛降解杆状链霉菌(Streptomyces bacillaris)S-28的遗传转化系统,并对其进行优化,为该菌株的遗传改造奠定基础。【方法】以大肠杆菌-链霉菌穿梭整合型质粒pSET152为出发质粒,大肠杆菌(Escherichia coli)S17-1/pSET152为供体,羽毛降解杆状链霉菌S-28孢子为受体进行接合转移试验,并对影响接合效率的培养基种类、MgCl_2浓度、热激温度、预萌发时间、供受体比例和接合转移时间等要素进行优化。【结果】确定筛选羽毛降解杆状链霉菌S-28菌株接合转化子的抗生素为安普霉素≥10μg/mL或卡那霉素≥20μg/mL;成功将pSET152转入到杆状链霉菌S-28中。优化的S-28菌株接合转移条件为:以MS为接合转移最适培养基,MgCl_2浓度为10mmol/L,孢子萌发条件为40℃热激10min且不进行预萌发处理,供受体比例为10∶1,接合转移时间18~20h,此条件下接合转化效率最高达到10-4。【结论】建立并优化了羽毛降解杆状链霉菌S-28的遗传转化系统,接合转化效率最高可达到10~(-4)。     

链霉菌分解角蛋白的生化机制研究：Ⅱ角蛋白分解过程中含硫化？…

弗氏链霉菌Ｓ－２２１变种在分解利用羽毛角蛋白过程中产生角蛋白酶,使角蛋白不断地降低解成多肽或游离氨基酸的同时,角蛋白中的硫也随之转移成巯基化合物,Ｈ２Ｓ和硫酸盐３种含硫化合物形式存在于分解产物中,并对３种含硫化合物形成过程进行了初步探讨。     

拮抗链霉菌No.24菌株发酵条件优化研究

对1株拮抗链霉菌No.24菌株的发酵条件进行了初步研究,确定了其最佳培养基组成及培养条件。单因素发酵试验和正交试验结果表明,碳源以30g/L葡萄糖和30g/L小米最佳,有机氮源以10g/L黄豆饼粉最好,无机氮源以2g/L(NH4)2SO4最好,最适发酵时间为96h,最适发酵培养温度为32℃,最适初始pH值为7.2～7.4,最佳振荡频率为210r/min,装液量为40mL/250mL。     

链霉菌XW5的发酵条件研究

对链霉菌XW5的液体发酵条件进行了单因素研究,通过正交试验设计对该菌株的培养基进行了筛选,同时对发酵代谢进行调节控制。结果表明,该菌株产素的最适发酵条件为:2%淀粉,1.5%黄豆饼粉,0.05%K2HPO40.05%MgSO40.4%CaCO3。NH42SO4对发酵液的效价有较明显的促进作用。     

变铅青链霉菌66多效性突变子的遗传分析

ＺＸ１和ＺＸ７是变铅青链霉菌ＪＴ４６经ＮＴＧ诱变所产生的多效性突变菌株。进一步的研究证明，它们表达黑色素基因能力的降低与异常修饰这两种不同的遗传表型是不同基因作用的结果。将天蓝色链霉菌中控制产孢的关键基因ｗｈｉＧ引入ＺＸ１并不能恢复或互补ＺＸ１产孢差的性状。ＺＸ１的ＤＮＡ经脉冲电泳也不补降解。脉冲电泳和基因文库杂交的结果均证明ＺＸ１发生大片段缺失。     

阿维链霉菌BAC文库的构建及分析

为进一步阐明阿维菌素的生物合成路径和调控途径,提高阿维菌素的产量,采用BamHⅠ限制性内切酶酶解阿维链霉菌基因组DNA的方法,构建了阿维链霉菌的细菌人工染色体(BAC)文库。该文库共包含2 304个克隆,平均插入片段为101kb,空载率约9%,覆盖了该菌基因组的25.9倍。该文库的成功构建可以为其他微生物尤其是基因组具有磷硫酰化修饰的微生物的文库构建提供参考。     

链霉菌9911发酵条件的研究

对链霉菌9911的发酵条件进行了研究。通过发酵条件的优化,最后确定较适培养条件为:2%接种量,20%装液量,培养144h;培养基较优组合为:A1B2C3D1,即葡萄糖为1.5%,豆饼粉为3.0%,碳酸钙为0.6%,pH值为6.0。在该条件下,链霉菌对病原菌抑菌圈直径可达32 mm,较优化前提高了23%。     

阿维链霉菌原生质体制备方法的研究

对阿维链霉菌原生质体制备进行了研究,结果表明:阿维链霉菌原生质体制备的最佳条件为在35 mL含0.5%甘氨酸的YEME培养基中接种孢子悬液,28℃、200 r/min培养40 h;3 000 r/min收集菌丝体,用10.3%蔗糖溶液清洗2次;溶菌酶浓度为4mg/mL的P缓冲液悬浮菌丝体,30℃下处理50 min完成原生质体制备。以50%PEG1000为促融剂,原生质体融合率最高。