禽呼肠病毒套式RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中登录的禽呼肠病毒(ARV)基因组序列,设计合成了2对引物,外部引物的扩增片段大小为478 bp,内部引物的扩增片段大小为247 bp,建立了适合ARV快速检测的套式RT-PCR方法(RT-nested-PCR).采用该方法对REV毒株进行了检测,均能扩增到247 bp的条带,而禽流感病毒(H9亚型)...     

单管套式PCR检测外源性禽白血病病毒

从贵州省4个养鸡场采集出现肿瘤病变或疑似肿瘤病料样本17份,以单管套式PCR方法检测禽白血病病毒长末端重复序列(LTR),15份病料均扩增出一条213 bp的DNA带,与预期扩增长度相符合,外源性禽白血病病毒的检出率达到88.2%.同时针对禽白血病病毒的囊膜糖蛋白基因(gp85)进行PCR扩增,在被检的17份病料中,7份检出J亚群特异性的DNA带(545 bp),占41.1%;9份检出A亚群特异性的DNA带(691 bp),占52.9%;其中2份病料同时检出J亚群与A亚群特异性的病原核酸.A、J亚群的PCR检出率低于LTR的套式PCR扩增.     

禽白血病J亚群病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

本研究旨在通过荧光定量PCR方法研究禽白血病J亚群病毒(ALV-J)在家禽体内各个器官的分布。根据ALV-J NX0101毒株基因5 258—5 510bp的碱基序列,设计了1对特异性引物,进行RT-PCR反应,扩增产物为253bp,将该产物连接T载体作为Real-time PCR反应的标准品,利用SYBR Green I染料进行Real-time PCR反应,建立了标准曲线,并进行反应灵敏性,特异性和重复性试验。然后用已建立的方法对人工感染ALV-J的SPF鸡心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胸腺、法氏囊、腺胃进行3次重复检测,将Ct值带入标准曲线公式得出各个组织的病毒拷贝数。试验结果表明:标准曲线线性关系R值均为0.991 4,检测极限约为81拷贝质粒DNA,比RT-PCR灵敏100倍以上;特异性分析表明只有ALV-J能检测到特异性的熔解度峰值;批内和批间重复性试验的变异系数均小于5%。通过比较数值以得出胸腺ALV-J基因含量是最高的,肺脏、脾脏、法氏囊含量也比较高,心脏拷贝数最低。自然感染发病鸡各器官ALV-J基因均高于人工感染ALV-J的基因含量。本研究所建立的ALV-J基因实时荧光定量RT-PCR方法灵敏度高、特异性强、检测周期短,初步探讨了禽白血病J亚群病毒在畜禽体内各个器官的病毒分布。这为以后禽白血病的诊断以及治疗提供了重要的技术支持。     

禽网状内皮组织增生病病毒套式PCR检测方法的建立

根据GenBank中登录的禽网状内皮组织增生病病毒(REV)基因组序列,设计合成了2对引物,外部引物的扩增片段大小为467 bp,内部引物的扩增片段大小为314 bp,建立了适合REV快速检测的套式PCR方法。采用该方法对REV毒株进行了检测,结果显示能扩增到314 bp的条带;禽流感病毒(H9亚型)、新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、减蛋综合征病毒、禽白血病病毒、禽呼肠孤病毒、马立克氏病病毒的扩增结果均为阴性。该方法第1次扩增的敏感性是100 pg,第2次扩增的敏感性是1 fg,第2次比第1次扩增的敏感性高105倍。所建立的套式PCR方法具有敏感性高、重复性好、特异性强等优点,可用于禽网状内皮组织增生病的临床诊断和分子流行病学调查。     

B亚型禽偏肺病毒逆转录套式PCR检测方法的建立与应用

根据GenBank发布的B亚型禽偏肺病毒Fusion(F)基因的保守序列设计2对引物,建立了一种适用于B亚型禽偏肺病毒的逆转录套式PCR检测方法.采用该方法对B亚型禽偏肺病毒山东分离株进行检测,可以特异性地扩增出415 bp的目的片段.此方法具有高度特异性和敏感性,以H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒作为模板进行扩增,结果均为阴性.经检测,该方法第1次PCR扩增的敏感性为102 copies/μL,第2次扩增的敏感性为102 copies/μL,第2次扩增敏感性比第1次高105倍.应用本方法对采自山东省不同地区的64份可疑临床病料进行检测,最终从64份疑似病料中检测出37份为阳性.结果表明,所建立的套式PCR检测方法具有特异、敏感、实用等优点,为B亚型禽偏肺病毒的快速诊断以及深入研究奠定了基础.     

鸡传染性贫血病毒套式PCR检测方法的建立

本试验根据GenBank中登录的禽传染性贫血病毒(CAV)基因序列,设计合成2对引物,外引物的扩增片段大小为485 bp,内引物的扩增片段大小为297 bp,建立了适合CAV快速检测的套式PCR方法(nested PCR),并采用该方法对CAV阳性毒株及临床病料进行了检测。结果显示,该方法能扩增到297 bp的条带,禽流感病毒(H9亚型)、新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、禽网状内皮增生病病毒、减蛋综合征病毒、禽呼肠孤病毒、马立克氏病病毒的扩增结果均为阴性。该方法第1步扩增的敏感性是100 pg,第2步PCR扩增的敏感性是1 fg,敏感性提高了10⁵倍。本研究建立的CAV套式PCR方法具有敏感性高、重复性好、特异性强等优点,可用于CAV的临床诊断和分子流行病学调查等。     

F亚群禽白血病病毒SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立

为建立检测F亚群禽白血病病毒(ALV-F)的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法,本研究以ALV-F分离株FGD1803基因组为模板,PCR扩增其env基因,构建重组质粒pMD18-T-F作为标准品.利用该重组质粒建立了 SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法(qPCR)的标准曲线,并经反应条件优化建立了检测...     

Ⅰ群禽腺病毒套式PCR检测方法的建立与应用

本研究根据GenBank发表的Ⅰ群禽腺病毒(Fowl adenovirus,FAdV)基因序列,设计了2对通用检测引物,通过反应体系和条件优化,建立了Ⅰ群禽腺病毒套式PCR检测方法。通过灵敏性检测、特异性试验以及对临床病料中FAdV检测验证实用性与可靠性。建立的套式PCR检测方法灵敏度为3.12×10-6 ng/μL;特异性试验证实该方法仅能从FAdV参考阳性株扩增出750 bp的预期目的条带,其他5种常见禽病毒均为阴性。结果表明,本研究成功建立了一种灵敏度高、特异性好的检测Ⅰ群禽腺病毒通用套式PCR方法,为临床FAdV感染的快速准确诊断提供了技术手段。     

禽白血病病毒B、E和J亚群基因芯片检测方法的建立

目的基于多重PCR技术,建立禽白血病病毒(ALV)的B、E、J亚群的基因芯片分型和检测方法。方法根据NCBI已收录的ALV三个亚群的参考毒株cDNA序列,在各亚群特异性基因突变区两端选取其保守区域,设计合成三个亚群的通用上游引物1条,以及B、E亚群的通用下游引物和J亚群下游引物各1条,将上述引物用Cy3标记,建立多重PCR体系;参考靶序列内部的三个亚群各自的保守区域,选择亚群之间基因突变位点多的区域,设计合成5条寡核苷酸探针,制作寡核苷酸探针基因检测芯片;以寄主细胞DF-1中提取传代ALV的cDNA,以及合成NCBI收录的各亚群参考毒株的cDNA序列作为检测模板;利用Cy3标记的PCR扩增产物,与基因芯片进行杂交反应,扫描结果。结果芯片准确检测并分型三个亚群的参考毒株,其检测灵敏度能够达到102个基因拷贝,且与禽类常见的四种病毒均无交叉反应。结论本研究结果证明,基因芯片技术是一种ALV的B、E和J亚群进行检测和分型的有效方法,且具有较高的特异性和灵敏度,为今后在临床应用中快速鉴别诊断ALV等免疫抑制病提供可行性。     

巢式PCR检测H1亚型禽流感病毒方法的建立

为建立快速、准确检测H1亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)的方法,本研究针对H1亚型AIV血凝素(HA)基因保守区设计合成了2对特异性引物并优化反应条件进行巢式PCR反应。特异性和敏感性试验结果表明,该PCR方法能特异性检测到H1亚型AIV,其敏感性最低能检测到13.2 fg/μL的H1亚型AIV RNA模板。本研究建立的巢式PCR方法为H1亚型AIV的早期诊断及有效防制提供了快速、特异且敏感的检测方法。     

鸡ALV-J特异性转移因子的制备与检测

J型禽白血病病毒(ALV-J)攻毒1日龄SPF鸡,2个月后取脾脏。用透析法提取特异性转移因子(STF),经检验:STF蛋白反应呈阴性,OD260/OD280为2.38,原液中含有17种氨基酸。生物学检测后结果表明:STF无菌、无过敏性、无毒性。试验组小白鼠口服STF后,腹腔巨噬细胞吞噬红细胞的百分率和吞噬指数都比对照组有显著提高(P<0.05)。     

H4亚型禽流感病毒套式RT-PCR检测方法的建立

旨在建立一种快速、准确检测H4亚型禽流感病毒(AIV)的方法,针对H4亚型AIV HA基因保守序列,设计并筛选出2对特异性引物,通过优化反应条件,建立了H4亚型AIV套式RT-PCR检测方法。特异性试验结果显示,该法可特异性检测出H4亚型AIV,对其他常见禽病病原体无交叉;敏感性试验结果显示,该法对H4亚型AIV检测下限为360fg/μL;用该法对106份临床样品进行检测,临床样品检测结果与病毒分离结果一致。本研究建立的套式RT-PCR方法为H4亚型AIV的早期诊断及有效防控提供了快速、特异和敏感的检测方法。     

鸭圆环病毒套式PCR检测方法的建立

根据GenBank发布的鸭圆环病毒(duck circovirus,DuCV)序列(AY228555),运用Primer Premier 5.0设计2对引物,建立了适合DuCV快速检测的套式PCR方法,采用该方法对从安徽省望江县采集的发病鸭肝脏、胸腺、法氏囊、肾脏和脾脏等内脏病料进行DuCV检测。结果显示,套式PCR对所有内脏病料均能扩增出340 bp的条带,而正常鸭胚、健康鸭肝脏、鸭瘟病毒、禽流感病毒(H9亚型)、新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、网状内皮组织增生病毒、鸡传染性贫血病毒、鸭源大肠杆菌和鸭疫里氏杆菌的扩增结果均为阴性;该方法第1次扩增的敏感性是1 ng,第2次扩增的敏感性是1 fg,第2次比第1次扩增的敏感性高106倍;表明本试验所建立的套式PCR方法可用于鸭圆环病毒(DuCV)感染的临床诊断和流行病学调查。     

H3亚型禽流感病毒巢式PCR检测方法的建立

为建立一种H3亚型禽流感病毒(AIV)的检测方法,本研究针对H3亚型AIV HA基因保守序列,设计并筛选出2对特异性引物,通过优化反应条件,建立了H3亚型AIV巢式PCR检测方法。对该法进行特异性和敏感性检验,并用该法对96份临床样品进行检测。特异性试验结果表明该法只能检测到H3亚型AIV,对其他常见禽病病原体不扩增;敏感性试验结果表明该巢式PCR对H3亚型AIV检测下限为1×10³拷贝/μL,灵敏度比常规PCR高100倍;96份临床样品检测结果与病毒分离结果一致。本研究所建立的巢式PCR为H3亚型AIV的诊断提供了一种准确、有效的检测方法。     

Development of a Duplex PCR Assay for Detection of Avian Influenza Virus and Chicken Parvovirus

In order to establish a method to simultaneously detect avian influenza virus (AIV) and chicken parvovirus (ChPV),two pairs of specific primers were designed according to the sequences of AIV M gene and ChPV NS gene in GenBank. The duplex PCR assay was established by optimizing the reaction conditions.The tests showed that this method had high specificity, could simultaneously detect AIV and ChPV and no specific band was amplified for other subtypes avian pathogenic virus. The sensitivity result showed that the lower detection limit of this method was 100 fg. The results of 159 clinical samples were consistent with the sequencing results of PCR positive product. The double PCR methods for detection of AIV and ChPV established in this study had the characteristics of good specificity and high sensitivity, which was of great significance to the prevention control of AIV and ChPV.     

禽流感病毒与鸡细小病毒二重PCR检测方法的建立

为建立一种能同时鉴别诊断禽流感病毒（avian influenza virus,AIV）和鸡细小病毒（chicken parvovirus,ChPV）的检测方法,本研究根据GenBank中AIV的M基因和ChPV的NS基因保守序列,分别设计并筛选出两对特异性引物,用于AIV和ChPV的检测。通过优化反应条件,建立了AIV和ChPV二重PCR检测方法。试验结果表明,该方法特异好,能同时检测AIV和ChPV,对其他常见的禽病病原体均未反应;该法对AIV和ChPV的检测下限均为100 fg;对159份临床样品检测结果与PCR阳性产物测序结果一致。本研究建立的AIV和ChPV二重PCR检测方法具有特异性好、灵敏度高的特点,对AIV和ChPV的防制具有重要意义。     

鸡感染J亚群禽白血病病毒的免疫抑制机理

通过人工接种建立了雏鸡感染J亚群禽白血病病毒（ALV-J）后发生免疫抑制的病理模型。对免疫抑制的机理进行了初步研究。结果表明：ALV-J感染早期可诱导胸腺、法氏囊的淋巴细胞凋亡，这种早期的淋巴细胞凋亡是胸腺和法氏囊萎缩的重要原因之一。病理组织学动态观察表明。ALV-J主要引起骨髓的髓系细胞灶状或弥漫性增生，病变导致骨髓机能受损，使机体免疫机能下降。是引起免疫抑制的根本原因。病毒感染组免疫器官均发生了严重的实质萎缩性病变．这种病变的发生除与骨髓的病变及淋巴细胞凋亡有关外。还与中后期淋巴细胞的坏死有关．从而导致严重的免疫抑制。ALV-J感染可引起免疫器官及部分内脏器官中嗜酸性粒细胞样的瘤细胞浸润增生，这可以作为病毒感染早期的病理诊断指标。